Este estudio ha sido financiado por la subvención RTI2018-097617-J-I00 del Ministerio de Ciencia e Innovación y Acción 9 de la Universidad de Jaén a la O.H.O. La subvención PGC2018-096486-B-I00 del Ministerio de Ciencia e Innovación y la subvención H2020-MSCA-ITN-2016-722427 del programa Horizonte 2020 de la UE al M.T. JMG contó con el apoyo de una beca de doctorado del Ministerio de Ciencia de España y la Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884). Tanto el CNIC como el CBMSO cuentan con el apoyo del Ministerio de Ciencia español, y el CNIC cuenta con el apoyo de la Fundación ProCNIC.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal del CNIC y se ajustaron a la legislación vigente, incluida la Directiva de la UE 2010/63EU y la Recomendación 2007/526/CE, tal y como se aplica en la legislación española en virtud del Real Decreto 53/2013. Para este protocolo, se emplearon ratones hembra CD-1 de tipo salvaje de 15 a 21 semanas de edad. Los detalles sobre los animales, los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Preparación de plásmidos y herramientas
<ol><li>En primer lugar, prepare la mezcla de electroporación añadiendo el ADN plasmídico deseado en hielo a una concentración final de 1 μg/μL. A continuación, completar la mezcla añadiendo sacarosa al 6% de concentración final (disuelta en PBS), un colorante biocompatible al 0,01%, y completar con PBS hasta un volumen final de 30 μL. NOTA: Se utiliza aproximadamente 1-2 μL de la mezcla de electroporación por muestra. Escale las proporciones de la mezcla de electroporación de acuerdo con el número de muestras en el experimento. Recuerde que el ADN para la electroporación debe purificarse a partir de cultivos bacterianos, asegurando una estabilidad óptima y un mínimo de contaminantes. Para obtener más detalles sobre los plásmidos utilizados para este estudio, consulte la sección de resultados representativos.</li>
	<li>Prepare el medio de crecimiento complementando el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con un 10 % de suero fetal bovino (FBS), un 2 % de tampón Hepes y un 1 % de penicilina/estreptomicina. Mantenga el medio en una incubadora a 37 °C hasta su uso. Además, caliente 1x PBS a 37 °C, junto con el medio de crecimiento.</li>
	<li>Prepare las agujas estirando un capilar de vidrio de 20 μm de diámetro utilizando un extractor de pipetas con las siguientes condiciones: calor = 550; tirar = 100; velocidad = 250; tiempo = 120. El diámetro final después de la extracción debe estar aproximadamente entre 5-8 μm.</li>
	<li>Configure los parámetros del electroporador en cinco ciclos de 50 ms a 40 V con intervalos de 900 ms. Prepare los electrodos, la pipeta bucal y la aguja roma (Figura 3A). Equipe la pipeta con la aguja para cargar el ADN (Figura 3A).</li>
</ol>2. Disección embrionaria y extracción del corazón
<ol><li>Configura un cruce entre ratones CD-1 de tipo salvaje. A la mañana siguiente, seleccione las hembras que exhiben un tapón vaginal y anote esta hora como día embrionario E0.5. Eutanasia de los animales en el día embrionario E12-12.5 por luxación cervical (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente).</li>
	<li>Extraiga con cuidado el útero del ratón y colóquelo en una toalla de papel seca. A continuación, corte el útero con unas tijeras finas insertando la punta de las tijeras en el lado del mesometrial y pasando lentamente el borde de la hoja por toda su longitud. Exponga las hojas caducas y transfiéralas al medio de crecimiento. Para más detalles, véase el trabajo de Behringer et al.20.</li>
	<li>Diseccionar las deciduae para extraer los embriones, luego colocar los embriones en una placa de Petri de 60 mm con medio de crecimiento tibio. Con unas pinzas finas, corte con cuidado la cola y la cabeza del embrión para que solo quede el tronco del cuerpo. El estadio de los embriones puede verificarse mediante la evaluación de las características anatómicas, tal como lo describen Wong et al.21.</li>
	<li>Luego, extraiga con precaución la mayor cantidad posible de tejido del tronco del embrión sin dañar el corazón ni las arterias pulmonar y aorta. Una vez que el corazón haya sido expuesto, colóquelo inmediatamente en un medio de crecimiento nuevo y cálido y manténgalo en una incubadora a 37 °C hasta la electroporación. NOTA: Mantener la temperatura del corazón es crucial para su supervivencia. Asegúrese de que el medio esté siempre caliente y reemplácelo cada 5-10 minutos. Por otro lado, las muestras pueden manipularse sin mantener la esterilidad, ya que esto no afectará la eficiencia del procedimiento. Tenga en cuenta que el medio de crecimiento contiene antibióticos.</li>
</ol>3. Electroporación cardíaca y cultivo ex vivo 
<ol><li>Cargue aproximadamente 10 μL de mezcla de plásmidos (preparada en el paso 1.1) en la aguja aspirando cuidadosamente con la pipeta bucal.</li>
	<li>Prepare un solo corazón para la electroporación colocándolo en una placa de Petri limpia de 60 mm con 1x PBS estéril calentado a 37 °C. Coloque el plato bajo el microscopio de disección (Figura 3A).</li>
	<li>Prepare los electrodos ajustando la distancia entre los polos positivo y negativo a aproximadamente 4 mm (Figura 3B). NOTA: 4 mm es la distancia de apertura en la que encajan los corazones de ratón E12.5 en los electrodos utilizados en este trabajo. Considere cambiar esta distancia en función de los diferentes tamaños de muestra o especificaciones de electrodos.</li>
	<li>Perforar suavemente la capa más superficial del corazón con la aguja en la pipeta bucal. Pipetear con cuidado 1-2 μL de la mezcla de plásmidos y retirar la aguja. Se pueden realizar múltiples inyecciones para asegurar una penetración óptima, así como para ampliar el número de células electroporadas.</li>
	<li>Sostenga los electrodos en su lugar de modo que el corazón quede ubicado entre ambos polos (Figura 3C). Luego, electropore el corazón con las condiciones especificadas anteriormente. NOTA: Para garantizar la máxima eficiencia de electroporación, es posible cambiar la polaridad de los electrodos y dar otro pulso.</li>
	<li>Transfiera el corazón electroporado a una nueva placa de 12 pocillos que contenga 1 mL de medio de crecimiento y colóquelo a 37 °C, 5% de CO2.</li>
	<li>Repita los pasos 3.1 a 3.6 hasta que todas las muestras del experimento estén electroporadas. Finalmente, incubar todos los corazones en una incubadora a 37 °C, 5% CO2, durante 24 h o hasta el análisis. NOTA: En nuestras manos, los corazones podrían dejarse en cultivo hasta 48 h sin signos aparentes de deterioro (Vídeo Suplementario 1; Película Suplementaria 2; Figura complementaria 1).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig03.jpg"> Figura 3: Configuración de la electroporación. (A) Configuración utilizada para la electroporación. Las flechas rojas indican el electroporador, los electrodos y la placa de Petri donde se electroporan los corazones. (A') Detalle cercano de la aguja de electroporación resaltado en (A) por el rectángulo blanco. (B) Detalle de la distancia ajustada de los electrodos utilizados en los corazones E12.5. (C) Representación esquemática de la electroporación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Clasificación celular y análisis inmunohistoquímico
<ol><li>Para el análisis de clasificación celular de las muestras, prepare un medio de digestión para disociar el tejido mezclando 400 μL de liberasa (5 mg/ml), 300 μL de dispasa (0,1 g/mL), 4 μL de CaCl2 (0,4 μM), 50 μL de MgCl2 (5 μM) y complete hasta 10 mL de DMEM. Manténgalo en hielo hasta su uso. Cada corazón necesita aproximadamente 1 mL de medio de digestión. Ajuste los volúmenes de acuerdo con el número de muestras. NOTA: Para inmunohistoquímica, fije directamente los corazones en 1,5 mL de PFA al 4% durante 2 h a RT o durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, lave los corazones 3 veces con PBS y proceda a los procedimientos histológicos e inmunotinción posteriores. Para un protocolo detallado de inmunohistoquímica, consultar Morris et al.22.</li>
	<li>Transfiera cada corazón en cultivo a un nuevo tubo que contenga 1 mL de medio de digestión helado.</li>
	<li>Para facilitar la disociación, picar el tejido aplicando suavemente el placer con una jeringa 3-4 veces e incubar inmediatamente en una placa caliente a 37 °C, 600 rpm durante 45 min.</li>
	<li>Filtre la mezcla de digestión a través de un colador de células de 70 μm en un nuevo tubo y déjelo vaciar por gravedad. A continuación, recupere el volumen de paso y vuelva a filtrarlo con un filtro de células de 40 μm en un nuevo tubo de 50 mL.</li>
	<li>Agregue 500 μL de suero fetal bovino (FBS) y complete hasta 30 mL con DMEM frío.</li>
	<li>Centrifugar la mezcla a 240 x g durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y coloque el tubo de 50 ml boca abajo sobre una toalla de papel para que se seque por completo. NOTA: Este es un punto conveniente para pausar el experimento congelando la pastilla de celda. Si es así, vuelva a suspender las células con DMSO al 10% en FBS y almacene a -80 °C.</li>
	<li>Para la clasificación de células, vuelva a suspender las células en 300 μL de tampón de clasificación (1% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina en PBS) y agregue 0,3 μL de DAPI (1000x). Realizar la clasificación de celdas.</li>
</ol>

Transgénesis basada en electroporación de células cardíacas en corazones de ratón

<ol>
	<li>Tyser, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat.">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, e17113 (2016).</li><li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+common+progenitor+pool+of+the+epicardium+and+myocardium.">Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium.</a> Science. 371 (6533), eabb2986 (2021).</li><li>Sendra, M., Dom&#237;nguez, J., Torres, M., Oca&#241;a, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells.">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).</li><li>Ivanovitch, K., Temi&#241;o, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis.">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, e30668 (2017).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+functions+in+second+heart+field+to+promote+right+ventricular+growth.">Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth.</a> PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).</li><li>Zimmerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+burden+of+congenital+heart+disease,+1990-2017:+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).</li><li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mending+broken+hearts:+Cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair.">Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Cao, J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+hub+for+heart+regeneration.">The epicardium as a hub for heart regeneration.</a> Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li><li>Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium.">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).</li><li>Hesse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+defines+heterogeneity+of+epicardial+cells+and+fibroblasts+within+the+infarcted+murine+heart.">Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart.</a> eLife. 10, e65921 (2021).</li><li>Streef, T. J., Smits, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+contribution+to+the+developing+and+injured+heart:+Exploring+the+Cellular+composition+of+the+epicardium.">Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 750243 (2021).</li><li>Sanchez-Fernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+epicardial+cell+heterogeneity+during+cardiogenesis+and+heart+regeneration.">Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376 (2023).</li><li>Quijada, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+endothelial+cell+positioning+and+fate+specification+by+the+epicardium.">Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium.</a> Nat Commun. 12 (1), 4155 (2021).</li><li>Mantri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+RNA+sequencing+of+developing+chicken+hearts+identifies+interplay+between+cellular+differentiation+and+morphogenesis.">Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis.</a> Nat Commun. 12 (1), 1771 (2021).</li><li>Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeobox+gene+Meis1+modulates+cardiovascular+regeneration.">Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).</li><li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pbx/Meis+deficiencies+demonstrate+multigenetic+origins+of+congenital+heart+disease.">Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease.</a> Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Meis1+act+as+a+new+regulator+of+ischemic+arrhythmias+in+mice.">Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice.</a> J Adv Res. 39, 275-289 (2022).</li><li>Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).</li><li>Wong, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+atlas+of+the+mouse+embryo+for+precise+morphological+staging.">4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging.</a> Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).</li><li>Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdTomato+and+EGFP+identification+in+histological+sections:+Insight+and+alternatives.">TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives.</a> Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).</li><li>Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+myosins:+expression+patterns+and+functional+significance.">Developmental myosins: expression patterns and functional significance.</a> Skelet. Muscle. 5 (1), 22 (2015).</li><li>Eissa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+genes+for+messenger+RNA+quantification+by+real-time+pcr+in+mouse+dextran+sodium+sulfate+experimental+colitis.">Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis.</a> PLOS One. 11 (5), e0156289 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2&#8722;&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2&#8722;&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+using+a+plasmid+construct+expressing+short-hairpin+RNA.">RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA.</a> Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).</li><li>Carmona, R., Barrena, S., L&#243;pez Gambero, A. J., Rojas, A., Mu&#241;oz-Ch&#225;puli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+cell+lineages+and+the+origin+of+the+coronary+endothelium.">Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium.</a> FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).</li><li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+types,+methods+and+strategies:+A+technical+review.">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> Peer J. 9, e11165 (2021).</li><li>Ka&#322;u&#380;na, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+human+heart+ex+vivo-Current+possibilities+and+strive+for+future+applications.">Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications.</a> JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+culture+method+for+the+embryonic+mouse+heart.">A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. 75, e50359 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

En general, la metodología descrita aquí ofrece un marco robusto para expresar constructos transgénicos en el epicardio en desarrollo (Figura 4B), como lo demuestra la sobreexpresión de Meis1 (Figura 4C). Con los constructos apropiados, este protocolo se puede utilizar para evaluar transitoriamente el impacto de la ganancia de función (GOF) o la pérdida de función (LOF) de un gen específico. El LOF se puede implementar en la técnica mediante la transfec...

El corazón es el primer órgano que se forma durante el desarrollo embrionario. Este proceso implica la coordinación espacio-temporal de varias poblaciones de células progenitoras de distintas áreas del embrión. Todo esto ocurre mientras el corazón en desarrollo continúa latiendo y funcionando, enfatizando la notable coordinación requerida para su formación 1,2,3. Dado el papel crucial del corazón, una regulación estricta a nivel celular y molecular es esencial para su correcta formación 4,5. La identificación de los mecanismos que controlan el desarrollo del corazón ha sido de gran interés, ya que son cruciales para desentrañar los trastornos cardíacos congénitos, que afectan a un número sustancial de pacientes en todo el mundo6. Además, comprender el desarrollo del corazón es fundamental para descifrar la regeneración cardíaca, ya que el corazón de los mamíferos postnatales conserva una capacidad regenerativa que se pierde o se ve obstaculizada en la edad adulta 7,8. En consecuencia, la disección de los reguladores moleculares del desarrollo cardíaco es imprescindible para avanzar en los esfuerzos de investigación sobre las cardiopatías congénitas y la regeneración cardíaca.
En la búsqueda de este objetivo, ha habido un creciente enfoque en la investigación del papel del epicardio en el desarrollo y la regeneración cardíaca9. El epicardio es una capa delgada de tejido mesotelial que comprende la capa más externa del corazón de los mamíferos (Figura 1). Estudios recientes han demostrado la importancia del epicardio durante la lesión cardíaca, revelando que este tejido es capaz de enviar señales de proliferación a los cardiomiocitos en el área afectada para mitigar el daño 10,11. A pesar de la importancia del epicardio, la realización de nuevas investigaciones moleculares se ha visto dificultada por su inmensa heterogeneidad. Los experimentos de RNAseq de una sola célula han revelado la heterogeneidad del epicardio, que alberga múltiples subpoblaciones celulares con firmas transcriptómicas distintas 12,13,14,15,16. Por lo tanto, una estrategia para detectar posibles reguladores del desarrollo cardíaco debería acomodar la diversidad de células progenitoras epicárdicas.
En este sentido, la susceptibilidad del modelo murino a la modificación genética ha facilitado la identificación de numerosos genes cruciales para el desarrollo del corazón, permitiendo la generación de líneas mutantes con ganancia de función (GOF) o pérdida de función (LOF) de genes específicos. Sin embargo, estos enfoques implican una inversión considerable de tiempo y recursos experimentales; Por lo tanto, son poco prácticos a la hora de evaluar las funciones de un gran número de genes candidatos. Además, los genes del desarrollo a menudo ejercen funciones pleiotrópicas en diferentes tejidos o son necesarios para el desarrollo embrionario temprano, lo que dificulta la interpretación de su contribución al desarrollo en un proceso específico. Si bien es posible dirigirse a la función génica en estructuras específicas o puntos temporales del desarrollo, esto generalmente requiere el uso de construcciones genéticas más complejas, que pueden ser difíciles de generar o que generalmente no están disponibles.
Para superar estas limitaciones, presentamos una metodología para electroporatar corazones embrionarios de ratón para la transgénesis transitoria (Figura 2). Junto con el cultivo ex vivo y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), esta estrategia demuestra sus capacidades a través del GOF transitorio de Meis1, un gen bien caracterizado implicado en el desarrollo y la regeneración del corazón 17,18,19. En este artículo también se exploran otras posibles aplicaciones de esta metodología, y se discuten sus ventajas y limitaciones, así como se comparan con los protocolos existentes para la modulación transitoria de la expresión génica. Creemos que el marco y los ejemplos visuales presentados mejorarán la comprensión de la biología del epicardio durante el desarrollo y la enfermedad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg"> Figura 1: Capas de corazón embrionario de ratón. Diagrama esquemático de una vista coronal de un corazón embrionario de ratón E13-14. Las tres capas celulares principales del corazón están representadas en amarillo (endocardio), rojo (miocardio) y azul (epicardio). El pericardio está representado en una línea marrón. Las cuatro cavidades del corazón se abrevian como VI, ventrículo izquierdo; VD: ventrículo derecho; LA, aurícula izquierda; AR: aurícula derecha. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg"> Figura 2: Resumen esquemático del protocolo de electroporación cardíaca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm vise table&#160;</td>
			<td>Grandado</td>
			<td>SKU 8798771617573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Policlonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10262</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-6503-82</td>
			<td>1:500 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 Wild Type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Animalary Unit (CNIC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>1:400 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase/collagenase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51032720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stereoscopic Microscope S8AP0</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11524102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller Model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>SU-P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#89689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 &#215; 10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 &#215; 15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reused from old laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>9979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>1:300 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Wave Electroporator CUY21SC</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY664-10X15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided and autoclaved by technical unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes with variable gap</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient transgenesis approach for gene delivery in the mouse embryonic heart

El corazón de los mamíferos es un órgano complejo que se forma durante el desarrollo a través de poblaciones muy diversas de células progenitoras. El origen, el momento del reclutamiento y el destino de estos progenitores son vitales para el correcto desarrollo de este órgano. Los mecanismos moleculares que gobiernan la morfogénesis del corazón son esenciales para comprender la patogenia de las cardiopatías congénitas y la regeneración cardíaca embrionaria. Los enfoques clásicos para investigar estos mecanismos emplearon la generación de ratones transgénicos para evaluar la función de genes específicos durante el desarrollo cardíaco. Sin embargo, la transgénesis del ratón es un proceso complejo y lento que a menudo no se puede realizar para evaluar el papel de genes específicos durante el desarrollo del corazón. Para abordar esto, hemos desarrollado un protocolo para la electroporación eficiente y el cultivo de corazones embrionarios de ratón, lo que permite que la transgénesis transitoria evalúe rápidamente el efecto de la ganancia o pérdida de función de los genes involucrados en el desarrollo cardíaco. Utilizando esta metodología, sobreexpresamos con éxito Meis1 en el corazón embrionario, con preferencia por la transfección de células epicárdicas, demostrando las capacidades de la técnica.

The heart is the first organ formed during embryonic development. This process involves the spatiotemporal coordination of various populations of progenitor cells from distinct areas of the embryo. All this occurs while the developing heart continues to beat and function, emphasizing the remarkable coordination required for its formation1,2,3. Given the crucial role of the heart, tight regulation at the cellular and molecular levels is essential for its proper formation4,5. Identifying the mechanisms that control heart development has been of great interest, as they are crucial for unraveling congenital heart disorders, which impact a substantial number of patients worldwide6. Furthermore, comprehending heart development is pivotal in deciphering cardiac regeneration, as postnatal mammalian hearts retain a regenerative capacity that is lost or hindered in adulthood7,8. Consequently, dissecting molecular regulators of heart development is imperative to advance research efforts on congenital heart disease and cardiac regeneration.
In pursuit of this objective, there has been a growing focus on investigating the role of the epicardium in cardiac development and regeneration9. The epicardium is a thin layer of mesothelial tissue that comprises the outermost layer of the mammalian heart (Figure 1). Recent studies have shown the importance of the epicardium during cardiac injury, revealing that this tissue is able to send proliferation signals to cardiomyocytes in the affected area to mitigate the damage10,11. Despite the importance of the epicardium, conducting further molecular investigations has been challenged by its immense heterogeneity. Single-cell RNAseq experiments have revealed the epicardium&#39;s heterogeneity, housing multiple cell subpopulations with distinct transcriptomic signatures12,13,14,15,16. Thus, a strategy to screen potential regulators of cardiac development should accommodate the diversity of epicardial progenitor cells.
In this sense, the mouse model&#39;s amenability to genetic modification has facilitated the identification of numerous genes crucial for heart development, allowing the generation of mutant lines with gain-of-function (GOF) or loss-of-function (LOF) of specific genes. However, these approaches imply a considerable investment of time and experimental resources; therefore, they are impractical when assessing the roles of a large number of candidate genes. Besides, developmental genes often exert pleiotropic functions in different tissues or are required for early embryonic development, hampering the interpretation of their contribution to development in a specific process. While it is possible to target gene function at specific structures or developmental time points, this usually requires the use of more complex genetic constructions, which can be difficult to generate or are generally unavailable.
To overcome these limitations, we present a methodology to electroporate mouse embryonic hearts for transient transgenesis (Figure 2). Paired with ex vivo culture and fluorescence-activated cell sorting (FACS), this strategy demonstrates its capabilities through transient GOF of Meis1, a well-characterized gene implicated in heart development and regeneration17,18,19. In this article, other potential applications of this methodology are also explored, and its advantages and limitations are discussed, as well as compared to existing protocols for transiently modulating gene expression. We believe the framework and visual examples presented will enhance the understanding of epicardium biology during development and disease.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Mouse embryonic heart layers. Schematic diagram of a coronal view of an E13-14 mouse embryonic heart. The three main cellular layers of the heart are represented in yellow (endocardium), red (myocardium), and blue (epicardium). The pericardium is represented in a brown line. The four chambers of the heart are abbreviated as LV, left ventricle; RV, right ventricle; LA, left atrium; RA, right atrium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg" /> 
Figure 2: Schematic overview of the heart electroporation protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor destacado: Transgénesis de células cardíacas para el cribado rápido de genes

Un enfoque eficiente de transgénesis para la entrega de genes en el corazón embrionario de ratón

We aim to establish a new methodology that facilitates the overexpression or downregulation of a certain gene to understand heart development. Mouse transgenesis is a great investment of time and effort. Assessing genes one by one is not realistic because of this and also because of the high complexity of the genome.Hence, there is a need for a rapid method of screening. We have presented a tool available to any researcher to analyze the gain or loss of function of a candidate gene during heart development. The main advantage of our protocol is that it's much quicker and less expensive than mouse transgenesis.Perhaps it could be used to assess different genes of interest before commencing a transgenesis experiment.

Para demostrar la eficacia de esta técnica en la realización de experimentos de ganancia de función (GOF) para reguladores relevantes del desarrollo cardíaco, se electroporó un constructo que sobreexpresaba el factor de transcripción Meis1. Para ello, se extrajo ARN de embriones E9.5 y se realizó transcripción inversa para obtener ADN complementario (ADNc). Utilizando el ADNc como plantilla, la secuencia codificante de Meis1 se clonó (Tabla suplementaria 1) en un plásmido de ex...

Este protocolo presenta un marco metodológico detallado para la transgénesis de células cardíacas basada en electroporación en corazones de ratón en desarrollo. Los recursos de video que se proporcionan aquí facilitarán el aprendizaje de esta técnica versátil.

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

an-efficient-transgenesis-approach-for-gene-delivery-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

404 vistas.  Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO). Nuestro objetivo es establecer una nueva metodología que facilite la sobreexpresión o la regulación negativa de un determinado gen para entender el desarrollo del corazón. La transgénesis del ratón es una gran inversión de tiempo y esfuerzo. Evaluar los genes uno por uno no es realista por esto y también por la alta complejidad del genoma.Por lo tanto, existe la necesidad de un método rápido de detección. Hemos presentado una herramienta al ...