이 연구는 우수한 젊은 연구자를 위한 선도 이니셔티브(Leading Initiative for Excellent Young Researchers, 문부과학성)의 지원을 받았습니다. 과학 연구 보조금 (B) (보조금 번호 JP21H02352); 일본 의료연구개발기구(AMED-RPIME, 허가 번호 JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); 우에하라 기념 재단; 대사 장애 연구를 위한 아스텔라스 재단; 스즈켄 기념 재단, 아키야마 생명 과학 재단, 나리시게 신경 과학 연구 재단. 또한 이 원고의 초안을 편집해 주신 Nur Farehan Asgar 박사님께도 감사드립니다.

모든 절차는 구마모토 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
참고: 통증 완화를 위해 이부프로펜을 식수(0.11mg/mL)에 타서 48시간 동안 투여하고, 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg i.p.)을 수술 30분 전에 투여했습니다. 멸균 조건에는 장갑, 마스크 및 동물 사이에서 에틸렌 옥사이드로 멸균된 고압멸균 기구가 포함됩니다. 수술은 37°C로 설정된 가열 패드에서 수행되었으며 각 동물에 대한 새로운 실험실 매트로 덮여 있었습니다. 수술 전에 수술 부위를 베타딘 용액과 알코올로 청소했습니다. 모든 수술 기구는 오토클레이브로 멸균되었습니다(2회 이하의 수술). 절개를 하기 전에 쥐가 완전히 마취되었는지 확인했습니다. 각 마우스에 대한 마취 깊이는 수술 전과 수술 중에 발가락 꼬집음으로 평가되었습니다. 적응 시간은 매번 5분을 넘지 않았습니다. 해당 기관의 IACUC 지침을 따르십시오.
1. 경정맥 및 경동맥용 튜브 준비
<ol><li>모든 튜브, 폴리프로필렌 공급품(예: 피펫 팁) 및 봉합사를 오토클레이브 또는 에틸렌 옥사이드로 멸균합니다. 경정맥의 경우 접착제를 사용하여 8cm의 튜브1( 재료 참조)과 3cm의 튜브2를 연결합니다(그림 2A). 튜빙 2(폴리에틸렌)는 너무 단단하여 혈관을 손상시킬 수 있으므로 튜빙1 2mm를 상단에 올립니다(튜빙1.1).</li>
	<li>포도당과 인슐린을 주입하기 위한 경정맥(Tubing1.2)용 연장 튜브<ol><li>튜빙2가 있는 30cm 튜브 2개와 10cm 튜브 1개를 준비합니다(그림 2A). 20μL 피펫 팁(또는 튜빙 1.1과 연결하기 위해 OD가 0.5mm인 팁 끝이 좁은 < 있는 모든 것)의 날카로운 끝을 잘라내고 3개의 튜빙2(30cm, 30cm, 10cm)를 함께 넣습니다. 접착 접착제로 밀봉하십시오.</li>
		<li>튜빙 5의 다른 쪽 끝에 튜빙1의 2cm를 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>경동맥(Tubing1.3): 튜브2를 늘려 더 얇게 만듭니다. 접착제를 사용하여 8cm의 튜빙1과 늘어난 튜빙3의 2cm를 연결합니다(그림 2A). 끝에서 9mm에 표시하십시오.</li>
	<li>튜브와 주사기를 연결하는 끝이 날카롭지 않은 바늘: 바늘의 날카로운 끝(23G) 부근을 금속 줄로 긁고 펜치로 앞뒤로 부드럽게 몇 번 구부려 부러뜨립니다. 바늘 가운데를 똑같이 잘라 금속 커넥터 조각을 만듭니다(그림 2A).</li>
	<li>혈액을 채취하는 동맥용 연장 튜브(튜브 세트 1.4): 10cm의 튜브1을 금속 커넥터와 1.4단계에서 만든 날카롭지 않은 바늘에 연결합니다. 알림: 모든 튜브와 봉합사는 오토클레이브 또는 에틸렌 옥사이드로 멸균됩니다</li>
</ol>2. 수술
<ol><li>이소플루란(1.5-2.0%) 또는 케타민/자일라진(케타민 10mg/mL, 자일라진 1mg/mL, 0.9% 멸균 식염수에 자일라진 1mg/mL, 복강내 [ip] 주입을 통해 0.1mL/10g의 체중(BW))으로 마우스를 마취합니다. 물리적 스트레스를 줄이기 위해 따뜻한 패드(37°C)에 마우스를 올려 놓으십시오. 5-10분 동안 깊은 마취를 기다립니다. 페달 반사, 호흡, 심박수로 마취의 깊이를 확인하고 발가락 꼬집음으로 자극에 대한 반응을 확인합니다. 수술 중에는 수술용 테이프를 사용하여 마취제를 지속적으로 흡입하기 위해 코캡을 수술대에 고정해야 합니다. 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오.</li>
	<li>튜브 1.1 및 1.3에 헤파린화 식염수(100U/mL)를 채우고 날카롭지 않은 바늘이 있는 1mL 주사기로 연결합니다(그림 2B). 튜빙3( 재료 표 참조)의 끝을 튜빙1.1 및 튜빙1.3의 캡으로 사용할 납땜 인두로 녹여 닫습니다.</li>
	<li>첫 번째 절개 부위(뒷면의 견갑골 사이)와 두 번째 절개 부위(앞쪽의 목)를 면도하고 10% 베타딘을 3회 주기로 닦은 다음 멸균 70% 알코올로 수술 전 제제를 합니다. 흉골에 5mm 두부의 작은 수직 정중선 절개를 하고 조직을 뭉툭하게 절개하고 동맥을 노출시킵니다. 미주 신경을 동맥에서 분리하십시오. 이것은 포도당 대사에 대한 미주 신경 제거의 부정적인 영향을 줄입니다. 참고: 복부 절개에서 카테터를 정맥에 삽입하고 실크 봉합사로 고정하는 단계까지의 단계는 현미경으로 수행됩니다.</li>
	<li>동맥 아래에 두 개의 실크 봉합사를 놓습니다. 한쪽 봉합사는 두개골 쪽(그림 2C-1)에 단단히 묶고 다른 봉합사는 꼬리 쪽(그림 2C-2)에 느슨하게 묶어 혈류를 멈추게 하면 혈류를 멈추게 할 수 있지만 나중에 다시 열 수 있습니다. 동맥 아래에 봉합사를 하나 더 놓습니다(그림 2C-3).</li>
	<li>스프링 가위로 그림 2C-1 근처의 동맥을 자르고 tubing1.3을 동맥에 넣습니다. 동맥과 튜브를 느슨하게 묶습니다(그림 2C-3, 단단히 묶지 마십시오. 튜브는 동맥 깊숙이 삽입됩니다. 꼬리 쪽의 매듭(그림 2C-2)을 열어 9mm 표시가 중간의 매듭에 도달할 때까지 튜브를 삽입합니다(그림 2C-3). 모든 합자를 단단히 묶고 헤파린화된 멸균 식염수로 씻어냅니다.</li>
	<li>경정맥 카테터의 오른쪽 경동맥과 동일한 절개부에서 오른쪽 경정맥을 노출합니다. 두개골 끝을 분리하고 실크 봉합사로 결찰합니다(그림 2D-1, 재료 표). 노출된 정맥의 꼬리 끝에 다른 봉합사를 놓습니다(그림 2D-2). 스프링 가위로 그림 2D-1 표시 근처의 정맥을 자릅니다.</li>
	<li>카테터를 삽입하고(혈관이 침투하는 것을 방지하기 위해 너무 깊지 않음) 묶고 혈액 샘플링을 육안으로 확인합니다. 헤파린화된 멸균 식염수(0.2mL)로 씻어내고 카테터에 혈액이 남아 있지 않은지 육안으로 확인합니다.</li>
	<li>첫 번째 상처의 감염을 방지하기 위해 새로운 멸균 수술용 드레이프에 마우스를 놓습니다. 마우스를 뒤집어 베타딘을 3회 투여한 후 멸균 알코올로 수술 전 제제를 사용하여 닦고 견갑골 사이를 작게 절개합니다.</li>
	<li>바늘 홀더를 등 절개 부위에서 복부 쪽까지 피부 아래에 통과시킵니다. 바늘 홀더로 카테터를 고정하고 피부 아래로 통과시킨 다음 다시 가져옵니다. 절개 부위를 청소하고 인공 봉합사(직경 0.15-0.2mm)로 복부 절개 부위를 봉합합니다. 견갑골 사이의 절개 부위에 마이크로 세레파인으로 정맥 카테터를 고정합니다.</li>
	<li>클램프 위 1cm 높이의 카테터를 자르고 헤파린화 식염수로 씻어낸 다음 캡으로 닫습니다(2.4단계). 동맥 카테터에 대해서도 동일한 절차를 따르십시오. 인공 봉합사(직경 0.15-0.2mm)로 등쪽 절개 부위를 봉합합니다.</li>
	<li>마우스를 따뜻하고 깨끗한 케이지에 넣습니다(그림 2E). 매일 수술 후 관리를 수행하십시오.</li>
</ol>3. 회복
<ol><li>다른 쥐가 그룹 하우징의 카테터를 물 수 있으므로 쥐를 한 번에 수용합니다.<ol><li>사회적 고립으로 인한 스트레스를 줄이려면 환경적 풍부함(예: 대피소)으로 쥐를 기르십시오. 매일 수술 후 관리를 수행하십시오. 통증, 고통 및 불편함을 완화하기 위해 진통제(식수에 이부프로펜(0.11mg/mL))를 포함한 수술 후 관리를 제공합니다.</li>
		<li>절개 부위의 곪음, 무기력 또는 통증과 같은 감염 징후가 있는지 쥐를 관찰하십시오. 대부분의 건강한 쥐는 수술 후 약 2시간 후에 걷고 먹이를 먹기 시작합니다. 구부정한 자세, 주름진 털, 음식 섭취 감소는 통증을 나타낼 수 있습니다. 이러한 징후가 관찰되면 즉시 깊은 마취 또는 이산화탄소 질식 상태에서 쥐의 목을 베어 안락사시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>혈액이 동맥의 카테터로 들어가 혈전을 형성합니다. 카테터 라인을 유지하려면 3-6단계에 따라 매일 혈전을 제거하십시오.</li>
	<li>1mL 주사기와 23G 바늘(끝이 날카롭지 않음)에 헤파린 식염수(100U/mL)를 채웁니다. 유도 챔버를 사용하여 마우스를 이소플루란(1.0%-1.5%)으로 가볍게 마취합니다. 그런 다음 챔버에서 마우스를 제거하고 노즈 캡으로 이소플루란 마취 하에 혈전 제거를 수행합니다.</li>
	<li>마우스 뒷면의 동맥 튜브를 마이크로 세레파인으로 고정하고 캡을 제거하고 혈액과 혈전을 추출합니다. 23G 바늘(끝이 날카롭지 않음)이 있는 다른 1mL 주사기를 사용하여 헤파린화 식염수로 카테터를 세척하고 다시 캡을 씌웁니다. 심한 응고의 경우 동맥선과 같은 정맥선을 청소하십시오.</li>
	<li>3-5일 동안 하루에 한 번 카테터를 청소하기 위해 동일한 절차를 수행합니다.</li>
	<li>마우스의 본체 무게를 확인하십시오. 수술 당일보다 체중이 10% 이상 감소하면 지지적인 치료를 적용하여 정상 신체 상태 점수를 개선한 후 마우스를 사용하여 다른 실험을 합니다. 참고: 이 연구의 실험에서 동물의 체중 감소는 10% 미만이었습니다. 체중 감소는 전신 포도당 대사에 큰 영향을 미칩니다. 따라서 체중 회복을 기다리거나 클램프 실험에서 제거하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>4. 펌프 시스템 설정(저혈당 클램프용)
<ol><li>0.1% BSA 식염수, 30% 포도당 식염수, 헤파린 식염수로 1U/mL 인슐린을 준비합니다.</li>
	<li>마우스의 체중을 측정합니다. 인슐린을 주입하기 위해 1U/mL 인슐린의 부피를 계산합니다(10mU/kg/min). 클램프 실험에서 1.7μL/min의 인슐린 용액을 마우스에 주입합니다. 300μL의 인슐린을 주입하기 위해 1U/mL 인슐린(μL)에 필요한 부피는 2.647(μL/g) x 체중(g)입니다. 300μL의 인슐린 주입물은 마우스 1마리에 대한 클램프 실험을 완료하기에 충분합니다. 표 1 은 인슐린을 주입시키는 예를 나타낸다.</li>
	<li>각 Hamilton 주사기에 인슐린 주입액과 포도당 30%를 채우고 튜브 1.2에 연결한 다음 주사기를 주사기 펌프에 놓습니다(그림 3A). 튜빙 1.2에 각 용액을 채웁니다. 1mL 주사기 및 튜브 세트 1.4에 식염수를 채웁니다(그림 2A).</li>
	<li>마우스를 이소플루란(1.0%-1.5%)으로 마취하고 tubing1.2를 정맥 카테터에 연결하고 tubing set1.4를 동맥 카테터에 연결합니다(그림 3A). 셀로판 테이프를 사용하여 튜브를 함께 고정합니다.</li>
	<li>빈 500mL 비커에 마우스를 넣습니다. 알림: 고혈당 클램프의 경우 1U/mL 인슐린 대신 식염수를 사용하십시오.</li>
</ol>5. 저혈당 클램프
<ol><li>그림 5B와 같이 10-3분마다 혈당 수치를 측정하고 -15분, 10분, 20분, 40분, 60분, 80분, 100분 및 120분에 호르몬 측정을 위해 혈액 샘플을 수집합니다. 5.2단계에 따라 혈당을 측정합니다. 알림: 모든 시점에서 혈당을 측정할 필요는 없지만 최소 10분마다 혈당을 측정하는 것이 좋습니다. 혈당 수준과 포도당 주입 속도가 일정하지 않을 때 5분마다 혈당을 측정합니다.</li>
	<li>튜브 세트 1.4의 상단 끝을 고정하고 새 주사기를 연결하고 50μL의 혈액을 추출한 다음 세척을 위해 1.5mL 튜브에 넣습니다. 혈당 수치를 측정합니다. 참고: 이것은 이전 샘플링 후 카테터 세척으로 인해 튜브의 식염수로 희석된 혈액입니다. 50μL의 부피는 희석된 혈액을 순수한 혈액으로 대체하기에 충분합니다.</li>
	<li>희석된 혈액(적혈구)을 저장합니다. 고인 혈액(~500μL)을 식염수로 씻고(5.11-5.12단계 참조) 저산소증을 방지하기 위해 몸으로 돌아갑니다.</li>
	<li>카테터는 고혈압이 있는 동맥에 연결되어 있기 때문에 클램프를 풀면 혈액이 흘러나와 편리한 혈당 측정기로 혈당을 측정하는 데 사용됩니다. 충분한 양의 혈액을 유지하기 위해 50μL의 식염수를 주입합니다.</li>
	<li>혈액 샘플링의 경우 추가로 50μL의 혈액을 추출하여 얼음 위의 1.5mL 튜브에 넣습니다. 식염수 100μL(치환 50μL + 샘플링 50μL)를 주입합니다.</li>
	<li>혈당 측정 0분 후 인슐린 주사기 펌프를 시작합니다. 먼저 30mU/kg/min을 볼루스에 2분(5.1μL/분) 동안 주입한 다음 나머지 기간 동안 10mU/kg/min(1.7μL/분)을 주입합니다.</li>
	<li>혈당 수치를 측정하고 5분 동안 10-120분마다 포도당 주입 속도를 변경합니다.</li>
	<li>포도당 주입 속도가 변하지 않고 혈당 수치가 50mg/dL인 안정된 상태를 만듭니다.</li>
	<li>t=120분에 혈액 샘플을 채취한 후 안락사를 경정맥에 주입하고 RNA 또는 단백질 분석을 위해 조직을 채취합니다.</li>
	<li>혈액을 1000 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA 키트를 사용하여 인슐린 또는 c-펩타이드와 같은 호르몬 농도를 측정합니다.</li>
	<li>혈액을 씻을 때는 혈액을 1000 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 500μL의 헤파린화 식염수를 첨가한 후 피펫팅을 수행합니다.</li>
	<li>세척을 다시 반복하고 세척한 적혈구를 동맥용 주사기 1mL에 넣습니다. 50 및 5.2 및 5.3 단계에서 50 또는 100 μL의 식염수를 주입하면 혈액 세포가 자동으로 재주입됩니다. 저산소증을 예방하기 위해 헤마토크릿을 주의 깊게 모니터링하십시오. 알림: 혈당 측정을 위해 상업용 편리한 혈당 측정기가 사용되었습니다.</li>
</ol>6. 고혈당 클램프
<ol><li>저혈당 클램프 기술로 단계를 따르되 인슐린 주입 없이 혈당을 250-300mg/dL로 조정하십시오. 그림 5B와 같이 10-3분마다 혈당 수치를 측정하고 -15분, 10분, 20분, 40분, 60분, 80분, 100분 및 120분에 호르몬 측정을 위해 혈액 샘플을 수집합니다.</li>
	<li>새 주사기를 튜브 세트 1.4에 연결하고 50μL의 혈액을 추출한 후 세척을 위해 1.5mL 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>혈액 샘플링의 경우 추가로 50μL의 혈액을 추출하여 얼음 위의 1.5mL 튜브에 넣습니다. 식염수 100μL(치환 50μL + 샘플링 50μL)를 주입합니다.</li>
	<li>혈당 측정 0분 후 혈당 주사기 펌프를 시작합니다. 먼저 2분(5.1μL/분) 동안 볼루스에 30g/kg/min을 주입한 다음 나머지 기간 동안 10g/kg/min(1.7μL/분)을 주입합니다.</li>
	<li>혈당 수치를 측정하고 5분 동안 10-120분마다 포도당 주입 속도를 변경합니다. 포도당 주입 속도가 변하지 않고 혈당 수치가 250-300mg/dL인 고정된 고혈당 상태인 안정된 상태를 만듭니다.</li>
</ol>

마우스의 고혈당 및 저혈당 클램프의 외과적 설치

<ol>
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G., Krizsan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islets+of+obese+hyperglycemic+mice+(ob/ob).">Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob).</a> Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).</li><li>Uchida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+TRPM2+impaired+insulin+secretion+and+glucose+metabolisms+in+mice.">Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice.</a> Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).</li><li>Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocrine+stress+responses+and+risk+of+type+2+diabetes+mellitus.">Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus.</a> Stress. 18 (5), 498-506 (2015).</li><li>Chan, O., Sherwin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+VMH+fuel+sensing+on+hypoglycemic+responses.">Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).</li><li>Donovan, C. M., Watts, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+and+central+glucose+sensing+in+hypoglycemic+detection.">Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection.</a> Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).</li><li>TeSlaa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+source+of+glycolytic+intermediates+in+mammalian+tissues.">The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues.</a> Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).</li></ol>

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

여기에 설명된 방법은 피펫 팁, 주사기 및 일반 실험실에서 볼 수 있는 기타 품목으로 수행할 수 있는 간단한 방법입니다. 연구원이 추가 튜브와 펌프를 구입해야 할 수도 있지만 값비싼 장비는 필요하지 않습니다. 따라서, 이러한 카테터 삽입 및 클램프 프로토콜은 이전 보고에 비해 시작하기가 더 쉽다(12,13,14).
<p class="jove_...

포도당은 세포의 중요한 에너지원이며, 포도당이 부족하면 다양한 증상과 합병증이 발생할 수 있습니다. 저혈당(저혈당, 일반적으로 공복 혈당 수치가 70mg/dL 미만이지만단일 값으로 결정되어서는 안 됨1)의 경우 가장 흔한 증상으로는 쇠약, 혼란, 발한, 두통 등이 있습니다. 또한 대뇌 기능을 방해하고 심혈관 질환 및 사망 위험을 증가시킬 수 있다2. 반대로, 고혈당증은 혈장 포도당 농도가 정상 수준(일반적으로 공복 혈당 수치3에서 > 126mg/dL)을 초과하는 의학적 상태입니다. 이는 인슐린 생산 또는 활용에 결핍이 있는 당뇨병 환자에서 발생할 수 있습니다. 고혈당증은 당뇨병성 케톤산증으로 이어질 수 있는데, 이는 신체가 포도당을 에너지로 사용하지 못하고 대신 지방산을 분해하여 연료로 사용할 때 발생합니다. 고혈당 고삼투압 상태도 사망률을 증가시킨다4. 장기적인 고혈당증은 혈관, 신경 및 장기에 손상을 일으켜 심혈관 질환, 망막병증 및 신장 질환과 같은 여러 만성 합병증의 발병으로 이어질 수 있습니다. 따라서 혈당 농도는 100mg/dL에서 120mg/dL 사이의 좁은 범위로 유지되어야 합니다.
혈당은 1구획 모델에서 포도당 입력과 출력 사이의 균형에 의해 조절됩니다(그림 1A). 포도당 입력에는 음식에서 흡수되는 포도당과 간, 신장 및 소장에서 포도당 생성이 포함됩니다. 포도당 출력은 조직의 포도당 흡수와 신장의 포도당 처리로 구성됩니다. 포도당의 투입량과 출력량은 모두 내분비 호르몬에 의해 조절됩니다. 예를 들어, 글루카곤, 코르티코스테론, 카테콜아민은 혈당 수치가 감소할 때 분비된다5. 그들은 주로 간에서 글리코겐의 분해와 포도당의 합성을 자극합니다. 이러한 과정은 각각 glycogenlysis 및 gluconeogenesis로 알려져 있습니다. 고혈당증은 췌장 β세포에서 인슐린 분비를 증가시키고 근육, 지방 조직 및 심장의 포도당 흡수를 자극한다 6,7,8,9. 운동은 인슐린과 무관한 포도당 흡수를 증가시킨다10. 교감 신경계는 근육과 갈색 지방 조직의 포도당 흡수를 증가시킵니다 6,11. 말초 조직의 포도당 대사를 조절하는 능력을 측정하기 위해 연구자들은 일반적으로 포도당 내성 검사(GTT)와 인슐린 내성 검사(ITT)를 사용합니다(그림 1B,C). GTT에서는 인슐린 분비와 인슐린 감수성이라는 두 가지 요소를 고려해야 합니다(그림 1B). 그러나 120분 테스트 중 포도당 농도 곡선은 마우스마다 다르며, 이는 호르몬 방출량에 따라 다를 수 있습니다. ITT에서 혈당은 인슐린 감수성과 역조절 호르몬의 방출에 의해 조절됩니다. 따라서 혈당 수치가 일정하지 않은 상황에서 GTT 및 ITT에서 포도당 대사, 인슐린 방출 및 인슐린 감수성의 정확한 의미를 결정하기 어렵습니다.
이러한 문제를 극복하려면 혈당을 일정한 수준(또는 "클램프")으로 유지하는 것이 바람직합니다. 고혈당 클램프에서는 포도당을 혈류에 주입하여 혈당 수치를 특정 수준으로 올린 다음 일정 기간 동안 해당 수준을 유지합니다. 주입된 포도당의 양은 안정된 상태를 유지하기 위해 5-10분마다 혈당 수치를 측정하여 조정됩니다. 이 기술은 클램핑된 포도당 수준에서 인슐린 분비의 매개변수를 이해하는 데 특히 유용합니다. 저혈당 클램프는 인슐린을 주입하여 낮은 혈당 수치를 유지하는 방법입니다. 포도당은 특정 혈당 수치를 유지하기 위해 다양한 비율로 주입됩니다. 쥐가 저혈당에서 회복할 수 없으면 더 많은 포도당을 주입해야 합니다.
고혈당 및 저혈당 클램프를 수행하는 데에는 많은 이점이 있지만 수술 및 실험 절차는 기술적으로 어려운 것으로 간주됩니다. 따라서 이를 수행할 수 있는 연구 그룹은 거의 없습니다. 우리는 재정 및 인력 제약이 있는 연구자들이 더 적은 예산으로 이러한 실험을 시작할 수 있도록 이러한 방법을 설명하는 것을 목표로 했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adhesive glue</td>
			<td>Henkel AG &#38; Co. KGaA</td>
			<td>LOCTITE 454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit (C-peptide)</td>
			<td>Morinaga Institute of Bilogical Science Inc</td>
			<td>M1304</td>
			<td>Mouse C-peptide ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA kit (insulin)</td>
			<td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td>
			<td>633-03411</td>
			<td>LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handy glucose meter</td>
			<td>Nipro Co.</td>
			<td>11-777</td>
			<td>Free Style Freedom Lite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin (100U/ml)</td>
			<td>Eli Lilly &#38; Co.</td>
			<td>428021014</td>
			<td>Humulin R (100U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>Japan SLC Inc.</td>
			<td>C57BL/6NCrSlc</td>
			<td>C57BL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Natsume seisakusho</td>
			<td>C-23S-560 No.2</td>
			<td>Sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>Pump Systems Inc.</td>
			<td>NE-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic suture</td>
			<td>V&#214;MEL</td>
			<td>HR-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing1</td>
			<td>AS ONE Corporation</td>
			<td>9-869-01</td>
			<td>LABORAN(R) Silicone Tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>427400</td>
			<td>BD Intramedic PE Tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing3</td>
			<td>IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.</td>
			<td>size5</td>
			<td>Polyethylene tubing size5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hyperglycemic clamp and hypoglycemic clamp in conscious mice

진성 당뇨병(DM)은 췌장 β세포의 인슐린 분비 부족(1형 DM)과 근육, 간, 지방 조직의 인슐린 민감성(2형 DM)으로 인해 발생합니다. 인슐린 주사는 DM 환자를 치료하지만 부작용으로 저혈당증을 유발합니다. 코르티솔과 카테콜아민은 간에서 포도당 생산을 활성화하여 저혈당을 회복하기 위해 분비되는데, 이를 역조절 반응(CRR)이라고 합니다. 설치류 모델을 이용한 DM 연구에서는 인슐린 방출과 CRR을 측정하기 위해 각각 포도당 내성 검사와 2-데옥시-포도당 주사를 사용합니다. 그러나 실험 중에 혈당 농도가 지속적으로 변하여 순 인슐린 분비와 CRR을 평가하는 데 어려움이 있습니다. 이 글에서는 의식이 있는 쥐의 혈당을 250mg/dL 또는 50mg/dL로 유지하여 각각 인슐린과 CRR 호르몬의 분비를 비교하는 방법을 설명합니다.
폴리에틸렌 튜브를 생쥐의 경동맥과 경정맥에 이식하고 생쥐가 수술에서 회복할 수 있도록 합니다. 경정맥 튜브는 주사기 펌프가 있는 해밀턴 주사기에 연결되어 일정하고 다양한 속도로 인슐린 또는 포도당을 주입할 수 있습니다. 경동맥 튜브는 혈액 수집을 위한 것입니다. 고혈당 클램프의 경우 30%의 포도당을 정맥에 주입하고 5분 또는 10분마다 동맥혈에서 혈당 수치를 측정합니다. 혈당 수치가 250mg/dL이 될 때까지 30% 포도당의 주입 속도가 증가합니다. 인슐린 농도를 측정하기 위해 혈액을 채취합니다. 저혈당 클램프의 경우 10mU/kg/min 인슐린을 30% 포도당과 함께 주입하며, 주입 속도는 50mg/dL의 혈당 수준을 유지하기 위해 가변적입니다. 포도당 주입과 혈당이 모두 정상 상태에 도달했을 때 역조절 호르몬을 측정하기 위해 혈액을 수집합니다. 고혈당 클램프와 저혈당 클램프는 모두 동일한 수술 절차와 실험 설정을 가지고 있습니다. 따라서 이 방법은 전신 포도당 대사 연구자에게 유용합니다.

Glucose is an important source of energy for cells, and a lack of glucose can lead to a variety of symptoms and complications. In the event of low glucose (hypoglycemia, generally less than 70 mg/dL in fasting blood glucose level, but should not be determined by a single value1), the most common symptoms include weakness, confusion, sweating, and headache. It can also disrupt cerebral function and increase the risk of cardiovascular events and mortality2. Conversely, hyperglycemia is a medical condition in which the plasma glucose concentration exceeds normal levels (generally &#62; 126 mg/dL in fasting blood glucose level3). This can occur in individuals with diabetes who have either a deficit in insulin production or utilization. Hyperglycemia can lead to diabetic ketoacidosis, which occurs when the body cannot use glucose for energy but instead breaks down fatty acids for fuel. The hyperglycemic hyperosmolar state also increases mortality4. Long-term hyperglycemia can cause damage to blood vessels, nerves, and organs, leading to the development of several chronic complications such as cardiovascular disease, retinopathies, and kidney diseases. Thus, the blood glucose concentration must be maintained in a tight range between 100 mg/dL and 120 mg/dL.
Blood glucose is regulated by the balance between glucose input and output in a one-compartment model (Figure 1A). Glucose input includes absorbed glucose from food and glucose production from the liver, kidneys, and small intestine. Glucose output comprises glucose uptake in tissues and glucose disposal from the kidneys. Both the amount of glucose input and output are regulated by endocrine hormones. For example, glucagon, corticosterone, and catecholamines, known as counter-regulatory hormones, are released when blood glucose levels decrease5. They stimulate the breakdown of glycogen and the synthesis of glucose, mainly from the liver; these processes are known as glycogenolysis and gluconeogenesis, respectively. Hyperglycemia increases insulin release from pancreatic &#946;-cells and stimulates glucose uptake in the muscles, adipose tissues, and heart6,7,8,9. Exercise increases insulin-independent glucose uptake10. The sympathetic nervous system increases glucose uptake in muscles and brown adipose tissue6,11. To measure the ability to regulate glucose metabolism in peripheral tissues, researchers typically use the glucose tolerance test (GTT) and the insulin tolerance test (ITT) (Figure 1B,C). In GTT, two factors must be considered: insulin release and insulin sensitivity (Figure 1B). However, the glucose concentration curve during the 120 min test is different in each mouse, which may affect different amounts of hormone release. In ITT, blood glucose is regulated by both insulin sensitivity and the release of counter-regulatory hormones. Therefore, it is difficult to determine the precise meaning of glucose metabolism, insulin release, and insulin sensitivity in GTT and ITT, in situations where blood glucose levels are not constant.
To overcome these problems, it is desirable to keep blood glucose at a constant level (or &#34;clamp&#34;). In hyperglycemic clamp, glucose is infused into the bloodstream to raise blood glucose levels to a specific level and then maintained at that level for a period of time. The amount of infused glucose is adjusted based on measurements of blood glucose levels every 5-10 min to maintain a steady state. This technique is particularly useful for understanding the parameters of insulin secretion at a clamped glucose level. Hypoglycemic clamp is a method to maintain low blood glucose levels by infusing insulin. Glucose is infused at a variable rate to maintain a specific blood glucose level. If the mouse cannot recover from hypoglycemia, more glucose should be infused.
Although there are many advantages to performing hyperglycemic and hypoglycemic clamps, the surgical and experimental procedures are considered technically difficult. Thus, few research groups have been able to do them. We aimed to describe these methods for researchers with financial and workforce constraints to start these experiments at a lower budget.

저자 스포트라이트: 비용 효율적인 고혈당 및 저혈당 클램프 기법을 사용하여 쥐 뇌의 혈당 항상성 조사

의식이 있는 쥐의 고혈당 클램프 및 저혈당 클램프

Our research investigates how our brain regulates the homeo status of blood glucose levels, and what kind of neurons, neuropeptides, and neuron circuits do that. Additionally, how does our memory of food, psychological stress, pain, and other somatic sensations affect it? It is difficult to assess glucose metabolism precisely.We must check in insulin sensitivity or resistance, insulin secretion and counter regulatory responses. We should also check which tissue changes glucose uptake and glucose production regarding insulin sensitivity or resistance. We believe that not only insulin sensitivity, but also insulin secretion and counter regulatory responses are all affecting normal blood glucose levels, even in healthy conditions.We are trying to understand the whole picture of glucose regulation by the brain. Our protocol is low cost and does not need a special and expensive device to create a clamp. It'll enable researchers to implement the use of the clamp easily and quickly.Because this protocol helps researchers to use the clamp very easily, we expect our protocol will encourage more research in the entire field of life sciences.

저혈당 클램프 연구는 실험 시작 시 3시간 동안 금식한 수컷 C57BL/6N 마우스(생후 8주, BW 25g 이상)에서 수행되었습니다(그림 4A,B). 초기 혈당 수치는 136mg/dL(t = -15분)이었습니다. 90mg/dL 미만인 경우 수술이 잘 되지 않았거나 동맥 카테터를 너무 깊게 삽입했거나 혈류에 혈전이 들어갔기 때문일 수 있습니다. 수술 후 쥐의 상태는 쥐의 에너지 대사에 영향을 미칩니다. ...

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고혈당 클램프는 더 높은 혈당 농도를 유지하면서 인슐린 방출을 측정하는 데 사용됩니다. 저혈당 클램프는 역조절 반응에 의해 유도된 포도당 생성을 측정하기 위한 것입니다. 두 방법 모두 동일한 수술 절차를 사용합니다. 여기에서는 전신 포도당 대사를 평가하기 위한 클램프 기술을 제시합니다.

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, ...

우리의 연구는 우리의 뇌가 혈당 수치의 호메오 상태를 어떻게 조절하는지, 그리고 어떤 종류의 뉴런, 신경 펩타이드 및 뉴런 회로가 그렇게 하는지 조사합니다. 또한 음식, 심리적 스트레스, 통증 및 기타 신체 감각에 대한 우리의 기억은 어떤 영향을 미칩니까? 포도당 대사를 정확하게 평가하기는 어렵습니다.인슐린 감수성 또는 저항성, 인슐린 분비 및 조절 반응에 대응해야 합니다. 또한 인슐린 감수성 또는 저항성과 관련하여 포도당 흡수 및 포도당 생성에 어떤 조직이 변화를 일으키는지도 확인해야 합니다. 우리는 인슐린 감수성뿐만 아니라 인슐린 분비 및 반조절 반응이 모두 건강한 조건에서도 정상적인 혈당 수치에 영향을 미친다고 믿습니다.우리는 뇌에 의한 포도당 조절의 전체 그림을 이해하려고 노력하고 있습니다. 우리의 프로토콜은 저렴하며 클램프를 만들기 위해 특별하고 값비싼 장치가 필요하지 않습니다. 이를 통해 연구원은 클램프 사용을 쉽고 빠르게 구현할 수 있습니다.이 프로토콜은 연구자들이 클램프를 매우 쉽게 사용할 수 있도록 도와주기 때문에 당사의 프로토콜이 전체 생명 과학 분야에서 더 많은 연구를 장려할 것으로 기대합니다.

hyperglycemic-clamp-and-hypoglycemic-clamp-in-conscious-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice

845 조회수.  Kumamoto University. 우리의 연구는 우리의 뇌가 혈당 수치의 호메오 상태를 어떻게 조절하는지, 그리고 어떤 종류의 뉴런, 신경 펩타이드 및 뉴런 회로가 그렇게 하는지 조사합니다. 또한 음식, 심리적 스트레스, 통증 및 기타 신체 감각에 대한 우리의 기억은 어떤 영향을 미칩니까? 포도당 대사를 정확하게 평가하기는 어렵습니다.인슐린 감수성 또는 저항성, 인슐린 분비 및 조절 반응에 대...

비디오: 저자 스포트라이트: 비용 효율적인 고혈당 및 저혈당 클램프 기법을 사용하여 쥐 뇌의 혈당 항상성 조사

Diabetes mellitus (DM) is caused by insufficient insulin release from the pancreatic &#946;-cells (Type1 DM) and insulin sensitivity in muscles, liver, and adipose tissues (Type2 DM). Insulin injection treats DM patients but leads to hypoglycemia as a side effect. Cortisol and catecholamines are released to activate glucose production from the liver to recover hypoglycemia, called counter-regulatory responses (CRR). In DM research using rodent models, glucose tolerance tests and 2-deoxy-glucose injection are used to measure insulin release and CRR, respectively. However, blood glucose concentrations change persistently during experiments, causing difficulties in assessing net insulin release and CRR. This article describes a method in which blood glucose is kept at 250 mg/dL or 50 mg/dL in conscious mice to compare the release of insulin and CRR hormones, respectively.
Polyethylene tubing is implanted in the mice's carotid artery and jugular vein, and the mice are allowed to recover from the surgery. The jugular vein tubing is connected to a Hamilton syringe with a syringe pump to enable insulin or glucose infusion at a constant and variable rate. The carotid artery tubing is for blood collection. For the hyperglycemic clamp, 30% glucose is infused into the vein, and blood glucose levels are measured from the arterial blood every 5 min or 10 min. The infusion rate of 30% glucose is increased until the blood glucose level becomes 250 mg/dL. Blood is collected to measure insulin concentrations. For hypoglycemic clamp, 10 mU/kg/min insulin is infused together with 30% glucose, whose infusion rate is variable to maintain 50 mg/dL of blood glucose level. Blood is collected to measure counter-regulatory hormones when both glucose infusion and blood glucose reach a steady state. Both hyperglycemic and hypoglycemic clamps have the same surgical procedure and experimental setups. Thus, this method is useful for researchers of systemic glucose metabolism.

A hyperglycemic clamp is used for measuring insulin release with a maintained higher blood glucose concentration. A hypoglycemic clamp is for measuring glucose production induced by counter-regulatory responses. Both methods use the same surgical procedure. Here, we present a clamp technique to assess systemic glucose metabolism.