Este estudio fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Canada.JS Genoma premios otorgados por el apoyo de los sueldos de Investigación de Alberta Patrimonio Foundationfor médicos, Heart and Stroke Foundation de Canadaand la Asociación Canadiense de Diabetes. Un agradecimiento especial al Dr. David Wasserman y Bracy Bingle para la enseñanza de este procedimiento para el laboratorio de Shearer.

R: El cateterismo quirúrgico de la circulación arterial y venosa Parte 1: Preparación arteriales y venosos del catéter <ol><li> Cortar 15 cm de PE-50 (diámetro interior de 0,58 mm (0.023 &quot;) x un diámetro exterior de 0.965 mm (0.038&quot;). Corte una sección de 1 mm de tubo de silastic (0,76 mm (0,030 &quot;) de diámetro interno x 1.65mm (0.065 &quot;) de diámetro externo) para su uso como restricción de cuentas. La restricción de cuentas impide la rata que se saquen el catéter una vez que esté en su lugar. </li><li> Inserte las puntas de las micro pinza de disección en la luz de la perla de restricción y con cuidado coloque la punta de las pinzas de separación para estirar la abertura más amplia. El uso de otro par de micro pinza de disección, deslice el tubo de silastic en la luz de la restricción de cuentas. Asegurar con pegamento adhesivo fuerte (Loctite Super Glue). El talón debe estar plana alrededor del catéter. Permitir que se seque catéter (24). </li><li> Para una rata de 300 gramos, la línea de la arteria es de ~ 2,7 cm desde el talón de restricción, mientras que la línea es de ~ 3,2 cm yugular. Longitudes de catéter de la restricción se ajustan por 0,5 cm por cada aumento de 100 g en el peso corporal. No bisel de los bordes de la sonda, ya que la punción puede el buque durante la inserción. </li><li> Inmediatamente antes de la cirugía, llenar las líneas con solución salina heparinizada (10U/ml), sellar ambos extremos con un tapón de tubería de acero inoxidable y el lugar en etanol (70%) para esterilizar. Deje secar al aire antes de la inserción. </li></ol> Parte 2: Preparación quirúrgica <ol><li> Procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Calgary y Cuidado de Animales del Comité de Uso y cumplir con las directrices theCanadian Asociación Laboratorio de Ciencias Animales de experimentación. Los procedimientos descritos a continuación se realizaron en adultos, ratas Sprague-Dawley (~ 300 g). Todos los procedimientos se realizan bajo el isoflurano, aunque es posible el uso de anestésicos inyectables. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizan garantizando las técnicas de asepsia. Material quirúrgico, vasos y suero salino heparinizado son esterilizados en autoclave. Guantes quirúrgicos, jeringas y aplicadores con punta de algodón esterilizado se compran al proveedor. </li><li> Pesar la rata y grabar el resultado. El peso será importante en el seguimiento post-quirúrgico de los animales. Sólo los animales que recuperar el peso a los niveles pre-operatorios deben ser utilizados para la experimentación. Anestesiar la rata (3% isoflurano) en una caja de anestesia. Mantener la rata a ~ 2% de isoflurano durante la cirugía con un cono de la nariz. La cirugía debe llevarse a cabo en un área de desinfección que promueve la asepsia. </li><li> Prepara al animal por eliminar el vello de la zona quirúrgica (cuello y hombros). Una pequeña cortadora de cabello o crema depilatoria químicos pueden ser utilizados. Realizar este procedimiento en un área separada de donde la cirugía se lleve a cabo. </li><li> Seguro de los animales a la mesa quirúrgica. Asegúrese de que los animales está completamente anestesiado por la comprobación de la presencia de los reflejos de los pies / los ojos. Preparar los sitios quirúrgicos con un desinfectante de la piel adecuado (70% de etanol seguido por matorrales betadine seguido de 70% de etanol). </li></ol> Parte 3: Cirugía <ol><li> Hacer pequeños de 1 cm verticales incisión media superior a la del esternón (Levante la piel longitudinalmente a lo largo del eje medial con una pinza y se corta con tijera o bisturí). </li><li> Blunt diseccionar con micro pinza de disección para exponer el músculo esternocleidomastoideo izquierdo. Reflejan este músculo para exponer aproximadamente 1 cm de la arteria carótida izquierda. El uso de micro pinza de disección en la arteria carótida para mantener la arteria en su lugar. Suavemente se burlan de tejido conectivo de la arteria carótida. Es importante aislar el nervio vago de la arteria, sin dañar la arteria o el nervio. Aislar la arteria luego ligar el extremo cefálico con sutura de seda 4-0 (esto se usa para manipular la arteria carótida durante la cirugía). Nota: 4-0 suturas deben ser esterilizadas con etanol al 70% antes de su uso. </li><li> Sujetar el vaso con la sierra, micro disección fórceps. Pinchazo al final se liga con un calibre 21 VENOJECT Multi-muestra adaptador Luer. Retire el tapón de tubería de acero inoxidable e inserte con cuidado del catéter con la ayuda de un introductor de catéter estéril a admitirlo en la arteria. Asegurar que el catéter está segura con fórceps, en parte liberación micro pinza de disección de la arteria de sujeción y continuar la inserción del catéter a la perla. En este punto, la punta del catéter debe estar en el arco aórtico. Tenga cuidado de no liberación del catéter, la presión del recipiente lo fuerza a salir. </li><li> Tie dos suturas 4-0 con seguridad por debajo de cuentas y uno por encima y confirmar que el catéter se muestra. Lave la tubería con solución salina heparinizada 10U/ml. Vuelva a conectar el extremo externo del catéter con un tapón de tubería de acero inoxidable. </li><li> Utilizando la misma incisión, la disección roma para exponer la vena yugular externa derecha. Aislar cuidadosamente y ligar el final cefálica con sutura de seda. Practique la punción venosa con un calibre 21 VENOJECT Multi-muestra adaptador Luer. Retire el tapón de tubería de acero inoxidable e insertar catéter estéril con catheter introductor a la perla y corbata dos puntos de sutura por debajo del talón. Ate una tercera sutura por encima de cuentas y confirmar que las muestras. Ras de la vía venosa heparinizada 10U/mL solución salina. Vuelva a conectar el extremo del catéter externo con tapón de tubo de acero inoxidable. </li><li> Túnel de calibre 14 aguja roma en la piel y hacer la incisión en la espalda entre los omóplatos. Hilo de los catéteres a través de la aguja para exteriorizar en la parte posterior de la rata. Aproximadamente 4 cm de la línea es visible. Cortar 0,5 cm de Tygon S-50-HL Tubería médica, lugar en torno a los dos los catéteres exteriorizados y seguro con una cinta según sea necesario (para la vena azul, rojo para las arterias). Retest catéteres para asegurar la permeabilidad, de lavado y llenado con solución salina heparinizada 150U/ml para prevenir la coagulación. </li><li> Cierre todas las incisiones con sutura de seda 3-0. Lugar propenso rata, en la pre-calentado, jaula limpia con la comida en el fondo de la jaula. </li></ol> B: Cuidado Postoperatorio Parte 1: Cuidado postoperatorio inmediato y Monitoreo <ol><li> Una vez que la rata recobra plena capacidad ambulatoria y el estado de alerta regreso de la rata para albergar a los animales. </li><li> Permita que la rata de recuperación durante 3-5 días. </li><li> Monitorear todos los días de la infección, dolor y cambios en el peso. La infección puede ser motivo de preocupación si la descarga de los sitios de incisión, letargo general y / o dolor que se observa. El dolor es indicado por la postura encorvada, el pelo rizado de nuevo y la ausencia de la conducta ambulatoria y / o comer. Una pérdida de peso pueden ser experimentados inmediatamente después de la cirugía hasta tres días después de la cirugía, sin embargo, el peso se estabilizará y / o aumentar en un 10% del peso antes de la cirugía dentro de 5 días. Pérdida de peso severa puede indicar una infección, accidente cerebrovascular y / o dolor. </li><li> Retest catéteres a diario para garantizar la permeabilidad. </li></ol> Parte 2: El mantenimiento de la permeabilidad del catéter <ol><li> Cada día durante la recuperación postoperatoria, llenar las jeringas de 1 ml Consejo Slip con solución salina heparinizada 150U/ml y la tapa con una aguja de calibre 22 contundente. La aguja de punta roma se introduce en 20 cm de tubo de PE-50 con calibre 23 de acero acoplador de tubo de acero en el otro extremo. </li><li> Eliminar las burbujas de aire colocando el extremo con el acoplador de la tubería más alto que el resto de la jeringa de 1 ml y empujar las burbujas fuera de la línea. </li><li> Abrazadera de la línea arterial externalizados de la rata con pinzas hemostáticas justo debajo del tapón. </li><li> Retire el tapón del catéter de acero con el segundo par de pinzas hemostáticas. </li><li> Introduzca el acoplador de la tubería conectada a la jeringa en la línea arterial y la liberación de la hemostatos oclusión del catéter arterial externalizados. </li><li> Aspirar la sangre arterial del catéter en la jeringa. Si la sonda no dibujar fácilmente puede ser necesario para empujar suavemente en una pequeña cantidad de solución de lavado a través del catéter para desalojar a la punta del catéter en caso de que se acuña contra la pared del vaso. El catéter se ha desaparecido por completo cuando la sangre llega a la jeringa. </li><li> Fije el cierre PE-50 tubo a la jeringa de 1 ml y desechar la jeringa. Reemplace con una nueva jeringa llena de solución salina heparinizada fresca 150U/ml. Quite la abrazadera del tubo y la celebración de la nueva jeringa en posición vertical, película de la nueva jeringa con un dedo para eliminar burbujas de aire posible nuevo hacia arriba y lejos de la línea. Nota: Se debe garantizar que las burbujas de aire pueden causar un accidente cerebrovascular. </li><li> Inyectar la solución salina heparinzed 150U/ml hasta la línea del catéter es clara y libre de sangre. </li><li> Abrazadera de la línea arterial externalizados de la rata con pinzas hemostáticas justo debajo de la tubería de acoplamiento. Quitar el conector de la jeringa de la línea del catéter arterial y sustituirlo por el tapón de tubería de acero inoxidable. </li><li> Suelte el hemostatos oclusión del catéter arterial externalizados. </li><li> Repita para la línea venosa. Sin embargo, debido a la muestreo venoso de baja presión no siempre es posible. Si la solución salina heparinzed 150U/ml puede ser infundido con una resistencia mínima, es probable que el catéter está bien colocado en la vena. </li></ol> C: hiperinsulinémico euglucémico Clamp Parte 1: Clamp Set-up y la preparación <ol><li> Pesar la rata y registrar el peso. Esto será necesario para determinar las tasas de infusión de insulina y glucosa. Rápido de la rata, por lo menos 5 horas antes del experimento. Esto garantiza que el animal se encuentra en un estado postprandial y el aporte de glucosa a partir de fuentes de alimentación se reduce al mínimo. Lugar a la rata en un pequeño recipiente / caja con ropa de cama que limita el movimiento excesivo. El animal debe ser capaz de dar la vuelta y el novio libremente. </li><li> Establecer líneas y bombas de infusión como se ve en la Figura 1. P50 longitudes de tubería de conexión son los siguientes: jeringa Y conector es de 8 cm, conector en Y para ratas es de 15 cm, línea arterial es de 20 cm, y la vía venosa es de 10 cm de longitud. Retire los tapones de tubos de acero inoxidable y al ras líneas yugular y arterial para asegurarse de infusión y de muestreo, respectivamente, con solución salina heparinizada 10U/ml. </li><li> Determinar la insulina<html> volumen requerido. Esto variará dependiendo del nivel de insulina y el peso de la rata. Aquí, 4mU/kg/min se administra a una velocidad de 2uL/min. Esta es una dosis fisiológica de alta. Siempre que sea posible, se debe intentar limitar el volumen de infusión. La insulina debe ser diluido apropiadamente y debe ser aplicado en presencia de plasma. Una solución de plasma de rata del 3% en solución salina se utiliza para diluir la insulina en este laboratorio. La insulina es HumulinR 100U/ml (Eli Lily), aunque otro tipo de insulina de acción rápida pueden ser empleados. Asegúrese de que la insulina diluida se mezcla bien antes de poner en la jeringa de infusión. </li><li> Prepare dextrosa al 50%. Esto se puede colocar directamente en la jeringa de la bomba de infusión. Marca de la bomba con &quot;glucosa&quot; para evitar confusiones futuras. Recuerde que debe asegurarse un volumen suficiente de insulina y glucosa para el estudio. Abrazaderas generalmente duran ~ 2h. En el presente Protocolo, las jeringas de 3 ml se utilizan. </li><li> Coloque la glucosa y jeringas de insulina en modelos Harvard Apparatus 11 Plus bombas de jeringa. Anticipación a la glucosa conector en Y y la línea de la abrazadera con una pinza hemostática. Avanzar a la insulina animal, pinza de acuerdo con pinza hemostática. Abrazadera de líneas y permitir que la rata para relajarse durante 30 minutos antes de comenzar el experimento. NOTA: Los protectores de punta Pinzas hemostáticas se sugieren para evitar la permanente de prensado de las líneas. </li><li> Prepare centrifugadora y tubos con EDTA recubiertos para la recolección de plasma. En el presente estudio, las muestras de sangre adicionales se obtendrán una vez que el animal esté sujeto. </li></ol> Parte 2: Protocolo experimental <ol><li> Una muestra de la insulina basal y la muestra de hematocrito se deben adquirir. Muestreo hematocrito asegura el volumen de sangre se mantiene durante todo el experimento. En general, los niveles de hematocrito no debería caer más del 10% del valor inicial. </li><li> Obtener una muestra de la glucosa basal (One Touch Ultra, LifeScan, Inc.) y determinar el nivel de glucosa en sangre entera para que puedan sujetarse. En este sentido, la abrazadera en la euglucemia, o 5.0-5.5mm (Figura 2). Después de cada muestra de sangre, lave la línea arterial con un pequeño volumen de solución salina heparinizada 10U/ml para prevenir la coagulación. NOTA: Asegúrese de que no hay coágulos o burbujas de aire en la línea antes de la infusión. Estos le pueden dar al animal un derrame cerebral. </li><li> Iniciar la infusión de insulina. Tomar la glucosa en sangre a intervalos de 5-10min, monitorización de la glucosa en cada momento. Ajustar la velocidad de infusión de glucosa como sea necesario hasta un estado de equilibrio se logra. Este proceso es generalmente un proceso de ensayo y error y puede tomar 30 minutos a&gt; 2h. Los niveles de glucosa necesaria para mantener la glucemia dependen del protocolo experimental, las especies y las condiciones actuales (Figura 2). </li><li> Constante los niveles de glucosa del Estado son tres lecturas consecutivas dentro de un rango definido. Aquí, tres lecturas realizadas en ~ 1 mm se considera sujeta (por ejemplo, 4,8, 5,2, 5,6 mm). Una vez que el equilibrio se alcanza, registrar la tasa de infusión de glucosa para mantener la glucemia por un período de 30 minutos. Durante este tiempo las muestras de sangre adicionales se pueden obtener. Como mínimo, una muestra de insulina en plasma y segunda muestra de hematocrito se deben obtener. </li><li> Una vez que la abrazadera se ha completado, los animales pueden ser utilizados para la realización de pruebas o la eutanasia y tejidos recogidos para su posterior análisis. Dependiendo del animal, las líneas de catéter puede permanecer patente durante 5-7 días. </li></ol> D: hiperinsulinémico euglucémico (insulina) Resultados Clamp Cuando se realiza correctamente, el procedimiento de clamp evalúa la sensibilidad de la insulina estado constante de la rata. En la presentación de los datos obtenidos de la pinza, es esencial para documentar los niveles de glucosa y las tasas de infusión de glucosa. Estables los niveles de glucosa durante un transcurso de tiempo de un mínimo de 30 minutos (Figura 3) son indicativas de un estado estacionario. La glucosa se considera estable sólo si la glucosa en sangre se mantiene dentro de ~ 1 mm. Las tasas de infusión de glucosa muestran los niveles de glucosa exógena necesaria para mantener la glucemia. Siempre que sea posible, estas cifras se debe mostrar como un curso de tiempo en lugar de solo valor, en promedio (Figura 4). Otras medidas recomendadas para ser reportados son la insulina plasmática y el hematocrito. La determinación de ambos en ayunas y se sujeta los niveles de insulina asegurar que la insulina se ha administrado con éxito y se detectaron diferencias en los niveles entre los grupos de tratamiento (Figura 5). La obtención de medidas de hematocrito al inicio y al final de la pinza de la insulina se sugieren (Figura 6). Esto es para asegurar los niveles de hematocrito no caen más del 5% durante el experimento y las alteraciones que acompañan en el volumen sanguíneo y el flujo no influyen en la utilización de glucosa. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Montaje experimental. La figura 1 muestra la rata sin restricciones, consciente durante el procedimiento de fijación. Los catéteres permiten tomar muestras de sangre e infusiones sin manipulación del animal. Las bombas de la izquierda contiene la insulina y la glucosa. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Esperada de datos durante el procedimiento de fijación. Para obtener una abrazadera en los niveles básicos (euglucemia, 5 mm), los niveles de glucosa exógena (D50) se manipulan hasta la línea de base o &quot;clamp&quot; se logra. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Resultados esperados de glucosa en plasma del procedimiento de fijación. Cuando el animal está &quot;sujeta&quot;, glucosa en la sangre es relativamente estable en el tiempo y los grupos experimentales. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig4.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 4. Representante de las tasas de infusión de glucosa del procedimiento de fijación. La cantidad de glucosa exógena necesaria para mantener la euglucemia diferente. Esto se ilustra con un control (Chow Fed) y de alta alimentados grasa (resistencia a la insulina) los animales. Los animales alimentados con alto contenido de grasa requiere menos glucosa infundida para mantener la glucemia, sobre todo porque no es sensible a la insulina infundida. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Representante de insulina en plasma de la rata. La insulina en plasma durante el clamp de insulina debe ser superior a la insulina en ayunas, plasma de referencia. Esto asegura que se administró insulina adecuadamente a los animales durante el clamp de insulina. <img src="/files/ftp_upload/2432/2432fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Reporte de hematocrito. El hematocrito inicial y el hematocrito después del experimento debe ser obtenido y reportado. Esto asegura que los niveles de hematocrito no caen más del 5% de los niveles de referencia derivados del muestreo excesivo de la sangre arterial.

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Procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Calgary y Cuidado de Animales del Comité de Uso y cumplir con la Asociación Canadiense de directrices Laboratorio de Ciencias Animales de experimentación. Los autores no tienen conflictos de intereses o revelaciones.

Desarrollado inicialmente para la investigación de la sensibilidad a la insulina en los seres humanos, el procedimiento de clamp ha sido adaptada a otras especies como ratas y ratones de laboratorio. La investigación de modelos animales de resistencia a la insulina ofrece una importante ayuda en la comprensión de la fisiopatología de la sensibilidad a la insulina y patologías asociadas, así como la identificación de las intervenciones terapéuticas que tienen valor clínico 1,2. Existen varios métodos...

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr valign="top"><td> Tubos de polietileno Intramedic (PE-50) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 a 170-12B </td><td> Diámetro interno de 0.58 mm (0.023 &quot;) de diámetro x 0.965 mm de exterior (0.038&quot;) </td></tr><tr valign="top"><td> Dow Corning Silastic tubo de laboratorio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11 a 189-15C </td><td> Diámetro interior de 0,76 mm (0,030 &quot;) de diámetro x exterior de 1.65mm (0.065&quot;) </td></tr><tr valign="top"><td> Tygon S-50-HL tubos médicos </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PY2 72-1251 </td><td> Diámetro interno de 3,2 mm (0,125 &quot;) de diámetro x exterior de 4,7 mm (0.1875&quot;) </td></tr><tr valign="top"><td> Loctite Super Glue </td><td> Grand &amp; Toy </td><td> 32237 </td><td> Gel de control </td></tr><tr valign="top"><td> Hoja de bisturí estéril </td><td> VWR </td><td> BD371610 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Pinzas de disección curvas Micro </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 160-20 </td><td> x 2 </td></tr><tr valign="top"><td> Pinzas de disección rectas Micro </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 160-15 </td><td> x 2 </td></tr><tr valign="top"><td> Pinzas hemostáticas curvas </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 105-1135 </td><td> x 2 </td></tr><tr valign="top"><td> Pinzas hemostáticas rectas </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 105-1130 </td><td> x 2 </td></tr><tr valign="top"><td> Guardias hemostato Consejo </td><td> Robbins Instruments, Inc. </td><td> 15.09-2-004 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Tijeras rectas Cirugía </td><td> George Tiemann &amp; Co. </td><td> 105-402 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> VENOJECT Multi-muestra adaptador Luer </td><td> Terumo Medical Products </td><td> 810127A </td><td> Calibre 21, de 1 pulgada </td></tr><tr valign="top"><td> Introductor de catéter estéril </td><td> Becton Dickinson </td><td> 406999 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> De calibre 14 aguja roma </td><td> Becton Dickinson </td><td> 511310 </td><td> Calibre 14, 2 pulgadas </td></tr><tr valign="top"><td> Suturas quirúrgicas estériles </td><td> Johnson &amp; Johnson Medical Productos </td><td> 1679H </td><td> La seda, el tamaño de 3-0 </td></tr><tr valign="top"><td> No estériles de sutura quirúrgica </td><td> Angiotech Pharmaceuticals, Inc. </td><td> SP116 </td><td> La seda, el tamaño de 4-0 </td></tr><tr valign="top"><td> Los hisopos de algodón </td><td> VWR </td><td> 10806-005 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Almohadillas de gasa 4ply </td><td> VWR </td><td> CA43845-062 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Clippers de Pequeños Animales inalámbrico </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 729063 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Isoflurano </td><td> Halocarbonos Products Corp. </td><td> IPN-45 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Anestesia Cesta </td><td> Benson Medical Industries, Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 70% de etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> HC-1000 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Betadine solución antiséptica </td><td> Occidental de distribución de drogas Centre Ltd. </td><td> 105267 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Modelo 11 Plus bomba de jeringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 702208 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Acopladores de tubos de acero inoxidable </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 72-4434 </td><td> Calibre 23, 0.3 pulgadas </td></tr><tr valign="top"><td> Tubos de acero inoxidable Tapones </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 72-4436 </td><td> Calibre 23, 0,5 pulgadas </td></tr><tr valign="top"><td> Las agujas de acero inoxidable Blunt </td><td> Instech Laboratories, Inc. </td><td> LS22 </td><td> Calibre 22 </td></tr><tr valign="top"><td> 60 Grado Y-conectores </td><td> Partes pequeñas </td><td> STCY-22-05 </td><td> Calibre 22 </td></tr><tr valign="top"><td> CritSpin Centrífuga microhematocrito </td><td> Iris Procesamiento de Muestras </td><td> CS12 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Centrifugar Mini </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-090-100 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Tubos micro centrífuga </td><td> VWR </td><td> 53550-778 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 50 ml de tubos de polipropileno centrífuga </td><td> VWR</td><td> 89004-364 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 1 ml jeringas de plástico de deslizamiento Consejo </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> 3 ml de plástico Luerlok jeringas Consejo </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Inyección anticoagulante heparina </td><td> Occidental de distribución de drogas Centre Ltd. </td><td> 102824 </td><td> Fabricante: LEO Pharma Inc. Conc. 1000 UI </td></tr><tr valign="top"><td> EDTA </td><td> Promega Corp. </td><td> V4231 </td><td> 0,5 M, pH 8,0 </td></tr><tr valign="top"><td> Salina </td><td> Occidental de distribución de drogas Centre Ltd. </td><td> ABB7983154 </td><td> Fabricante: Hospira al 0,9% </td></tr><tr valign="top"><td> Dextrosa al 50% </td><td> Vetoquinol </td><td> 8DEX012D </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Humulin-R </td><td> Eli Lilly </td><td> HI-210 </td><td> 100U/ml </td></tr><tr valign="top"><td> Las jeringas de 1 ml de insulina </td><td> Becton Dickinson </td><td> 309311 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Fisherbrand * Hemato-Seal Sellador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-678 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Fisherbrand * Tubos capilares microhematocrito </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-362-574 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> One Touch Strips ultra de prueba </td><td> LifeScan, Inc. </td><td> AW 085-314H </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> One Touch ultra medidor de glucosa en la sangre </td><td> LifeScan, Inc. </td><td> AW 085-314b </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Sodio Pentobarbitol </td><td> CEVA Santé Animale </td><td> 1715 138 </td><td> Conc. 54.7mg/ml </td></tr><tr valign="top"><td> Red Tape Laboratory de etiquetado </td><td> VWR </td><td> 89097-932 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Laboratorio de Etiquetado de cintas azules </td><td> VWR </td><td> 89097-936 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Báscula </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01-913-88 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Vórtice </td><td> VWR </td><td> 58815-234 </td><td></td></tr><tr valign="top"><td> Temporizador </td><td> VWR </td><td> 62344-641 </td><td></td></tr></tbody></table>

hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat

La diabetes tipo 2 (DT2) es el rápido aumento de la prevalencia. Caracterizados por una producción inadecuada de insulina o la incapacidad para utilizar la insulina que produce, los resultados de diabetes tipo 2 en los niveles elevados de glucosa en la sangre. El &quot;patrón oro&quot; en la evaluación de sensibilidad a la insulina es un clamp hiperinsulinémico euglucémico o abrazadera de la insulina. En este procedimiento, la insulina es infundida a una velocidad constante que resulta en una disminución de glucosa en la sangre. Para mantener la glucosa sanguínea a un nivel constante de glucosa exógena (D50) se infunde en la circulación venosa. La cantidad de glucosa infundida para mantener la homeostasis es un indicador de sensibilidad a la insulina. Aquí, se muestra el procedimiento de clamp de básica en el sondaje crónica, rata sin restricciones, consciente. Este modelo permite que la sangre se capturen con un mínimo estrés para el animal. Después de la inducción de la anestesia, una incisión se hace y la arteria carótida común izquierda y la vena yugular derecha se cateteriza. Catéteres insertados se lavan con solución salina heparinizada, a continuación, exteriorizada y seguro. Animales pueden recuperarse durante 4-5 días antes de los experimentos, con el aumento de peso un seguimiento diario. Sólo aquellos animales que recuperar el peso a los niveles pre-operatorios son utilizados para experimentos. En el día del experimento, las ratas en ayuno y conectado a las bombas que contienen insulina y D50. Glucemia basal se evaluó a partir de la línea arterial y se utiliza un punto de referencia durante todo el experimento (euglucemia). Después de esto, la insulina es infundida a una velocidad constante en la circulación venosa. Para que coincida con la caída de la glucosa en la sangre, se infunde D50. Si la tasa de infusión de D50 es mayor que la tasa de captación, un aumento de la glucosa va a producir. Del mismo modo, si la tasa es insuficiente para que coincida con la captación de glucosa en el cuerpo, la caída va a producir. La titulación de glucosa continúa hasta que se estabilicen las lecturas de glucosa se obtienen. Los niveles de glucosa y las tasas de infusión de glucosa estables durante este período son registrados y comunicados. Los resultados proporcionan un índice de sensibilidad de la insulina del cuerpo entero. La técnica puede ser refinado para satisfacer los requisitos específicos experimental. Que se ve reforzada por el uso de trazadores radioactivos que pueden determinar los tejidos a la insulina estimula la captación de glucosa específicos, así como el volumen de negocios de todo el cuerpo la glucosa.

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Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp in the Conscious Rat

El clamp hiperinsulinémico euglucémico es el &quot;patrón oro&quot; para la evaluación de la acción de la insulina. La insulina es infundida a una velocidad constante estimular la absorción de la glucosa. La cantidad de glucosa infundida exógenos para contrarrestar esta caída es indicativo de sensibilidad a la insulina. Aquí, el procedimiento se realiza en una rata consciente, sin restricciones.

Hiperinsulinémico euglucémico pinza en la rata consciente

Type 2 diabetes (T2D) is rapidly rising in prevalence. Characterized by either inadequate insulin production or the inability to utilize insulin produced, ...

hyperinsulinemic-euglycemic-clamp-in-the-conscious-rat

Research

JoVE Journal

Medicine

51.9K vistas.  University of Calgary. El clamp hiperinsulinémico euglucémico es el "patrón oro" para la evaluación de la acción de la insulina. La insulina es infundida a una velocidad constante estimular la absorción de la glucosa. La cantidad de glucosa infundida exógenos para contrarrestar esta caída es indicativo de sensibilidad a la insulina. Aquí, el procedimiento se realiza en una rata consciente, sin restricciones.

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Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

Hiperinsulinémico euglucémico abrazaderas en ratones conscientes, sin freno

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

Investigación

Medicina

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

La angiogénesis en el pulmón de rata isquémico

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Slow-release Drug Delivery through Elvax 40W to the Rat Retina: Implications for the Treatment of Chronic Conditions

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these diseases. Chronic retinal diseases such as retinal oedema or neovascularization usually require multiple intraocular injections to effectively treat the condition. However, the risks associated with these injections increase with repeated delivery of the drug. Therefore, alternative delivery methods need to be established in order to minimize the risks of reinjection. Several other investigations have developed methods to deliver drugs over extended time, through materials capable of releasing chemicals slowly into the eye. In this investigation, we outline the use of Elvax 40W, a copolymer resin, to act as a vehicle for drug delivery to the adult rat retina. The resin is made and loaded with the drug. The drug-resin complex is then implanted into the vitreous cavity, where it will slowly release the drug over time. This method was tested using 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), a glutamate analogue that blocks the light response of the retina. It was demonstrated that the APB was slowly released from the resin, and was able to block the retinal response by 7 days after implantation. This indicates that slow-release drug delivery using this copolymer resin is effective for treating the retina, and could be used therapeutically with further testing.

This paper details how Elvax 40W can be used as a slow-release method for drug delivery to the adult rat retina. The protocol for preparing, loading, and delivering the drug-resin complex to the eye is described.

De liberación lenta Drug Delivery través Elvax 40W a la Rata Retina: Implicaciones para el tratamiento de condiciones crónicas

Diseases of the retina are difficult to treat as the retina lies deep within the eye. Invasive methods of drug delivery are often needed to treat these ...

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

La cateterización de la arteria carótida y la vena yugular para realizar mediciones hemodinámicas, Infusiones y muestras de sangre en un modelo de rata Consciente

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Evaluación transcutánea de la función renal en roedores Conscious

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

The Dimethylnitrosamine Induced Liver Fibrosis Model in the Rat

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg dimethylnitrosamine (DMN), given intraperitoneally for three consecutive days per week. Intraperitoneal injections were performed in the fume hood as DMN is a known hepatoxin and carcinogen. The model has several advantages. Firstly, liver changes can be studied sequentially or at particular stages of interest. Secondly, the stage of liver disease can be monitored by measurement of serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) enzymes. Thirdly, the severity of liver damage at different stages can be confirmed by sacrifice of animals at designated time points, followed by histological examination of Masson&#39;s Trichome stained liver tissues. After four weeks of DMN dosing, the typical fibrosis score is 5 to 6 on the Ishak scale. The model can be reproduced consistently and has been widely used to assess the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

We describe a method to produce an animal model of liver fibrosis in the rat, and assess the degree of fibrosis by histological examination of the liver. The model can be used to study the development of liver disease as well as to test the efficacy of potential anti-fibrotic agents.

La fibrosis hepática Modelo dimetilnitrosamina inducida en la rata

Four to six week old, male Wistar rats were used to produce animal models of liver fibrosis. The process requires four weeks of administration of 10 mg/kg ...

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ischemia/reperfusion (I/R) injury with myriad negative consequences. Potential I/R injury in marginal organs destined for liver transplantation contributes to the current donor shortage secondary to a decreased organ utilization rate. A significant need exists to explore hepatic I/R injury in order to mediate its impact on graft function in transplantation. Rat liver hilar clamp models are used to investigate the impact of different molecules on hepatic I/R injury. Depending on the model, these molecules have been delivered using inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injection, intravenous administration or injection into the peripheral superior mesenteric vein. A rat liver hilar clamp model has been developed for use in studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating I/R injury. The described model for rat liver hilar clamp includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic hepatic segment via a side branch of the portal vein, allowing for direct segmental hepatic delivery. Our approach is to induce ischemia in the left lateral and median lobes for 60 min, during which time the substance under study is infused. In this case, pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD), a free radical scavenger, is infused directly into the ischemic segment. This series of experiments demonstrates that infusion of PEG-SOD is protective against hepatic I/R injury. Advantages of this approach include direct injection of the molecule into the ischemic segment with consequent decrease in volume of distribution and reduction in systemic side effects.

A unique rat liver hilar clamp model was developed for studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating ischemia-reperfusion injury. This model includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic liver segment via a branch of the portal vein, allowing for direct hepatic delivery.

Método de la entrega directa segmentaria intra-hepática utilizando un modelo de hígado de rata hiliar abrazadera

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

Evaluación de la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Multi-system Monitoring for Identification of Seizures, Arrhythmias and Apnea in Conscious Restrained Rabbits

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease and arrhythmias in people with epilepsy (i.e., epileptic heart.) Additionally, cardiac and autonomic disturbances have been reported surrounding seizures. 1:1,000 epilepsy patients/year die of sudden unexpected death in epilepsy (SUDEP). The mechanisms for SUDEP remain incompletely understood. Electroencephalograms (EEG) and electrocardiograms (ECG) are two techniques routinely used in the clinical setting to detect and study the substrates/triggers for seizures and arrhythmias. While many studies and descriptions of this methodology are in rodents, their cardiac electrical activity differs significantly from humans. This article provides a description of a non-invasive method for recording simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography in conscious rabbits. As cardiac electrical function is similar in rabbits and humans, rabbits provide an excellent model of translational diagnostic and therapeutic studies. In addition to outlining the methodology for data acquisition, we discuss the analytical approaches for examining neuro-cardiac electrical function and pathology in rabbits. This includes arrhythmia detection, spectral analysis of EEG and a seizure scale developed for restrained rabbits.

Using simultaneous video-EEG-ECG-oximetry-capnography, we developed a methodology to evaluate the susceptibility of rabbit models to develop provoked arrhythmias and seizures. This novel recording system establishes a platform to test the efficacy and safety of therapeutics and can capture the complex cascade of multi-system events that culminate in sudden death.

Monitoreo multisistema para la identificación de convulsiones, arritmias y apnea en conejos restringidos conscientes

Patients with ion channelopathies are at a high risk of developing seizures and fatal cardiac arrhythmias. There is a higher prevalence of heart disease ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to detect drug exposure. The rat blood sampling method determines the quality of the plasma and further affects the precision of the test results. The subclavian vein blood collection method described in this protocol collects blood samples repeatedly in the conscious state of animals to meet the needs of PK and TK tests. The skills of restraint handling and appropriate procedure of needle incision ensure the success rate of blood collection. It is easy to operate while ensuring the quality of plasma and at the same time catering to animal welfare. However, this method requires skilled operation, and an improper one may cause animal weakness, pain, lameness, and even mortality. The current method has been used in the testing facility for a 4-week oral toxicity study in Sprague Dawley (SD) rats with TK. The maximum amount of blood collected within 24 h did not exceed 20% of the animal's total blood. The animals' body weight was more than 200 g for males and females. The data showed that the animals' bodyweight increased steadily every week, and the clinical observation was normal after repetitive sample collection.

The present protocol describes a simple and efficient method for collecting blood from the subclavian vein in rats. It enables rapid, timely, and easily identifiable sampling without anesthesia and obtains high-quality blood through repetitive sample collection.

Muestreo repetitivo de sangre de la vena subclavia de rata consciente

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...