Diese Studie wurde unterstützt durch das Stipendium RTI2018-097617-J-I00 des spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación und Acción 9 der Universidad de Jaén an das O.H.O. Stipendium PGC2018-096486-B-I00 des spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación und das Stipendium H2020-MSCA-ITN-2016-722427 aus dem EU Horizon 2020-Programm an M.T. JMG wurde durch ein PhD-Stipendium des spanischen Wissenschaftsministeriums und der Fundación Severo Ochoa (PRE2022-101884) unterstützt. Sowohl das CNIC als auch das CBMSO werden vom spanischen Wissenschaftsministerium unterstützt, und das CNIC wird von der ProCNIC-Stiftung unterstützt.

Alle Tierversuche wurden von der CNIC-Ethikkommission für Tierversuche genehmigt und entsprechen den geltenden Rechtsvorschriften, einschließlich der EU-Richtlinie 2010/63EU und der Empfehlung 2007/526/EG, wie sie nach spanischem Recht unter dem Real Decreto 53/2013 durchgesetzt sind. Für dieses Protokoll wurden weibliche Wildtyp-CD-1-Mäuse im Alter von 15-21 Wochen verwendet. Einzelheiten zu den verwendeten Tieren, Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Plasmid- und Werkzeugvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie zunächst die Elektroporationsmischung vor, indem Sie die gewünschte Plasmid-DNA in Eis in einer Endkonzentration von 1 μg/μl hinzufügen. Vervollständigen Sie dann die Mischung, indem Sie Saccharose in einer Endkonzentration von 6 % (gelöst in PBS), einen biokompatiblen Farbstoff in Höhe von 0,01 % und vervollständigen Sie sie mit PBS bis zu einem Endvolumen von 30 μl. HINWEIS: Pro Probe werden ca. 1-2 μl der Elektroporationsmischung verwendet. Skalieren Sie die Anteile der Elektroporationsmischung entsprechend der Anzahl der Proben im Versuch. Bitte denken Sie daran, dass die DNA für die Elektroporation aus der Bakterienkultur gereinigt werden sollte, um eine optimale Stabilität und minimale Verunreinigungen zu gewährleisten. Weitere Einzelheiten zu den für diese Studie verwendeten Plasmiden finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse.</li>
	<li>Bereiten Sie das Wachstumsmedium vor, indem Sie das modifizierte Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 2 % Hepespuffer und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzen. Bewahren Sie das Medium bis zur Verwendung in einem Inkubator bei 37 °C auf. Zusätzlich 1x PBS bei 37 °C erwärmen, zusammen mit dem Wachstumsmedium.</li>
	<li>Bereiten Sie die Nadeln vor, indem Sie eine Glaskapillare mit einem Durchmesser von 20 μm mit einem Pipettenabzieher unter folgenden Bedingungen dehnen: Hitze = 550; Zug = 100; Geschwindigkeit = 250; Zeit = 120. Der Enddurchmesser nach dem Ziehen sollte ca. zwischen 5-8 μm liegen.</li>
	<li>Stellen Sie die Elektroporatorparameter auf fünf 50-ms-Zyklen bei 40 V mit Intervallen von 900 ms ein. Bereiten Sie die Elektroden, die Mundpipette und die stumpfe Nadel vor (Abbildung 3A). Rüsten Sie die Pipette mit der Nadel aus, um die DNA zu laden (Abbildung 3A).</li>
</ol>2. Embryonensektion und Herzentnahme
<ol><li>Richten Sie eine Kreuzung zwischen Wildtyp-CD-1-Mäusen ein. Am nächsten Morgen wählen Sie die Weibchen aus, die einen Vaginalpfropfen aufweisen, und notieren Sie diese Zeit als embryonalen Tag E0.5. Die Tiere am Embryonaltag E12-12,5 durch Zervixluxation einschläfern (nach institutionell anerkannten Protokollen).</li>
	<li>Entnehmen Sie vorsichtig die Gebärmutter aus der Maus und legen Sie sie in ein trockenes Papiertuch. Schneiden Sie anschließend die Gebärmutter mit einer feinen Schere ein, indem Sie die Spitze der Schere in die mesometrische Seite einführen und die Schneide der Klinge langsam über die gesamte Länge führen. Legen Sie die Deziduen frei und übertragen Sie sie auf das Wachstumsmedium. Für weitere Details siehe die Arbeit von Behringer et al.20.</li>
	<li>Präparieren Sie die Deziven, um die Embryonen zu extrahieren, und legen Sie die Embryonen dann in eine 60-mm-Petrischale mit warmem Wachstumsmedium. Schneiden Sie mit einer feinen Pinzette vorsichtig den Schwanz und den Kopf des Embryos ab, so dass nur der Rumpf des Körpers übrig bleibt. Das Stadium der Embryonen kann durch die Beurteilung anatomischer Merkmale überprüft werden, wie von Wong et al.21 beschrieben.</li>
	<li>Entfernen Sie dann mit Vorsicht so viel Gewebe wie möglich aus dem Rumpf des Embryos, ohne das Herz oder die Lungen- und Aortaarterien zu schädigen. Sobald das Herz freigelegt wurde, legen Sie es sofort in ein neues, warmes Wachstumsmedium und bewahren Sie es in einem Inkubator bei 37 °C bis zur Elektroporation auf. HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der Herztemperatur ist entscheidend für sein Überleben. Stellen Sie sicher, dass das Medium immer warm ist und wechseln Sie es alle 5-10 Minuten. Andererseits können Proben ohne Aufrechterhaltung der Sterilität gehandhabt werden, da dies die Effizienz des Verfahrens nicht beeinträchtigt. Bitte beachten Sie, dass das Nährmedium Antibiotika enthält.</li>
</ol>3. Elektroporation des Herzens und Ex-vivo-Kultur 
<ol><li>Es werden ca. 10 μl Plasmidmischung (hergestellt in Schritt 1.1) in die Nadel geladen, indem mit der Mundpipette vorsichtig nach oben gesaugt wird.</li>
	<li>Bereiten Sie ein einzelnes Herz für die Elektroporation vor, indem Sie es in eine saubere 60 mm Petrischale mit sterilem 1x PBS legen, das auf 37 °C erwärmt wurde. Stellen Sie die Schale unter das Präpariermikroskop (Abbildung 3A).</li>
	<li>Bereiten Sie die Elektroden vor, indem Sie den Abstand zwischen dem Plus- und Minuspol auf ca. 4 mm einstellen (Abbildung 3B). HINWEIS: 4 mm ist der Öffnungsabstand, in den E12,5-Mausherzen in die in dieser Arbeit verwendeten Elektroden passen. Bitte erwägen Sie, diesen Abstand basierend auf unterschiedlichen Probengrößen oder Elektrodenspezifikationen zu ändern.</li>
	<li>Stechen Sie vorsichtig mit der Nadel in der Mundpipette in die oberflächlichste Schicht des Herzens. Pipettieren Sie vorsichtig 1-2 μl des Plasmidmixes und entfernen Sie die Nadel. Es können mehrere Injektionen durchgeführt werden, um eine optimale Penetration zu gewährleisten und die Anzahl der elektroporierten Zellen zu erhöhen.</li>
	<li>Halten Sie die Elektroden so fest, dass sich das Herz zwischen beiden Polen befindet (Abbildung 3C). Elektroporate dann das Herz unter den oben genannten Bedingungen. HINWEIS: Um einen maximalen Wirkungsgrad der Elektroporation zu gewährleisten, ist es möglich, die Polarität der Elektroden umzuschalten und einen weiteren Impuls abzugeben.</li>
	<li>Übertragen Sie das elektroporierte Herz in eine neue 12-Well-Platte mit 1 ml Wachstumsmedium und stellen Sie es auf 37 °C, 5 % CO2.</li>
	<li>Die Schritte 3.1 bis 3.6 werden so lange wiederholt, bis alle Proben des Versuchs elektroporiert sind. Zum Schluss werden alle Herzen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 24  Stunden lang oder bis zur Analyse inkubiert. HINWEIS: In unseren Händen konnten Herzen bis zu 48 Stunden in Kultur belassen werden, ohne dass es zu offensichtlichen Anzeichen einer Verschlechterung kam (Ergänzungsfilm 1; Ergänzender Film 2; Ergänzende Abbildung 1).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig03.jpg"> Abbildung 3: Aufbau der Elektroporation. (A) Aufbau für die Elektroporation. Rote Pfeile zeigen den Elektroporator, die Elektroden und die Petrischale an, in der die Herzen elektroporiert werden. (A') Nahaufnahme der Elektroporationsnadel, wie in (A) durch das weiße Rechteck hervorgehoben. (B) Detaillierte Angaben zum eingestellten Abstand der Elektroden, die in E12.5-Herzen verwendet werden. (C) Schematische Darstellung der Elektroporation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
4. Zellsortierung und immunhistochemische Analyse
<ol><li>Für die Zellsortieranalyse der Proben wird ein Verdauungsmedium zur Dissoziation des Gewebes hergestellt, indem 400 μl Liberase (5 mg/ml), 300 μl Dispase (0,1 g/ml), 4 μl CaCl2 (0,4 μM), 50 μl MgCl2 (5 μM) gemischt und bis 10 ml DMEM vervollständigt werden. Bis zur Verwendung auf Eis aufbewahren. Jedes Herz benötigt ca. 1 ml Verdauungsmedium. Passen Sie die Lautstärke entsprechend der Anzahl der Proben an. HINWEIS: Für die Immunhistochemie fixieren Sie die Herzen direkt in 1,5 ml 4% PFA für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C. Waschen Sie die Herzen am nächsten Tag 3x mit PBS und fahren Sie mit nachgeschalteten histologischen und immunfärblichen Verfahren fort. Für ein detailliertes immunhistochemisches Protokoll siehe Morris et al.22.</li>
	<li>Übertragen Sie jedes Herz in Kultur in ein neues Röhrchen mit 1 ml eiskaltem Aufschlussmedium.</li>
	<li>Um die Dissoziation zu erleichtern, hacken Sie das Gewebe durch sanftes Auftragen von Pleasure mit einer Spritze 3-4 Mal und inkubieren Sie es sofort in einer heißen Platte bei 37 °C, 600 U/min für 45 Minuten.</li>
	<li>Filtrieren Sie das Aufschlussgemisch durch ein 70 μm Zellsieb in ein neues Röhrchen und lassen Sie es durch Schwerkraft entleeren. Retten Sie dann das Durchlaufvolumen und filtern Sie es erneut mit einem 40-μm-Zellsieb in ein neues 50-ml-Röhrchen.</li>
	<li>Fügen Sie 500 μl fötales Rinderserum (FBS) hinzu und vervollständigen Sie die Gabe mit kaltem DMEM auf bis zu 30 ml.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Mischung bei 240 x g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entsorgen Sie den Überstand und legen Sie das 50-ml-Röhrchen kopfüber auf ein Papiertuch, um es vollständig zu trocknen. HINWEIS: Dies ist ein praktischer Punkt, um das Experiment durch Einfrieren des Zellpellets zu unterbrechen. Wenn ja, resuspendieren Sie die Zellen mit 10% DMSO in FBS und lagern Sie sie bei -80 °C.</li>
	<li>Für die Zellsortierung resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl Sortierpuffer (1 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin in PBS) und fügen Sie 0,3 μl DAPI (1000x) hinzu. Führen Sie eine Zellsortierung durch.</li>
</ol>

Elektroporationsbasierte Transgenese von Herzzellen in Mausherzen

<ol>
	<li>Tyser, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat.">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, e17113 (2016).</li><li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+common+progenitor+pool+of+the+epicardium+and+myocardium.">Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium.</a> Science. 371 (6533), 2986 (2021).</li><li>Sendra, M., Dom&#237;nguez, J., Torres, M., Oca&#241;a, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells.">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).</li><li>Ivanovitch, K., Temi&#241;o, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis.">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, e30668 (2017).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+functions+in+second+heart+field+to+promote+right+ventricular+growth.">Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth.</a> PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).</li><li>Zimmerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+congenital+heart+disease,+1990-2017:+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).</li><li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mending+broken+hearts:+Cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair.">Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Cao, J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+hub+for+heart+regeneration.">The epicardium as a hub for heart regeneration.</a> Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li><li>Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium.">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).</li><li>Hesse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+defines+heterogeneity+of+epicardial+cells+and+fibroblasts+within+the+infarcted+murine+heart.">Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart.</a> eLife. 10, e65921 (2021).</li><li>Streef, T. J., Smits, A. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+types,+methods+and+strategies:+A+technical+review.">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> Peer J. 9, e11165 (2021).</li><li>Ka&#322;u&#380;na, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+human+heart+ex+vivo-Current+possibilities+and+strive+for+future+applications.">Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications.</a> JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+culture+method+for+the+embryonic+mouse+heart.">A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (75), e50359 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Insgesamt bietet die hier beschriebene Methodik einen robusten Rahmen für die Expression transgener Konstrukte im sich entwickelnden Epikard (Abbildung 4B), wie die Überexpression von Meis1 zeigt (Abbildung 4C). Mit den entsprechenden Konstrukten kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Auswirkungen eines bestimmten Gens auf den Funktionsgewinn (GOF) oder den Funktionsverlust (LOF) vorübergehend zu bewerten. LOF kann in die Technik implementiert werden,...

Das Herz ist das erste Organ, das während der Embryonalentwicklung gebildet wird. Dieser Prozess beinhaltet die räumlich-zeitliche Koordination verschiedener Populationen von Vorläuferzellen aus unterschiedlichen Bereichen des Embryos. All dies geschieht, während das sich entwickelnde Herz weiter schlägt und funktioniert, was die bemerkenswerte Koordination unterstreicht, die für seine Bildung erforderlich ist 1,2,3. Angesichts der entscheidenden Rolle des Herzens ist eine strenge Regulierung auf zellulärer und molekularer Ebene für seine ordnungsgemäße Bildung unerlässlich 4,5. Die Identifizierung der Mechanismen, die die Herzentwicklung steuern, war von großem Interesse, da sie für die Entschlüsselung angeborener Herzfehler von entscheidender Bedeutung sind, von denen eine beträchtliche Anzahl von Patienten weltweit betroffen ist6. Darüber hinaus ist das Verständnis der Herzentwicklung entscheidend für die Entschlüsselung der kardialen Regeneration, da postnatale Säugetierherzen eine Regenerationsfähigkeit behalten, die im Erwachsenenalter verloren geht oder behindert wird 7,8. Daher ist die Entschlüsselung molekularer Regulatoren der Herzentwicklung unerlässlich, um die Forschung zu angeborenen Herzfehlern und Herzregeneration voranzutreiben.
Um dieses Ziel zu erreichen, wurde die Rolle des Epikards bei der kardialen Entwicklung und Regeneration zunehmend in den Fokus gerückt9. Das Epikard ist eine dünne Schicht aus mesothelialem Gewebe, die die äußerste Schicht des Säugetierherzens bildet (Abbildung 1). Jüngste Studien haben die Bedeutung des Epikards bei Herzverletzungen gezeigt und gezeigt, dass dieses Gewebe in der Lage ist, Proliferationssignale an Kardiomyozyten im betroffenen Bereich zu senden, um den Schaden zu mildern10,11. Trotz der Bedeutung des Epikards wurde die Durchführung weiterer molekularer Untersuchungen durch seine immense Heterogenität erschwert. Einzelzell-RNAseq-Experimente haben die Heterogenität des Epikards gezeigt, das mehrere Zellsubpopulationen mit unterschiedlichen transkriptomischen Signaturen beherbergt 12,13,14,15,16. Daher sollte eine Strategie zum Screening potenzieller Regulatoren der kardialen Entwicklung die Vielfalt der epikardialen Vorläuferzellen berücksichtigen.
In diesem Sinne hat die Zugänglichkeit des Mausmodells für genetische Veränderungen die Identifizierung zahlreicher Gene erleichtert, die für die Herzentwicklung entscheidend sind, und die Erzeugung von Mutantenlinien mit Funktionsgewinn (GOF) oder Funktionsverlust (LOF) spezifischer Gene ermöglicht. Diese Ansätze erfordern jedoch einen erheblichen Aufwand an Zeit und experimentellen Ressourcen; Daher sind sie unpraktisch, wenn es darum geht, die Rolle einer großen Anzahl von Kandidatengenen zu beurteilen. Darüber hinaus üben Entwicklungsgene oft pleiotrope Funktionen in verschiedenen Geweben aus oder werden für die frühe Embryonalentwicklung benötigt, was die Interpretation ihres Beitrags zur Entwicklung in einem bestimmten Prozess erschwert. Es ist zwar möglich, die Genfunktion zu bestimmten Strukturen oder Zeitpunkten der Entwicklung zu steuern, aber dies erfordert in der Regel die Verwendung komplexerer genetischer Konstruktionen, die schwer zu generieren oder im Allgemeinen nicht verfügbar sind.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, stellen wir eine Methode zur Elektroporation embryonaler Mausherzen für die transiente Transgenese vor (Abbildung 2). In Kombination mit ex vivo-Kultur und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) demonstriert diese Strategie ihre Fähigkeiten durch die transiente GOF von Meis1, einem gut charakterisierten Gen, das an der Herzentwicklung und -regeneration beteiligt ist 17,18,19. In diesem Artikel werden auch andere potenzielle Anwendungen dieser Methodik untersucht, ihre Vorteile und Grenzen diskutiert sowie mit bestehenden Protokollen zur transienten Modulation der Genexpression verglichen. Wir glauben, dass der Rahmen und die vorgestellten visuellen Beispiele das Verständnis der Epikardbiologie während der Entwicklung und Krankheit verbessern werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Embryonale Herzschichten der Maus. Schematische Darstellung einer koronalen Ansicht eines embryonalen Herzens einer E13-14-Maus. Die drei Hauptzellschichten des Herzens werden in Gelb (Endokard), Rot (Myokard) und Blau (Epikard) dargestellt. Das Perikard ist in einer braunen Linie dargestellt. Die vier Kammern des Herzens werden als LV, linker Ventrikel, abgekürzt; RV, rechter Ventrikel; LA, linkes Atrium; RA, rechter Vorhof. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematische Übersicht des Herzelektroporationsprotokolls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm vise table&#160;</td>
			<td>Grandado</td>
			<td>SKU 8798771617573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Policlonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10262</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-6503-82</td>
			<td>1:500 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 Wild Type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Animalary Unit (CNIC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>1:400 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase/collagenase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51032720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stereoscopic Microscope S8AP0</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11524102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller Model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>SU-P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#89689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 &#215; 10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 &#215; 15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reused from old laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>9979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>1:300 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Wave Electroporator CUY21SC</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY664-10X15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided and autoclaved by technical unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes with variable gap</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient transgenesis approach for gene delivery in the mouse embryonic heart

Das Säugetierherz ist ein komplexes Organ, das während der Entwicklung über sehr unterschiedliche Populationen von Vorläuferzellen gebildet wird. Die Herkunft, der Zeitpunkt der Rekrutierung und das Schicksal dieser Vorläuferzellen sind entscheidend für die richtige Entwicklung dieses Organs. Die molekularen Mechanismen, die die Morphogenese des Herzens steuern, sind essentiell für das Verständnis der Pathogenese angeborener Herzfehler und der embryonalen Herzregeneration. Klassische Ansätze zur Untersuchung dieser Mechanismen nutzten die Erzeugung transgener Mäuse, um die Funktion bestimmter Gene während der kardialen Entwicklung zu beurteilen. Die Transgenese der Maus ist jedoch ein komplexer, zeitaufwändiger Prozess, der oft nicht durchgeführt werden kann, um die Rolle bestimmter Gene während der Herzentwicklung zu beurteilen. Um dies zu beheben, haben wir ein Protokoll für die effiziente Elektroporation und Kultur von embryonalen Herzen von Mäusen entwickelt, das eine transiente Transgenese ermöglicht, um die Auswirkungen des Funktionsgewinns oder -verlusts von Genen, die an der kardialen Entwicklung beteiligt sind, schnell zu beurteilen. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Meis1 im embryonalen Herzen überexprimiert, mit einer Präferenz für die Epikardzelltransfektion, was die Fähigkeiten der Technik demonstriert.

The heart is the first organ formed during embryonic development. This process involves the spatiotemporal coordination of various populations of progenitor cells from distinct areas of the embryo. All this occurs while the developing heart continues to beat and function, emphasizing the remarkable coordination required for its formation1,2,3. Given the crucial role of the heart, tight regulation at the cellular and molecular levels is essential for its proper formation4,5. Identifying the mechanisms that control heart development has been of great interest, as they are crucial for unraveling congenital heart disorders, which impact a substantial number of patients worldwide6. Furthermore, comprehending heart development is pivotal in deciphering cardiac regeneration, as postnatal mammalian hearts retain a regenerative capacity that is lost or hindered in adulthood7,8. Consequently, dissecting molecular regulators of heart development is imperative to advance research efforts on congenital heart disease and cardiac regeneration.
In pursuit of this objective, there has been a growing focus on investigating the role of the epicardium in cardiac development and regeneration9. The epicardium is a thin layer of mesothelial tissue that comprises the outermost layer of the mammalian heart (Figure 1). Recent studies have shown the importance of the epicardium during cardiac injury, revealing that this tissue is able to send proliferation signals to cardiomyocytes in the affected area to mitigate the damage10,11. Despite the importance of the epicardium, conducting further molecular investigations has been challenged by its immense heterogeneity. Single-cell RNAseq experiments have revealed the epicardium&#39;s heterogeneity, housing multiple cell subpopulations with distinct transcriptomic signatures12,13,14,15,16. Thus, a strategy to screen potential regulators of cardiac development should accommodate the diversity of epicardial progenitor cells.
In this sense, the mouse model&#39;s amenability to genetic modification has facilitated the identification of numerous genes crucial for heart development, allowing the generation of mutant lines with gain-of-function (GOF) or loss-of-function (LOF) of specific genes. However, these approaches imply a considerable investment of time and experimental resources; therefore, they are impractical when assessing the roles of a large number of candidate genes. Besides, developmental genes often exert pleiotropic functions in different tissues or are required for early embryonic development, hampering the interpretation of their contribution to development in a specific process. While it is possible to target gene function at specific structures or developmental time points, this usually requires the use of more complex genetic constructions, which can be difficult to generate or are generally unavailable.
To overcome these limitations, we present a methodology to electroporate mouse embryonic hearts for transient transgenesis (Figure 2). Paired with ex vivo culture and fluorescence-activated cell sorting (FACS), this strategy demonstrates its capabilities through transient GOF of Meis1, a well-characterized gene implicated in heart development and regeneration17,18,19. In this article, other potential applications of this methodology are also explored, and its advantages and limitations are discussed, as well as compared to existing protocols for transiently modulating gene expression. We believe the framework and visual examples presented will enhance the understanding of epicardium biology during development and disease.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Mouse embryonic heart layers. Schematic diagram of a coronal view of an E13-14 mouse embryonic heart. The three main cellular layers of the heart are represented in yellow (endocardium), red (myocardium), and blue (epicardium). The pericardium is represented in a brown line. The four chambers of the heart are abbreviated as LV, left ventricle; RV, right ventricle; LA, left atrium; RA, right atrium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg" /> 
Figure 2: Schematic overview of the heart electroporation protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor im Rampenlicht: Transgenese von Herzzellen für schnelles Gen-Screening

Ein effizienter Transgenese-Ansatz für die Genübertragung im embryonalen Herzen der Maus

Um die Wirksamkeit dieser Technik bei der Durchführung von Gain-of-Function (GOF)-Experimenten für relevante Herzentwicklungsregulatoren zu demonstrieren, wurde ein Konstrukt elektroporiert, das den Transkriptionsfaktor Meis1 überexprimiert. Um dies zu erreichen, wurde RNA aus E9,5-Embryonen extrahiert und eine reverse Transkription durchgeführt, um komplementäre DNA (cDNA) zu erhalten. Unter Verwendung der cDNA als Template wurde die Meis1-kodierende Sequenz in ein pCAG-Expressions...

Dieses Protokoll stellt einen detaillierten methodischen Rahmen für die Elektroporations-basierte Transgenese von Herzzellen in sich entwickelnden Mausherzen dar. Die hier bereitgestellten Video-Assets erleichtern das Erlernen dieser vielseitigen Technik.

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

an-efficient-transgenesis-approach-for-gene-delivery-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

433 Aufrufe.  Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO). Unser Ziel ist es, eine neue Methodik zu etablieren, die die Überexpression oder Herunterregulierung eines bestimmten Gens erleichtert, um die Herzentwicklung zu verstehen. Die Transgenese der Maus ist eine große Investition von Zeit und Mühe. Eine einzelne Beurteilung von Genen ist aus diesem Grund und auch wegen der hohen Komplexität des Genoms nicht realistisch.Daher besteht ein Bedarf an einer schnellen Screening-Methode. Wir haben ein Werkzeug...

Serie: Autor im Rampenlicht: Transgenese von Herzzellen für schnelles Gen-Screening

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.