Este trabajo contó con el apoyo de la Iniciativa Líder para Jóvenes Investigadores Excelentes (del MEXT); una Beca de Ayuda a la Investigación Científica (B) (Subvención número JP21H02352); Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médicos (AMED-RPIME, número de subvención JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); la Fundación Conmemorativa de Uehara; Fundación Astellas para la Investigación de Trastornos Metabólicos; Fundación Suzuken Memorial, Fundación de Ciencias de la Vida Akiyama y Fundación de Investigación de Neurociencia Narishige. También agradecemos a Nur Farehan Asgar, Ph.D, por editar un borrador de este manuscrito.

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Kumamoto.
NOTA: Para aliviar el dolor, se administró ibuprofeno en agua potable (0,11 mg/ml) durante 48 h, y buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg i.p.) 30 min antes de la cirugía. Las condiciones estériles incluyen guantes, máscaras e instrumentos esterilizados en autoclave con óxido de etileno entre animales. La cirugía se realizó en una almohadilla térmica ajustada a 37 °C y cubierta por una nueva alfombra de laboratorio para cada animal. Antes de la cirugía, el área quirúrgica se limpió con una solución de betadine y alcohol. Todos los instrumentos quirúrgicos fueron esterilizados con un autoclave (para no más de dos cirugías). Antes de hacer la incisión, se revisó a los ratones para asegurarse de que estuvieran completamente anestesiados. La profundidad de la anestesia para cada ratón se evaluó antes y durante la cirugía mediante un pellizco en el dedo del pie. El período de aclimatación no fue más de 5 minutos cada vez. Siga las instrucciones de la IACUC en la institución respectiva.
1. Preparación de tubos para la vena yugular y la arteria carótida
<ol><li>Esterilice todos los tubos, suministros de polipropileno (p. ej., puntas de pipeta) y suturas con un autoclave u óxido de etileno. Para la vena yugular, conecte 8 cm de tubo1 (ver Materiales) y 3 cm de tubo2 con pegamento (Figura 2A). Coloque 2 mm de tubo1 en la parte superior, ya que el tubo 2 (polietileno) es demasiado duro y puede dañar los vasos sanguíneos (tubo1.1).</li>
	<li>Tubo de extensión para la vena yugular (Tubing1.2) para infundir glucosa e insulina<ol><li>Prepare dos tubos de 30 cm y un tubo de 10 cm con tubo2 (Figura 2A). Corte el extremo afilado de una punta de pipeta de 20 μL (o cualquier cosa que tenga un extremo de punta estrecho con un diámetro exterior de < 0,5 mm para conectar con el tubo 1.1) y coloque tres tubos2 (30 cm, 30 cm y 10 cm) juntos en él. Selle con pegamento adhesivo.</li>
		<li>Coloque 5 cm de tubo1 en el otro extremo del tubo2.</li>
	</ol></li>
	<li>Para la arteria carótida (tubería1.3): Estire la tubería2 para hacerla más delgada. Conecte 8 cm de tubería1 y 3 cm de tubería estirada2 con pegamento (Figura 2A). Haz una marca a 9 mm de la punta.</li>
	<li>Aguja con extremo no afilado que conecta el tubo a la jeringa: Haga un rasguño cerca del extremo afilado de la aguja (23 G) con una lima de metal, dóblela suavemente hacia adelante y hacia atrás unas cuantas veces con unos alicates y rómpela. Haga el mismo corte en el medio de la aguja para hacer un trozo de conector de metal (Figura 2A).</li>
	<li>Tubo de extensión para la extracción de sangre de la arteria (Juego de tubos 1.4): Conecte 10 cm de tubo1 con el conector metálico y la aguja no afilada que se fabricó en el paso 1.4. NOTA: Todos los tubos y suturas se esterilizan con un autoclave u óxido de etileno</li>
</ol>2. Cirugía
<ol><li>Anestesiar a un ratón con isoflurano (1,5-2,0%) o ketamina/xilacina (ketamina 10 mg/mL, xilacina 1 mg/mL en solución salina estéril al 0,9%, 0,1 mL/10 g de peso corporal (PC) mediante inyección intraperitoneal [ip]). Mantenga el ratón sobre la almohadilla caliente (37 °C) para reducir el estrés físico. Espere la anestesia profunda durante 5-10 minutos. Confirme la profundidad de la anestesia mediante el reflejo pedal, la respiración y la frecuencia cardíaca, y la respuesta a los estímulos mediante el pellizco de los dedos de los pies. Durante la cirugía, se debe usar cinta quirúrgica para asegurar la tapa de la nariz a la mesa de operaciones para la inhalación continua de la anestesia. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.</li>
	<li>Llene solución salina heparinizada (100 U/mL) en los tubos 1.1 y 1.3 y conéctelos con una jeringa de 1 mL con una aguja no afilada (Figura 2B). Cierre el extremo de la tubería3 (consulte la Tabla de materiales) fundiéndola con un soldador, que se utilizará como tapas para la tubería1.1 y la tubería1.3.</li>
	<li>Afeitar y limpiar la primera (interescapular en la espalda) y la segunda (cuello en la parte delantera) de la incisión con tres ciclos de betadine al 10% seguidos de una preparación preoperatoria con alcohol estéril al 70%. Realizar una pequeña incisión vertical en la línea media cefálica de 5 mm al esternón, diseccionar los tejidos sin fondo y exponer la arteria. Separa el nervio vago de la arteria. Esto reduce los efectos negativos de la eliminación del nervio vago en el metabolismo de la glucosa. NOTA: El paso desde la incisión ventral hasta el paso donde se inserta el catéter en la vena y se asegura con suturas de seda se realiza bajo un microscopio.</li>
	<li>Coloque dos suturas de seda debajo de la arteria. Detenga el flujo sanguíneo atando una sutura firmemente en el lado craneal (Figura 2C-1) y la otra sin apretar en el lado caudal (Figura 2C-2), lo cual es suficiente para detener el flujo sanguíneo pero suficiente para volver a abrirse más tarde. Coloque una sutura más debajo de la arteria (Figura 2C-3).</li>
	<li>Corte la arteria cerca de la Figura 2C-1 con unas tijeras de resorte y coloque el tubo 1.3 en la arteria. Haga un lazo suelto tanto en la arteria como en el tubo (Figura 2C-3, no lo ate firmemente. El tubo se insertará más profundamente en la arteria). Abra el nudo en el lado caudal (Figura 2C-2) para insertar el tubo hasta que la marca de 9 mm llegue al nudo en el medio (Figura 2C-3). Amarre firmemente todas las ligaduras y enjuague con solución salina estéril heparinizada.</li>
	<li>Exponga la vena yugular derecha desde la misma incisión que la arteria carótida derecha para el catéter yugular. Aislar el extremo craneal y ligarlo con sutura de seda (Figura 2D-1, Tabla de materiales). Coloque otro trozo de sutura en el extremo caudal de la vena expuesta (Figura 2D-2). Corte la vena cerca de la marca Figura 2D-1 con unas tijeras de resorte.</li>
	<li>Inserte el catéter (no demasiado profundo para evitar que penetre en los vasos), átelo y confirme visualmente que toma muestras de sangre. Enjuague con solución salina estéril heparinizada (0,2 ml) y confirme visualmente que no quede sangre en el catéter.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre el nuevo paño quirúrgico estéril para evitar la infección de la primera herida. Dar la vuelta al ratón, limpiar con tres ciclos de betadine seguidos de una preparación preoperatoria con alcohol estéril y hacer una pequeña incisión entre los omóplatos.</li>
	<li>Pase un portaagujas por debajo de la piel desde la incisión en la espalda hasta el lado ventral. Pinza los catéteres con el portaagujas, páselos por debajo de la piel y llévelos de vuelta. Limpie el sitio de la incisión y cierre las incisiones ventrales con una sutura sintética (diámetro 0,15-0,2 mm). Pinza el catéter venoso con micro serrefine en el sitio de la incisión entre los omóplatos.</li>
	<li>Cortar el catéter 1 cm por encima de la pinza, enjuagarlo con solución salina heparinizada y cerrarlo con un tapón (paso 2.4). Siga el mismo procedimiento para el catéter arterial. Cerrar la incisión dorsal con una sutura sintética (diámetro 0,15-0,2 mm).</li>
	<li>Coloque el ratón en una jaula cálida y limpia (Figura 2E). Realizar diariamente los cuidados postoperatorios.</li>
</ol>3. Recuperación
<ol><li>Coloque una sola casa para el ratón porque otro ratón puede morder el catéter en la carcasa del grupo.<ol><li>Para reducir el estrés por aislamiento social, mantenga a los ratones con enriquecimientos ambientales (p. ej., refugios). Realizar diariamente los cuidados postoperatorios. Para aliviar el dolor, la angustia y el malestar, proporcione atención postoperatoria, incluida la analgesia (ibuprofeno en el agua potable (0,11 mg/ml).</li>
		<li>Observe a los ratones en busca de signos de infección, como supuración, letargo o dolor en el sitio de la incisión. La mayoría de los ratones sanos comienzan a caminar y alimentarse aproximadamente 2 horas después de la cirugía. Una postura encorvada, el pelaje erizado y la disminución de la ingesta de alimentos pueden indicar dolor. Si se observan estos signos, eutanasia inmediata a los ratones decapitándolos bajo anestesia profunda o asfixia por dióxido de carbono.</li>
	</ol></li>
	<li>La sangre entrará en el catéter en la arteria y formará un coágulo. Para mantener las líneas del catéter, retire el coágulo diariamente, siguiendo los pasos 3 a 6.</li>
	<li>Llene una jeringa de 1 ml y una aguja de 23 g (extremo no afilado) con solución salina heparinizada (100 U/ml). Utilizando una cámara de inducción, anestesiar ligeramente al ratón con isoflurano (1,0%-1,5%). A continuación, retire el ratón de la cámara y realice la extracción del coágulo bajo anestesia con isoflurano con una tapa nasal.</li>
	<li>Sujete el tubo de la arteria en la parte posterior del ratón con micro serrefine, retire la tapa y extraiga la sangre y los coágulos. Enjuague el catéter con solución salina heparinizada con otra jeringa de 1 ml con una aguja de 23 G (extremo no afilado) y vuelva a taparlo. Limpie la vía venosa como la vía arterial en caso de coagulación grave.</li>
	<li>Realice el mismo procedimiento para limpiar el catéter una vez al día durante 3 a 5 días.</li>
	<li>Compruebe el peso corporal del ratón. Si el peso corporal se reduce en más de un 10% desde el día de la cirugía, aplique cuidados de apoyo e intente mejorar la puntuación de la condición corporal normal, y utilice el ratón para otro experimento. NOTA: La pérdida de peso de los animales fue inferior al 10% en los experimentos de este estudio. La pérdida de peso afectará fuertemente el metabolismo sistémico de la glucosa. Por lo tanto, se recomienda esperar a la recuperación del peso corporal o retirar del experimento de la pinza.</li>
</ol>4. Configure el sistema de bomba (para pinza hipoglucémica)
<ol><li>Prepare 1 U/mL de insulina en solución salina BSA al 0,1 %, glucosa al 30 % en solución salina y solución salina heparinizada.</li>
	<li>Mide el peso corporal del ratón. Calcule el volumen de 1 U/mL de insulina para hacer la infusión de insulina (10 mU/kg/min). Infundir 1,7 μL/min de solución de insulina en los ratones en el experimento de pinza. Para hacer 300 μL de insulina infundida, el volumen requerido para 1 U/mL de insulina (μL) es de 2,647 (μL/g) x Peso corporal (g). Un volumen de 300 μL de infusión de insulina es suficiente para terminar el experimento de pinza en 1 ratón. La Tabla 1 muestra un ejemplo de infusión de insulina.</li>
	<li>Llene la infusión de insulina y la glucosa al 30 % en cada jeringa Hamilton, conéctelas con el tubo 1.2 y coloque la jeringa en la bomba de jeringa (Figura 3A). Llene cada solución en el tubo 1.2. Llene solución salina en una jeringa de 1 ml y un juego de tubos 1.4 (Figura 2A).</li>
	<li>Anestesiar al ratón con isoflurano (1,0%-1,5%) y conectar el tubo1.2 al catéter venoso y el juego de tubos1.4 al catéter arterial (Figura 3A). Usa cinta de celofán para mantener los tubos juntos.</li>
	<li>Coloque el ratón en un vaso de precipitados vacío de 500 ml. NOTA: Para la pinza hiperglucémica, use solución salina en lugar de 1 U/ml de insulina.</li>
</ol>5. Pinza hipoglucémica
<ol><li>Mida los niveles de glucosa en sangre cada 5-10 minutos, como se muestra en la Figura 3B, y recoja muestras de sangre para mediciones hormonales a -15 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 40 minutos, 60 minutos, 80 minutos, 100 minutos y 120 minutos. Siga el paso 5.2 para medir la glucosa en sangre. NOTA: No es necesario medir la glucosa en sangre en todos los momentos, pero se recomienda medirla al menos cada 10 min. Mida la glucosa en sangre cada 5 minutos cuando su nivel y velocidad de infusión de glucosa no sean estables.</li>
	<li>Sujete el extremo superior del juego de tubos1.4 y conecte una jeringa nueva, extraiga 50 μL de sangre y colóquela en un tubo de 1.5 mL para lavarla. Medir el nivel de glucosa en la sangre. NOTA: Es la sangre diluida por la solución salina en el tubo debido al lavado del catéter después de la toma de muestras anterior. Un volumen de 50 μL es suficiente para reemplazar la sangre diluida con sangre pura.</li>
	<li>Almacene la sangre diluida (glóbulos rojos). Lave la sangre acumulada (~500 μL) con solución salina (consulte los pasos 5.11-5.12) y regrese al cuerpo para evitar la hipoxia.</li>
	<li>El catéter está conectado a la arteria con presión arterial alta, por lo que cuando se afloja la pinza, la sangre fluirá hacia afuera y se usará para medir la glucosa con un práctico medidor de glucosa. Infundir 50 μL de solución salina para mantener suficiente cantidad de líquido sanguíneo.</li>
	<li>Para la toma de muestras de sangre, extraiga 50 μl adicionales de sangre y colóquela en un tubo de 1,5 ml sobre hielo. Infundir 100 μL (50 μL de reemplazo + 50 μL de muestreo) de solución salina.</li>
	<li>Después de 0 minutos de medición de glucosa en sangre, ponga en marcha la bomba de insulina de la jeringa. Primero, infundir 30 mU/kg/min en bolo durante 2 min (5,1 μL/min), luego 10 mU/kg/min (1,7 μL/min) de infusión durante el resto de la duración.</li>
	<li>Mida el nivel de glucosa en sangre y cambie la velocidad de infusión de glucosa cada 5-10 minutos durante 120 minutos.</li>
	<li>Cree un estado estacionario en el que la velocidad de infusión de glucosa no cambie y el nivel de glucosa en sangre sea de 50 mg/dL.</li>
	<li>Después de recolectar la muestra de sangre a t = 120 min, infundir un agente de eutanasia en la vena yugular y recolectar tejidos para análisis de ARN o proteínas.</li>
	<li>Centrifugar la sangre a 1000 x g durante 5 minutos y medir la concentración de hormonas como la insulina o el péptido C utilizando un kit ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Para lavar la sangre, centrifugar la sangre a 1000 x g durante 3 min. Retirar el sobrenadante, añadir 500 μL de solución salina heparinizada y realizar el pipeteo.</li>
	<li>Repita el lavado nuevamente y coloque los glóbulos rojos lavados en una jeringa de 1 ml para la arteria. Las células sanguíneas se volverán a infundir automáticamente cuando se infundan 50 o 100 μL de solución salina en los pasos 5.2 y 5.3. Controle cuidadosamente el hematocrito para prevenir la hipoxia. NOTA: Para la medición de la glucosa en sangre, se utilizó un medidor de glucosa comercial y práctico.</li>
</ol>6. Pinza hiperglucémica
<ol><li>Seguir los pasos de la técnica de pinza hipoglucémica, pero sin infusión de insulina y con la glucemia ajustada a 250-300 mg/dL. Mida los niveles de glucosa en sangre cada 5-10 minutos, como se muestra en la Figura 3B, y recoja muestras de sangre para mediciones hormonales a -15 minutos, 10 minutos, 20 minutos, 40 minutos, 60 minutos, 80 minutos, 100 minutos y 120 minutos.</li>
	<li>Conecte una jeringa nueva al juego de tubos1.4, extraiga 50 μL de sangre y colóquela en un tubo de 1.5 mL para lavarla.</li>
	<li>Para la toma de muestras de sangre, extraiga 50 μl adicionales de sangre y colóquela en un tubo de 1,5 ml sobre hielo. Infundir 100 μL (50 μL de reemplazo + 50 μL de muestreo) de solución salina.</li>
	<li>Después de 0 minutos de medición de glucosa en sangre, ponga en marcha la bomba de la jeringa de glucosa. Primero, infundir 30 g/kg/min en bolo durante 2 min (5,1 μL/min), luego 10 g/kg/min (1,7 μL/min) durante el resto de la duración.</li>
	<li>Mida el nivel de glucosa en sangre y cambie la velocidad de infusión de glucosa cada 5 -10 minutos durante 120 minutos. Cree un estado estacionario en el que la velocidad de infusión de glucosa no cambie y el nivel de glucosa en sangre sea de 250-300 mg/dL, un estado hiperglucémico con pinza.</li>
</ol>

Instalación quirúrgica de pinzas hiperglucémicas e hipoglucémicas en ratones

<ol>
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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+stress+responses+and+risk+of+type+2+diabetes+mellitus.">Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus.</a> Stress. 18 (5), 498-506 (2015).</li><li>Chan, O., Sherwin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+VMH+fuel+sensing+on+hypoglycemic+responses.">Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).</li><li>Donovan, C. M., Watts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+and+central+glucose+sensing+in+hypoglycemic+detection.">Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection.</a> Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).</li><li>TeSlaa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+source+of+glycolytic+intermediates+in+mammalian+tissues.">The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues.</a> Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

El método descrito aquí es simple y se puede hacer con puntas de pipeta, jeringas y otros elementos que se encuentran en los laboratorios ordinarios. Aunque es posible que los investigadores necesiten comprar tubos y bombas adicionales, no se necesitan equipos costosos. Así, este protocolo de cateterismo y pinza es más fácil de iniciar en comparación con reportes previos 12,13,14.
La técnica de...

La glucosa es una fuente importante de energía para las células, y la falta de glucosa puede provocar una variedad de síntomas y complicaciones. En el caso de glucosa baja (hipoglucemia, generalmente inferior a 70 mg/dL en el nivel de glucosa en sangre en ayunas, pero no debe determinarse por un solo valor1), los síntomas más comunes incluyen debilidad, confusión, sudoración y dolor de cabeza. También puede alterar la función cerebral y aumentar el riesgo de eventos cardiovasculares y mortalidad2. Por el contrario, la hiperglucemia es una afección médica en la que la concentración de glucosa plasmática supera los niveles normales (generalmente > 126 mg/dL enel nivel 3 de glucosa en sangre en ayunas). Esto puede ocurrir en personas con diabetes que tienen un déficit en la producción o utilización de insulina. La hiperglucemia puede conducir a la cetoacidosis diabética, que ocurre cuando el cuerpo no puede usar la glucosa para obtener energía, sino que descompone los ácidos grasos como combustible. El estado hiperglucémico e hiperosmolar también aumenta la mortalidad4. La hiperglucemia a largo plazo puede causar daños en los vasos sanguíneos, los nervios y los órganos, lo que lleva al desarrollo de varias complicaciones crónicas como enfermedades cardiovasculares, retinopatías y enfermedades renales. Por lo tanto, la concentración de glucosa en sangre debe mantenerse en un rango estrecho entre 100 mg/dL y 120 mg/dL.
La glucosa en sangre está regulada por el equilibrio entre la entrada y la salida de glucosa en un modelo de un compartimento (Figura 1A). El aporte de glucosa incluye la glucosa absorbida de los alimentos y la producción de glucosa del hígado, los riñones y el intestino delgado. La producción de glucosa comprende la absorción de glucosa en los tejidos y la eliminación de glucosa de los riñones. Tanto la cantidad de entrada como la salida de glucosa están reguladas por hormonas endocrinas. Por ejemplo, el glucagón, la corticosterona y las catecolaminas, conocidas como hormonas contrarreguladoras, se liberancuando los niveles de glucosa en sangre disminuyen. Estimulan la descomposición del glucógeno y la síntesis de glucosa, principalmente del hígado; Estos procesos se conocen como glucogenólisis y gluconeogénesis, respectivamente. La hiperglucemia aumenta la liberación de insulina de las células β pancreáticas y estimula la absorción de glucosa en los músculos, los tejidos adiposos y el corazón 6,7,8,9. El ejercicio aumenta la captación de glucosa independiente de la insulina10. El sistema nervioso simpático aumenta la absorción de glucosa en los músculos y el tejido adiposo marrón 6,11. Para medir la capacidad de regular el metabolismo de la glucosa en los tejidos periféricos, los investigadores suelen utilizar la prueba de tolerancia a la glucosa (GTT) y la prueba de tolerancia a la insulina (ITT) (Figura 1B, C). En la TGT hay que tener en cuenta dos factores: la liberación de insulina y la sensibilidad a la insulina (Figura 1B). Sin embargo, la curva de concentración de glucosa durante la prueba de 120 minutos es diferente en cada ratón, lo que puede afectar a diferentes cantidades de liberación de hormonas. En el ITT, la glucosa en sangre está regulada tanto por la sensibilidad a la insulina como por la liberación de hormonas contrarreguladoras. Por lo tanto, es difícil determinar el significado preciso del metabolismo de la glucosa, la liberación de insulina y la sensibilidad a la insulina en GTT e ITT, en situaciones en las que los niveles de glucosa en sangre no son constantes.
Para superar estos problemas, es deseable mantener la glucosa en sangre a un nivel constante (o "pinza"). En la pinza hiperglucémica, la glucosa se infunde en el torrente sanguíneo para elevar los niveles de glucosa en sangre a un nivel específico y luego se mantiene en ese nivel durante un período de tiempo. La cantidad de glucosa infundida se ajusta en función de las mediciones de los niveles de glucosa en sangre cada 5-10 minutos para mantener un estado estable. Esta técnica es particularmente útil para comprender los parámetros de secreción de insulina a un nivel de glucosa fijado. La pinza hipoglucémica es un método para mantener bajos los niveles de glucosa en sangre mediante la infusión de insulina. La glucosa se infunde a una velocidad variable para mantener un nivel específico de glucosa en sangre. Si el ratón no puede recuperarse de la hipoglucemia, se debe infundir más glucosa.
Aunque la realización de pinzas hiperglucémicas e hipoglucémicas tiene muchas ventajas, los procedimientos quirúrgicos y experimentales se consideran técnicamente difíciles. Así, pocos grupos de investigación han sido capaces de realizarlas. Nuestro objetivo fue describir estos métodos para que los investigadores con limitaciones financieras y de mano de obra comiencen estos experimentos con un presupuesto más bajo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>LOCTITE 454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit (C-peptide)</td>
			<td>Morinaga Institute of Bilogical Science Inc</td>
			<td>M1304</td>
			<td>Mouse C-peptide ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit (insulin)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>633-03411</td>
			<td>LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handy glucose meter</td>
			<td>Nipro Co.</td>
			<td>11-777</td>
			<td>Free Style Freedom Lite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (100U/ml)</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co.</td>
			<td>428021014</td>
			<td>Humulin R (100U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>Japan SLC Inc.</td>
			<td>C57BL/6NCrSlc</td>
			<td>C57BL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Natsume seisakusho</td>
			<td>C-23S-560 No.2</td>
			<td>Sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic suture</td>
			<td>V&#214;MEL</td>
			<td>HR-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing1</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>9-869-01</td>
			<td>LABORAN(R) Silicone Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing3</td>
			<td>IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.</td>
			<td>size5</td>
			<td>Polyethylene tubing size5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyperglycemic clamp and hypoglycemic clamp in conscious mice

La diabetes mellitus (DM) es causada por una liberación insuficiente de insulina de las células β pancreáticas (DM tipo 1) y sensibilidad a la insulina en los músculos, el hígado y los tejidos adiposos (DM tipo 2). La inyección de insulina trata a los pacientes con DM, pero conduce a la hipoglucemia como efecto secundario. El cortisol y las catecolaminas se liberan para activar la producción de glucosa del hígado para recuperar la hipoglucemia, lo que se denomina respuestas contrarreguladoras (RRC). En la investigación de la DM con modelos de roedores, se utilizan pruebas de tolerancia a la glucosa e inyección de 2-desoxiglucosa para medir la liberación de insulina y la RCR, respectivamente. Sin embargo, las concentraciones de glucosa en sangre cambian de forma persistente durante los experimentos, lo que dificulta la evaluación de la liberación neta de insulina y la RRC. Este artículo describe un método en el que la glucosa en sangre se mantiene en 250 mg/dL o 50 mg/dL en ratones conscientes para comparar la liberación de insulina y hormonas CRR, respectivamente.
Se implantan tubos de polietileno en la arteria carótida y la vena yugular de los ratones, y se permite que los ratones se recuperen de la cirugía. El tubo de la vena yugular se conecta a una jeringa Hamilton con una bomba de jeringa para permitir la infusión de insulina o glucosa a una velocidad constante y variable. El tubo de la arteria carótida es para la extracción de sangre. Para la pinza hiperglucémica, se infunde un 30% de glucosa en la vena y los niveles de glucosa en sangre se miden de la sangre arterial cada 5 minutos o 10 minutos. La velocidad de infusión de glucosa al 30% se incrementa hasta que el nivel de glucosa en sangre llega a 250 mg/dL. Se recolecta sangre para medir las concentraciones de insulina. Para el pinzamiento hipoglucémico, se infunde 10 mU/kg/min de insulina junto con un 30% de glucosa, cuya velocidad de infusión es variable para mantener 50 mg/dL de nivel de glucosa en sangre. La sangre se extrae para medir las hormonas contrarreguladoras cuando tanto la infusión de glucosa como la glucosa en sangre alcanzan un estado estacionario. Tanto las pinzas hiperglucémicas como las hipoglucémicas tienen el mismo procedimiento quirúrgico y configuraciones experimentales. Por lo tanto, este método es útil para los investigadores del metabolismo sistémico de la glucosa.

Glucose is an important source of energy for cells, and a lack of glucose can lead to a variety of symptoms and complications. In the event of low glucose (hypoglycemia, generally less than 70 mg/dL in fasting blood glucose level, but should not be determined by a single value1), the most common symptoms include weakness, confusion, sweating, and headache. It can also disrupt cerebral function and increase the risk of cardiovascular events and mortality2. Conversely, hyperglycemia is a medical condition in which the plasma glucose concentration exceeds normal levels (generally &#62; 126 mg/dL in fasting blood glucose level3). This can occur in individuals with diabetes who have either a deficit in insulin production or utilization. Hyperglycemia can lead to diabetic ketoacidosis, which occurs when the body cannot use glucose for energy but instead breaks down fatty acids for fuel. The hyperglycemic hyperosmolar state also increases mortality4. Long-term hyperglycemia can cause damage to blood vessels, nerves, and organs, leading to the development of several chronic complications such as cardiovascular disease, retinopathies, and kidney diseases. Thus, the blood glucose concentration must be maintained in a tight range between 100 mg/dL and 120 mg/dL.
Blood glucose is regulated by the balance between glucose input and output in a one-compartment model (Figure 1A). Glucose input includes absorbed glucose from food and glucose production from the liver, kidneys, and small intestine. Glucose output comprises glucose uptake in tissues and glucose disposal from the kidneys. Both the amount of glucose input and output are regulated by endocrine hormones. For example, glucagon, corticosterone, and catecholamines, known as counter-regulatory hormones, are released when blood glucose levels decrease5. They stimulate the breakdown of glycogen and the synthesis of glucose, mainly from the liver; these processes are known as glycogenolysis and gluconeogenesis, respectively. Hyperglycemia increases insulin release from pancreatic &#946;-cells and stimulates glucose uptake in the muscles, adipose tissues, and heart6,7,8,9. Exercise increases insulin-independent glucose uptake10. The sympathetic nervous system increases glucose uptake in muscles and brown adipose tissue6,11. To measure the ability to regulate glucose metabolism in peripheral tissues, researchers typically use the glucose tolerance test (GTT) and the insulin tolerance test (ITT) (Figure 1B,C). In GTT, two factors must be considered: insulin release and insulin sensitivity (Figure 1B). However, the glucose concentration curve during the 120 min test is different in each mouse, which may affect different amounts of hormone release. In ITT, blood glucose is regulated by both insulin sensitivity and the release of counter-regulatory hormones. Therefore, it is difficult to determine the precise meaning of glucose metabolism, insulin release, and insulin sensitivity in GTT and ITT, in situations where blood glucose levels are not constant.
To overcome these problems, it is desirable to keep blood glucose at a constant level (or &#34;clamp&#34;). In hyperglycemic clamp, glucose is infused into the bloodstream to raise blood glucose levels to a specific level and then maintained at that level for a period of time. The amount of infused glucose is adjusted based on measurements of blood glucose levels every 5-10 min to maintain a steady state. This technique is particularly useful for understanding the parameters of insulin secretion at a clamped glucose level. Hypoglycemic clamp is a method to maintain low blood glucose levels by infusing insulin. Glucose is infused at a variable rate to maintain a specific blood glucose level. If the mouse cannot recover from hypoglycemia, more glucose should be infused.
Although there are many advantages to performing hyperglycemic and hypoglycemic clamps, the surgical and experimental procedures are considered technically difficult. Thus, few research groups have been able to do them. We aimed to describe these methods for researchers with financial and workforce constraints to start these experiments at a lower budget.

Autor destacado: Investigación de la homeostasis de la glucosa en sangre en el cerebro murino utilizando una técnica de pinza hiperglucémica e hipoglucémica rentable

Pinza hiperglucémica y pinza hipoglucémica en ratones conscientes

El estudio de pinza hipoglucémica se realizó en ratones machos C57BL/6N (8 semanas de edad, más de 25 g de peso corporal) 3 h en ayunas al inicio del experimento (Figura 4A,B). El nivel inicial de glucosa en sangre fue de 136 mg/dl (t = -15 min). Si es inferior a 90 mg/dL, puede deberse a que la cirugía no salió bien, o a que el catéter arterial se insertó demasiado profundo, o a que han entrado coágulos de sangre en el flujo sanguíneo. La condición del ratón desp...

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Una pinza hiperglucémica se utiliza para medir la liberación de insulina con una concentración de glucosa en sangre más alta mantenida. Una pinza hipoglucémica sirve para medir la producción de glucosa inducida por respuestas contrarreguladoras. Ambos métodos utilizan el mismo procedimiento quirúrgico. En este trabajo se presenta una técnica de pinza para evaluar el metabolismo sistémico de la glucosa.

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, ...

Nuestra investigación investiga cómo nuestro cerebro regula el estado homeológico de los niveles de glucosa en sangre y qué tipo de neuronas, neuropéptidos y circuitos neuronales lo hacen. Además, ¿cómo le afecta nuestra memoria de la comida, el estrés psicológico, el dolor y otras sensaciones somáticas? Es difícil evaluar con precisión el metabolismo de la glucosa.Debemos comprobar la sensibilidad o resistencia a la insulina, la secreción de insulina y las respuestas contrarreguladoras. También debemos comprobar qué tejido cambia la captación de glucosa y la producción de glucosa en relación con la sensibilidad o resistencia a la insulina. Creemos que no solo la sensibilidad a la insulina, sino también la secreción de insulina y las respuestas contrarreguladoras están afectando los niveles normales de glucosa en sangre, incluso en condiciones saludables.Estamos tratando de entender el panorama completo de la regulación de la glucosa por parte del cerebro. Nuestro protocolo es de bajo costo y no necesita un dispositivo especial y costoso para crear una abrazadera. Permitirá a los investigadores implementar el uso de la abrazadera de manera fácil y rápida.Debido a que este protocolo ayuda a los investigadores a usar la pinza muy fácilmente, esperamos que nuestro protocolo fomente más investigación en todo el campo de las ciencias de la vida.

hyperglycemic-clamp-and-hypoglycemic-clamp-in-conscious-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice

917 vistas.  Kumamoto University. Nuestra investigación investiga cómo nuestro cerebro regula el estado homeológico de los niveles de glucosa en sangre y qué tipo de neuronas, neuropéptidos y circuitos neuronales lo hacen. Además, ¿cómo le afecta nuestra memoria de la comida, el estrés psicológico, el dolor y otras sensaciones somáticas? Es difícil evaluar con precisión el metabolismo de la glucosa.Debemos comprobar la sensibilidad o resistencia a la insulina, la secreción de insulina y las respuestas con...

Video: Autor destacado: Investigación de la homeostasis de la glucosa en sangre en el cerebro murino utilizando una técnica de pinza hiperglucémica e hipoglucémica rentable

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, and adipose tissues (Type2 DM). Insulin injection treats DM patients but leads to hypoglycemia as a side effect. Cortisol and catecholamines are released to activate glucose production from the liver to recover hypoglycemia, called counter-regulatory responses (CRR). In DM research using rodent models, glucose tolerance tests and 2-deoxy-glucose injection are used to measure insulin release and CRR, respectively. However, blood glucose concentrations change persistently during experiments, causing difficulties in assessing net insulin release and CRR. This article describes a method in which blood glucose is kept at 250 mg/dL or 50 mg/dL in conscious mice to compare the release of insulin and CRR hormones, respectively.
Polyethylene tubing is implanted in the mice's carotid artery and jugular vein, and the mice are allowed to recover from the surgery. The jugular vein tubing is connected to a Hamilton syringe with a syringe pump to enable insulin or glucose infusion at a constant and variable rate. The carotid artery tubing is for blood collection. For the hyperglycemic clamp, 30% glucose is infused into the vein, and blood glucose levels are measured from the arterial blood every 5 min or 10 min. The infusion rate of 30% glucose is increased until the blood glucose level becomes 250 mg/dL. Blood is collected to measure insulin concentrations. For hypoglycemic clamp, 10 mU/kg/min insulin is infused together with 30% glucose, whose infusion rate is variable to maintain 50 mg/dL of blood glucose level. Blood is collected to measure counter-regulatory hormones when both glucose infusion and blood glucose reach a steady state. Both hyperglycemic and hypoglycemic clamps have the same surgical procedure and experimental setups. Thus, this method is useful for researchers of systemic glucose metabolism.

A hyperglycemic clamp is used for measuring insulin release with a maintained higher blood glucose concentration. A hypoglycemic clamp is for measuring glucose production induced by counter-regulatory responses. Both methods use the same surgical procedure. Here, we present a clamp technique to assess systemic glucose metabolism.