Los autores agradecen el apoyo financiero del Fondo de Nuevas Fronteras en Investigación (NFRF) de Canadá, el programa Discovery del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y las becas de formación de maestría del Fondo de Investigación de Naturaleza y Tecnologías de Quebec (FRQNT). Los autores también quieren agradecer al grupo del Prof. Yaoyao Zhao en McGill por su apoyo técnico en la impresión 3D de algunos componentes.

La especie de mosquito utilizada para este protocolo es una hembra adulta no infectada de Aedes aegypti (A. aegypti), recibida congelada y almacenada en un congelador a -20 °C. La especie fue proporcionada por el Centro de Recursos de Reactivos de Investigación de Filariasis de NIH/NIAID para su distribución a través de BEI Resources, NIAID, NIH: Aedes aegypti no infectado, cepa Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920. Los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Disección del labio de la probóscide
<ol><li>Con unas pinzas, coloque un mosquito muerto en un portaobjetos de vidrio bajo el microscopio y asegúrese de que haya una punta cónica en el extremo de la probóscide (Figura 2A).</li>
	<li>Mientras mantiene el mosquito en el portaobjetos de vidrio, coloque una hoja de bisturí suavemente sobre el labio cerca de la cabeza del mosquito (Figura 2B).</li>
	<li>Proceda a hacer una incisión a través de toda la mitad superior del labio (un corte de aproximadamente 80 μm) con una profundidad de penetración poco profunda a través del grosor del labio. Asegúrese de aplicar una ligera presión sobre la hoja para cortar solo el labio pero no el fascículo que se encuentra debajo.</li>
	<li>Con un par de pinzas, sujete firmemente la cabeza del mosquito y, con otro par de pinzas de precisión, pellizque ligeramente el labio en cualquier posición entre la punta cónica y la ubicación de la incisión (Figura 2B).<ol><li>Tire de las pinzas que sujetan el labio en la dirección de la punta cónica (Figura 2C). Continúe tirando de las pinzas hasta que el labio se haya desprendido y se haya retirado por completo del fascículo.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque el mosquito bajo el microscopio y verifique si la punta del labrum está presente. Esto se puede identificar por la presencia de una punta cónica en el fascículo (Figura 2D).</li>
</ol>2. Separar la punta del labrum de los demás miembros del fascículo
<ol><li>Sujete y cierre las puntas de un juego de pinzas de precisión y coloque la punta de las pinzas justo al lado del labrum cerca de su punta.</li>
	<li>Utilice la punta de la pinza para aplicar una fuerza suave sobre el labrum en la dirección perpendicular a la longitud del fascículo (Figura 3A).</li>
	<li>Continúe empujando el labrum a través del portaobjetos de vidrio hasta que se logre la separación del labrum de los otros miembros del fascículo.</li>
	<li>Inspeccione la muestra bajo el microscopio para verificar que se haya logrado una separación adecuada entre el labrum y otros miembros del fascículo (Figura 3, izquierda). Si la separación no se realiza correctamente, consulte el paso 2.1.</li>
</ol>3. Cortar la punta del labrum
<ol><li>Mientras el labrum todavía está en el portaobjetos de vidrio, coloque una hoja de bisturí sobre el labrum a aproximadamente ~200 μm de distancia de la punta del labrum (Figura 4A). Aplique suavemente suficiente presión y corte la punta del labrum por completo. Si bien lo ideal es que la punta del labrum sea lo más corta posible, ~ 200 μm es lo mejor que puede manejar el enfoque actual.</li>
	<li>Mida la longitud del labrum cortado para asegurarse de que no supere los 300 μm (Figura 4B) utilizando cualquier software de medición digital. En este protocolo se utilizó ImageJ14.</li>
</ol>4. Agarrar la punta del labrum
<ol><li>Con un par de pinzas de precisión, localice y aísle la punta del labrum en el portaobjetos de vidrio. Deseche todas las partes que queden en el portaobjetos de vidrio que no sean la punta del labrum.</li>
	<li>Con las mismas pinzas de precisión, pellizque lenta y ligeramente el labrum para que el extremo cortado quede libre y no esté obstruido por las pinzas. Además, asegúrese de que la orientación del labrum sea paralela a la dirección de la longitud de las pinzas y que el extremo cortado del labrum apunte en dirección opuesta al cuerpo de las pinzas.</li>
	<li>Una vez que la muestra esté firmemente apretada, retire la fuerza de sujeción que mantiene unidas las puntas de las pinzas. La punta del labrum se pegará a una de las puntas de las pinzas.</li>
	<li>Bajo un microscopio, inspeccione las puntas de las pinzas y asegúrese de que la punta del labrum esté presente en una de las puntas de las pinzas (Figura 5). Si la punta del labrum no está en las pinzas, consulte el paso 4.2, y si la punta del labrum no está en las pinzas ni en el portaobjetos de vidrio, consulte el paso 1.</li>
</ol>5. Aplicación de epoxi en la viga en voladizo sin punta
<ol><li>Coloque una gota (~0,05 ml) de epoxi en el borde de un nuevo portaobjetos de vidrio fundiendo directamente el adhesivo desde su botella/recipiente original. Coloque el portaobjetos de vidrio que contiene epoxi debajo de la estación de sonda y concéntrelo.</li>
	<li>Monte el voladizo AFM sin punta en el conjunto de abrazadera asegurando la base (es decir, el extremo más grande), dejando el extremo del voladizo libre y suspendido en el espacio. Asegúrese de que la parte inferior del voladizo AFM esté hacia abajo.</li>
	<li>Monte el manipulador en la estación de sonda.</li>
	<li>Eleve el eje Z del manipulador a una posición en la que el voladizo sin punta esté unos milímetros por encima del portaobjetos de vidrio que contiene epoxi.</li>
	<li>Mueva manualmente el manipulador de modo que el voladizo sin punta sea visible en la vista de campo de la cámara en la estación de sonda.</li>
	<li>Con el manipulador, mueva el voladizo AFM a lo largo de las direcciones X e Y hasta que la punta del voladizo descanse directamente sobre el epoxi en el borde del portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Usando el manipulador nuevamente, baje lentamente el voladizo sin punta en la dirección Z sobre el borde del portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>A medida que el voladizo se baja y se acerca al portaobjetos de vidrio, siga bajando el voladizo muy lentamente hasta que primero toque el epoxi. No baje más el voladizo.</li>
	<li>Con cuidado, active el manipulador para mover lentamente el voladizo en la dirección X o Y y retire el voladizo del charco de epoxi moviendo continuamente el voladizo en la dirección seleccionada hasta que el voladizo esté completamente separado del epoxi en el portaobjetos de vidrio. El voladizo sin punta debe tener una burbuja en miniatura de epoxi en su punta, visible debajo de la estación de sonda.</li>
	<li>Levante el voladizo en la dirección Z con el manipulador.</li>
</ol>6. Unir la punta del labrum a la viga en voladizo sin punta
<ol><li>Gire el manipulador alrededor del eje largo del voladizo 90 grados y apoye el manipulador en la estación de sonda de lado. En esta configuración, los espesores a lo largo de la longitud del voladizo AFM están en la dirección vertical.</li>
	<li>Coloque las pinzas de precisión que contienen la punta del labrum debajo de la cámara de la estación de sonda de modo que toda la longitud de la punta del labrum sea visible en el monitor de la computadora.</li>
	<li>Coloque el conjunto del manipulador que sujeta la abrazadera y el voladizo sin punta debajo de la cámara de la estación de sonda de modo que toda la longitud del voladizo sin punta sea visible en el monitor de la computadora.</li>
	<li>Enfoque el microscopio de la estación de sonda en la punta del labrum y en el voladizo sin punta.</li>
	<li>Oriente el voladizo perpendicularmente a la punta del labrum girando cuidadosa y manualmente el manipulador (Figura 6A).</li>
	<li>Usando los grados de libertad del manipulador, mueva lentamente el voladizo sin punta en las direcciones XY de modo que el pegamento del voladizo haga contacto con el extremo cortado de la punta del labrum (Figura 6B).</li>
	<li>Cura el epoxi, solidificando la intersección entre el voladizo y el labrum de los mosquitos.</li>
	<li>Una vez que el epoxi se haya curado, enganche suavemente el manipulador en las direcciones XY y aleje el voladizo de las pinzas, verificando que la punta del labrum esté ahora en la viga del voladizo sin punta (Figura 6C).</li>
</ol>

Sonda AFM biohíbrida con labrum de mosquitos para estudiar los comportamientos de picadura

<ol>
	<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+vector+control+response+2017&#8211;2030.">Global vector control response 2017&#8211;2030.</a> World Health Organization. , (2017).</li><li>Gurera, D., Bhushan, B., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+mosquitoes&#8217;+painless+piercing.">Lessons from mosquitoes&#8217; painless piercing.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 84, 178-187 (2018).</li><li>Ma, G., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle,+bio-microneedle+and+bio-inspired+microneedle:+A+review.">Microneedle, bio-microneedle and bio-inspired microneedle: A review.</a> Journ of Contr Relea. 251, 11-23 (2017).</li><li>Kong, X., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronano+structure+and+mechanics+behavior+of+mosquito&#8217;s+proboscis+biomaterials+with+applications+to+microneedle+design.">Micronano structure and mechanics behavior of mosquito&#8217;s proboscis biomaterials with applications to microneedle design.</a> Advan Mater Res. 299-300, 376-379 (2011).</li><li>Li, A. D. R., Putra, K. B., Chen, L., Montgomery, J. S., Shih, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis-inspired+needle+insertion+to+reduce+tissue+deformation+and+organ+displacement.">Mosquito proboscis-inspired needle insertion to reduce tissue deformation and organ displacement.</a> Sci Rep. 10 (1), 12248 (2020).</li><li>Meyer, E., Hug, H. J., Bennewitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Scanning+Probe+Microscopy.">Introduction to Scanning Probe Microscopy.</a> Scanning Probe Microscopy. 1, 1-13 (2004).</li><li>Garc&#237;a, R., Per&#233;z, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+atomic+force+microscopy+methods.">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf Sci Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li><li>Thurner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+and+indentation+force+measurement+of+bone.">Atomic force microscopy and indentation force measurement of bone.</a> WIREs Nanomed and Nanobio. 1 (6), 624-649 (2009).</li><li>M&#252;ller, D. J., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nat Nanotech. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Hussain, D., Ahmad, K., Song, J., Xie, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+atomic+force+microscopy+for+-critical+dimension+metrology.">Advances in the atomic force microscopy for -critical dimension metrology.</a> Meas Sci Technol. 28 (1), 012001 (2017).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+proboscis:+An+elegant+biomicroelectromechanical+system.">Mosquito proboscis: An elegant biomicroelectromechanical system.</a> Phys Rev E. 82 (1), 011910 (2010).</li><li>Kong, X. Q., Wu, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+prediction+of+insertion+force+for+the+mosquito.">Measurement and prediction of insertion force for the mosquito.</a> J Bionic Eng. 6 (2), 143-152 (2009).</li><li>Ramasubramanian, M. K., Barham, O. M., Swaminathan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+a+mosquito+bite+with+applications+to+microneedle+design.">Mechanics of a mosquito bite with applications to microneedle design.</a> Bioinspir Biomim. 3 (4), 046001 (2008).</li><li>Dai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+surface+measurements+at+sidewalls+of+nano-+and+micro-structures.">Nanoscale surface measurements at sidewalls of nano- and micro-structures.</a> Measur Sci and Technol. 18 (2), 334-341 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

El paso 1 del protocolo está destinado a limpiar la muestra biológica del labio no deseado. Para ello, se realiza una incisión en el labio, pero no en el fascículo, que descansa directamente debajo del labio (Figura 1). Debido a que el fascículo y el labio no están unidos en su interfaz (es decir, el labio puede deslizarse libremente a lo largo del fascículo y solo se mantiene en su lugar mediante su unión a la cabeza del mosquito), la incisión realizada está destinada a separar pa...

La Organización Mundial de la Salud (OMS) informó que las enfermedades transmitidas por vectores (VBD) representan más del 17% de todas las enfermedades infecciosas, que causan más de 7.00.000 muertes por año en todo el mundo. Por ejemplo, como el animal más mortífero del mundo, los mosquitos propagan numerosos patógenos, como el dengue, la malaria y el zika, a través de los artrópodos que se alimentan de sangre, lo que resulta en 700 millones de infeccionescada año. Las exploraciones hacia el desarrollo de medidas efectivas para prevenir las VBD son de crucial importancia, incluida la imitación de los comportamientos de penetración de los mosquitos para investigar sus mecanismos de picadura y estudios de barreras potenciales para demostrar su eficacia en la prevención de la penetración. Un desafío clave es desarrollar enfoques adecuados para llevar a cabo tales investigaciones. Se han realizado esfuerzos en la literatura, incluido el desarrollo de agujas a microescala que se asemejan a la geometría de un aguijón de mosquito; sin embargo, muchos de los materiales utilizados para fabricar estas microagujas (es decir, materiales viscoelásticos2, silicio (Si), vidrio, cerámica3, etc.) tienen propiedades mecánicas diferentes a las del material biológico de la probóscide del mosquito. Los materiales de ingeniería pueden ser frágiles y propensos a fracturarse y pandearse 3,4, mientras que la probóscide del mosquito puede resistir mejor la fractura o el pandeo4. La ventaja de tener una sonda biohíbrida que utiliza el labrum de un mosquito en lugar de materiales de ingeniería es que puede ser una representación más precisa del mecanismo de perforación de los mosquitos. Además, se deben integrar herramientas especializadas con microagujas para realizar estudios cuantitativos, como la medición precisa de la fuerza5, que no se puede lograr fácilmente con configuraciones personalizadas que utilizan microagujas diseñadas.
El enfoque basado en la microscopía de fuerza atómica (AFM) es prometedor porque funciona mediante el empleo de un voladizo con una punta ultrafina que se coloca cuidadosamente cerca de la superficie de una muestra. La punta puede escanear a través o ser presionada hacia/dentro de una superficie, experimentando diferentes fuerzas de atracción o repulsión debido a sus interacciones con una muestra6. Estas interacciones conducen a la deflexión del voladizo, que es rastreada por el reflejo de un rayo láser desde la parte superior del voladizo en un fotodetector6. La excepcional sensibilidad al movimiento del sistema permite a AFM realizar una amplia gama de mediciones, que incluyen, entre otras, el mapeo morfológico con precisión de pisómetro, mediciones de fuerza que van desde piconewtons hasta micronewtons, e investigaciones multifísicas exhaustivas7. Por ejemplo, las indentaciones de AFM se pueden realizar para evaluar con precisión la respuesta a la fuerza aplicada de una muestra y también para medir la dureza, elasticidad y otras propiedades mecánicas de una muestra mediante el acoplamiento con modelos analíticos apropiados8. La sonda del AFM está hecha más comúnmente de silicio (Si) o nitruro de silicio (Si3N4)8 con una longitud de 20-300 μm9 y un radio de punta del orden de varios a decenas de nanómetros10. El radio de la punta a escala nanométrica puede ser ideal para aplicaciones como imágenes de alta resolución; Sin embargo, no posee las características de los aguijones biológicos para los estudios que intentan imitar los comportamientos de penetración en términos de rigidez, radio, forma y relación de aspecto. Por ejemplo, la estructura de la microaguja de un mosquito es el fascículo, que tiene una relación de aspecto de ~6011 (longitud ~1,5 mm a 2 mm; diámetro ~30 μm)12. Si bien se puede suponer que una sonda AFM convencional se asemeja a un aguijón biológico como un labrum, sus distintas propiedades y dimensiones del material no reflejarán la situación real durante una mordedura.
Para permitir investigaciones cuantitativas de comportamientos de penetración que imitan mordeduras biológicas de insectos u otros animales con aguijones, aquí se desarrolla un proceso para fabricar voladizos AFM biohíbridos con un aguijón biológico como punta. Como caso de estudio, se demostró con éxito un voladizo de AFM con la punta de un labrum de mosquitos adherida. Aprovechando la información existente de la literatura sobre las fuerzas de inserción típicas que utiliza un mosquito para perforar la piel de una víctima12,13, este voladizo de AFM biohíbrido puede permitir potencialmente la imitación casi real de las picaduras de mosquitos bajo una AFM regular. El protocolo de aprovechamiento de aguijones microbiológicos para fabricar voladizos AFM biohíbridos también se puede aplicar al desarrollo de otros voladizos AFM biohíbridos basados en aguijones afilados para investigaciones cuantitativas de una variedad de mecanismos de mordida.
Terminologías En la Figura 1 se muestra un esquema de una probóscide y sus componentes de interés, y sus definiciones son (1) Probóscide: una parte del cuerpo de la boca de un mosquito que permite que el mosquito se alimente a sí mismo, con una estructura núcleo-concha compuesta por el fascículo (núcleo) y el labio (caparazón), (2) Labio: la cubierta exterior oscura y roma de una probóscide2, (3) Fascículo: un grupo de agujas delgadas contenidas en el interior del labio, incluyendo dos maxilares, dos mandíbulas, una hipofaringe y un labrum2, (4) Hipofaringe: responsable de secretar saliva en el torrente sanguíneo del huésped2, (5) Maxilares: miembro dentado que ayuda en el mecanismo de alimentación2, (5) Mandíbulas: similares al maxilar, ayudan al mosquito en el mecanismo de alimentación y tienen una punta afilada2, (6) Labrum: el miembro principal para penetrar la piel de una víctima, que es mucho más grande que los maxilares, las mandíbulas y la hipofaringe. También tiene estructuras sensoriales que le permiten encontrar vasos sanguíneos y canales internos debajo de la piel2, (7) Manipulador: un conjunto con tres grados de libertad y precisión a escala de micras para el posicionamiento, lo que permite el movimiento en direcciones XYZ, (8) Conjunto de abrazadera: una abrazadera de 2 partes hecha a medida montada en el manipulador utilizada para sujetar el voladizo AFM sin punta durante el experimento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For manipulating/dissecting the proboscis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-4D Probe station</td>
			<td>Everbeing Int&#8217;l Corp&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Used for AFM assembly.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tipless Tapping Mode Cantilever</td>
			<td>NanoAndMore USA</td>
			<td>TL-NCH</td>
			<td>AFM cantilever used for mounting the labrum. 
			Specs are shown here: 
			 
			Shape: Beam 
			Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) 
			Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) 
			Length: 125 &#181;m (115 - 135 &#181;m) 
			Width: 30 &#181;m (22.5 - 37.5 &#181;m) 
			Thickness: 4 &#181;m ( 3 - 5 &#181;m)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Expoxy</td>
			<td>Let&#39;s resin</td>
			<td>ALR00146</td>
			<td>For stinger attachment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of a bio-hybrid mosquito stinger-based atomic force microscopy probe

Los mosquitos, conocidos por ser los animales más mortíferos para los humanos debido a su capacidad de transmitir enfermedades, representan un desafío persistente para la salud pública. La estrategia de prevención primaria que se utiliza actualmente consiste en el uso de repelentes químicos, que a menudo resultan ineficaces ya que los mosquitos desarrollan resistencia rápidamente. En consecuencia, la invención de nuevos métodos preventivos es crucial. Tal desarrollo depende de una comprensión profunda de los comportamientos de picadura de mosquitos, lo que requiere una configuración experimental que replique con precisión escenarios reales de picaduras con parámetros de prueba controlables y mediciones cuantitativas. Para cerrar esta brecha, se diseñó una sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM) biohíbrida, con un aguijón biológico, específicamente, un labrum de mosquitos, como punta. Esta sonda biohíbrida, compatible con los sistemas AFM estándar, permite una simulación casi auténtica de los comportamientos de penetración de los mosquitos. Este método supone un paso adelante en el estudio cuantitativo de los mecanismos de picadura, lo que podría conducir a la creación de barreras eficaces contra las enfermedades transmitidas por vectores (VBD) y abrir nuevas vías en la lucha contra las enfermedades transmitidas por mosquitos.

World Health Organization (WHO) reported that vector-borne diseases (VBDs) account for over 17% of all infectious diseases, which cause more than 7,00,000 deaths per year globally. For example, as the deadliest animal in the world, mosquitoes spread numerous pathogens, such as dengue, malaria, and Zika, through blood-feeding arthropods, resulting in 700 million infections each year1. Explorations toward the development of effective measures to prevent VBDs are of crucial importance, including mimicking the penetration behaviors of mosquitoes to investigate their biting mechanisms and studies of potential barriers to prove their efficacy in preventing penetration. One key challenge is to develop proper approaches to perform such investigations. Efforts have been made in the literature, including the development of micro-scale needles that resemble the geometry of a mosquito stinger; however, many of the materials used to make these microneedles (i.e., viscoelastic materials2, silicon (Si), glass, ceramic3, etc.) have different mechanical properties than the biological material of the mosquito&#39;s proboscis. The engineered materials can be brittle and prone to fracture and buckling3,4, whereas the mosquito&#39;s proboscis can withstand fracture or buckling better4. The benefit of having a bio-hybrid probe using the labrum of a mosquito instead of engineered materials is that it can be a more accurate representation of the piercing mechanism of mosquitoes. Also, specialized tools must be integrated with micro needles to perform quantitative studies, such as the accurate measurement of force5, which is not easily achievable with customized setups using engineered microneedles.
Atomic force microscopy (AFM)-based approach is promising in that it operates by employing a cantilever with an ultra-fine tip that is carefully positioned close to a sample&#39;s surface. The tip can either scan across or be pressed towards/into a surface, experiencing varying attractive or repulsive forces due to its interactions with a sample6. These interactions lead to the cantilever&#39;s deflection, which is tracked by the reflection of a laser beam from the cantilever&#39;s top onto a photodetector6. The exceptional sensitivity to movement of the system enables AFM to conduct a diverse range of measurements, including but not limited to morphological mapping with picometer accuracy, force measurements ranging from piconewtons to micronewtons, and comprehensive multiphysics investigations7. For example, AFM indentations can be performed to precisely assess the response to the applied force of a sample and also to measure the hardness, elasticity, and other mechanical properties of a sample by coupling with appropriate analytical models8. The probe of the AFM is most commonly made of silicon (Si) or silicon nitride (Si3N4)8 with a length of 20-300 &#181;m9 and a tip radius on the order of several to tens of nanometers10. The nanometer scale tip radius can be ideal for applications such as high-resolution imaging; however, it does not possess the characteristics of biological stingers for studies that try to mimic penetration behaviors in terms of stiffness, radius, shape, and aspect ratio. For example, the microneedle structure of a mosquito is the fascicle, which has an aspect ratio of ~6011 (length ~1.5 mm to 2 mm; diameter ~30 &#181;m)12. While a conventional AFM probe can be assumed to resemble a biological stinger like a labrum, its distinct material properties and dimensions will not reflect the real situation during a bite.
To enable quantitative investigations of penetration behaviors mimicking biological bites of insects or other animals with stingers, here, a process to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers with a biological stinger as its tip is developed. As a case study, an AFM cantilever with a mosquito labrum&#39;s tip attached was successfully demonstrated. Harnessing existing information from literature on the typical insertion forces that a mosquito uses to pierce through a victim&#39;s skin12,13, this bio-hybrid AFM cantilever can potentially allow near-real mimicry of mosquito bites under a regular AFM. The protocol of leveraging micro biological stingers to fabricate bio-hybrid AFM cantilevers can also be applied to the development of other sharp stinger-based biohybrid AFM cantilevers for quantitative investigations of a variety of biting mechanisms.
Terminologies 
A schematic of a proboscis and its components of interest are shown in Figure 1, and their definitions are (1) Proboscis: a body part from the mouth of a mosquito that allows the mosquito to feed itself, with a core-shell structure composed of the fascicle(core) and the labium(shell), (2) Labium: the dark and blunt outer cover of a proboscis2, (3) Fascicle: a group of slender needles contained inside of the labium, including two maxillae, two mandibles, a hypopharynx, and a labrum2, (4) Hypopharynx: responsible for secreting saliva into the host&#39;s bloodstream2, (5) Maxillae: serrated member assisting in the feeding mechanism2, (5) Mandibles: similar to the maxilla, they help the mosquito in the feeding mechanism and have a sharp tip2, (6) Labrum: the main member for penetrating the skin of a victim, which is much bigger than the maxillae, mandibles and hypopharynx. It also has sensory structures that allow it to find blood vessels and internal channels under the skin2, (7) Manipulator: an assembly with three degrees of freedom and micron-scale accuracy for positioning, allowing movement in XYZ directions, (8) Clamp assembly: a custom-made 2-part clamp mounted to the manipulator used to clamp the tipless AFM cantilever during the experiment.

Autor destacado: Desarrollo de voladizos AFM biohíbridos para el análisis cuantitativo de los mecanismos de picadura de mosquitos

Desarrollo de una sonda de microscopía de fuerza atómica biohíbrida basada en un aguijón de mosquitos

We're looking to develop an AFM cantilever to potentially quantitatively study the biting mechanisms of the mosquito. Our protocol offers a new method for creating accurate, controllable, and reliable AFM probes in order to study animal biting or stinging processes. Our protocol aims at accurately simulating the animal biting process, causing current methodologies to either be uncontrollable, unreproducible in a reliable manner, or in certain cases completely inaccurate.The impact of our work is twofold. The first, we create a protocol that enables other researchers to fabricate their own custom bio-hybrid AFM cantilevers. Secondly, our work paves the way for creating other protocols that merge testing systems with biological material for creating more realistic testing scenarios.

Las imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de la sonda AFM biohíbrida fabricada se pueden encontrar en la Figura 7. El extremo del labrum se pegó con éxito a la viga en voladizo sin punta. Debido a la curvatura natural de los aguijones de mosquitos y a la operación manual del protocolo presentado, es extremadamente difícil obtener un voladizo con una punta de aguijón perfectamente perpendicular al voladizo. El ángulo descentrado entre el aguijón y una línea central ...

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Las investigaciones cuantitativas y controladas sobre los comportamientos de picadura de insectos son cruciales para diseñar estrategias efectivas para combatir las enfermedades transmitidas por vectores. En este contexto, se introduce un método para fabricar una sonda de microscopía de fuerza atómica (AFM) biohíbrida.

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The ...

Estamos buscando desarrollar un voladizo AFM para estudiar potencialmente cuantitativamente los mecanismos de picadura del mosquito. Nuestro protocolo ofrece un nuevo método para crear sondas AFM precisas, controlables y fiables con el fin de estudiar los procesos de mordedura o picadura de animales. Nuestro protocolo tiene como objetivo simular con precisión el proceso de mordida de los animales, lo que hace que las metodologías actuales sean incontrolables, reproducibles de manera confiable o, en ciertos casos, completamente inexactas.El impacto de nuestro trabajo es doble. En primer lugar, creamos un protocolo que permite a otros investigadores fabricar sus propios voladizos AFM biohíbridos personalizados. En segundo lugar, nuestro trabajo allana el camino para la creación de otros protocolos que fusionan los sistemas de pruebas con material biológico para crear escenarios de prueba más realistas.

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Research

JoVE Journal

Engineering

Development of a Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe

443 vistas.  McGill University. Estamos buscando desarrollar un voladizo AFM para estudiar potencialmente cuantitativamente los mecanismos de picadura del mosquito. Nuestro protocolo ofrece un nuevo método para crear sondas AFM precisas, controlables y fiables con el fin de estudiar los procesos de mordedura o picadura de animales. Nuestro protocolo tiene como objetivo simular con precisión el proceso de mordida de los animales, lo que hace que las metodologías actuales sean incontrolables, reproducibles de manera confia...

Video: Autor destacado: Desarrollo de voladizos AFM biohíbridos para el análisis cuantitativo de los mecanismos de picadura de mosquitos

Mosquitoes, notorious as the deadliest animals to humans due to their capacity to transmit diseases, pose a persistent challenge to public health. The primary prevention strategy currently in use involves chemical repellents, which often prove ineffective as mosquitoes rapidly develop resistance. Consequently, the invention of new preventive methods is crucial. Such development hinges on a thorough understanding of mosquito biting behaviors, necessitating an experimental setup that accurately replicates actual biting scenarios with controllable testing parameters and quantitative measurements. To bridge this gap, a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe was engineered, featuring a biological stinger - specifically, a mosquito labrum - as its tip. This bio-hybrid probe, compatible with standard AFM systems, enables a near-authentic simulation of mosquito penetration behaviors. This method marks a step forward in the quantitative study of biting mechanisms, potentially leading to the creation of effective barriers against vector-borne diseases (VBDs) and opening new avenues in the fight against mosquito-transmitted illnesses.

Quantitative and controlled investigations into insect biting behaviors are crucial for devising effective strategies to combat vector-borne diseases. In this context, a method for fabricating a bio-hybrid atomic force microscopy (AFM) probe is introduced.