Bu çalışma, İspanyol Ministerio de Ciencia e Innovación'dan RTI2018-097617-J-I00 ve Universidad de Jaén'den Acción 9'a hibe PGC2018-096486-B-I00, İspanyol Ministerio de Ciencia e Innovación'dan hibe -096486-B-I00 ve AB Horizon 2020 programından M.T.'ye H2020-MSCA-ITN-2016-722427 hibe ile desteklenmiştir. JMG, İspanya Bilim Bakanlığı ve Fundación Severo Ochoa'dan (PRE2022-101884) bir doktora bursu ile desteklenmiştir. Hem CNIC hem de CBMSO, İspanya Bilim Bakanlığı tarafından desteklenmektedir ve CNIC, ProCNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Tüm hayvan prosedürleri, CNIC Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı ve 53/2013 sayılı Gerçek Kararname uyarınca İspanyol Yasası tarafından uygulanan AB Direktifi 2010/63EU ve 2007/526/EC sayılı Tavsiye Kararı dahil olmak üzere mevcut mevzuata uygun hale getirildi. Bu protokol için, 15-21 haftalık dişi vahşi tip CD-1 fareleri kullanıldı. Kullanılan hayvanlar, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Plazmit ve alet hazırlama
<ol><li>İlk olarak, istenen plazmit DNA'yı 1 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyonda buza ekleyerek elektroporasyon karışımını hazırlayın. Daha sonra, %6 nihai konsantrasyonda (PBS içinde çözülmüş) sakaroz,% 0.01'de biyouyumlu bir boya ekleyerek karışımı tamamlayın ve 30 μL'lik bir son hacme kadar PBS ile tamamlayın. NOT: Numune başına yaklaşık 1-2 μL elektroporasyon karışımı kullanılır. Elektroporasyon karışımının oranlarını deneydeki numune sayısına göre ölçeklendirin. Elektroporasyon için DNA'nın bakteri kültüründen saflaştırılması gerektiğini, optimum stabilite ve minimum kirletici madde sağladığını lütfen unutmayın. Bu çalışma için kullanılan plazmitler hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen temsili sonuçlar bölümüne bakın.</li>
	<li>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS), %2 Hepes tamponu ve %1 penisilin / streptomisin ile destekleyerek Büyüme Ortamı hazırlayın. Ortamı kullanana kadar 37 ° C'de bir inkübatörde tutun. Ek olarak, büyüme ortamı ile birlikte 1x PBS'yi 37 °C'de ısıtın.</li>
	<li>Aşağıdaki koşullara sahip bir pipet çektirme kullanarak 20 μm çapında bir cam kılcal damarı gererek iğneleri hazırlayın: ısı = 550; çekme = 100; hız = 250; zaman = 120. Çektikten sonraki son çap yaklaşık 5-8 μm arasında olmalıdır.</li>
	<li>Elektroporatör parametrelerini 900 ms aralıklarla 40 V'ta beş adet 50 ms'lik döngüye ayarlayın. Elektrotları, ağız pipetini ve künt iğneyi hazırlayın (Şekil 3A). DNA'yı yüklemek için pipeti iğne ile donatın (Şekil 3A).</li>
</ol>2. Embriyo diseksiyonu ve kalp ekstraksiyonu
<ol><li>Vahşi tip CD-1 fareleri arasında bir çaprazlama ayarlayın. Ertesi sabah, vajinal tıkaç sergileyen dişileri seçin ve bu zamanı embriyonik gün E0.5 olarak not edin. Hayvanları embriyonik gün E12-12.5'te servikal çıkık ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).</li>
	<li>Uterusu fareden dikkatlice çıkarın ve kuru bir kağıt havluya koyun. Bunu takiben, makasın ucunu mezomiyal tarafa sokarak ve bıçağın kenarını tüm uzunluk boyunca yavaşça hareket ettirerek ince bir makas kullanarak uterusu kesin. Desiduae'yi açığa çıkarın ve onları büyüme ortamına aktarın. Daha fazla ayrıntı için lütfen Behringer ve ark.20'nin çalışmasına bakınız.</li>
	<li>Embriyoları çıkarmak için desiduaları inceleyin, ardından embriyoları ılık büyüme ortamına sahip 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. İnce forseps kullanarak, embriyonun kuyruğunu ve başını dikkatlice kesin, böylece sadece vücudun gövdesi kalır. Embriyoların evresi, Wong ve ark.21 tarafından tarif edildiği gibi anatomik özelliklerin değerlendirilmesiyle doğrulanabilir.</li>
	<li>Ardından, kalbe veya pulmoner ve aort arterlerine zarar vermeden embriyonun gövdesinden mümkün olduğunca fazla doku çıkarın. Kalp açığa çıktıktan sonra, hemen yeni, sıcak bir büyüme ortamına koyun ve elektroporasyona kadar 37 ° C'de bir inkübatörde tutun. NOT: Kalbin sıcaklığını korumak, hayatta kalması için çok önemlidir. Ortamın her zaman sıcak olduğundan emin olun ve her 5-10 dakikada bir değiştirin. Öte yandan, prosedürün verimliliğini etkilemeyeceği için numuneler steriliteyi korumadan ele alınabilir. Büyüme ortamının antibiyotik içerdiğini lütfen unutmayın.</li>
</ol>3. Kalp elektroporasyonu ve ex vivo kültür
<ol><li>Yaklaşık 10 μL plazmit karışımını (adım 1.1'de hazırlanmıştır) ağız pipeti ile dikkatlice aspire ederek iğneye yükleyin.</li>
	<li>37 °C'ye ısıtılmış steril 1x PBS ile temiz bir 60 mm Petri kabına yerleştirerek elektroporasyon için tek bir kalp hazırlayın. Çanağı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin (Şekil 3A).</li>
	<li>Pozitif ve negatif kutuplar arasındaki mesafeyi yaklaşık 4 mm'ye ayarlayarak elektrotları hazırlayın (Şekil 3B). NOT: 4 mm, bu çalışmada kullanılan elektrotlara E12.5 fare kalplerinin sığdığı açıklık mesafesidir. Lütfen bu mesafeyi farklı numune boyutlarına veya elektrot özelliklerine göre değiştirmeyi düşünün.</li>
	<li>Ağız pipetindeki iğne ile kalbin en yüzeysel tabakasını nazikçe delin. Plazmit karışımının 1-2 μL'sini dikkatlice pipetleyin ve iğneyi çıkarın. Optimal penetrasyonu sağlamak ve ayrıca elektroporasyonlu hücrelerin sayısını artırmak için çoklu enjeksiyonlar yapılabilir.</li>
	<li>Elektrotları, kalp her iki kutup arasında yer alacak şekilde yerinde tutun (Şekil 3C). Ardından, kalbi yukarıda belirtilen koşullarla elektriklendirin. NOT: Maksimum elektroporasyon verimliliğini sağlamak için, elektrotların polaritesini değiştirmek ve başka bir darbe vermek mümkündür.</li>
	<li>Elektroporasyonlu kalbi 1 mL büyüme ortamı içeren 12 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve 37 ° C,% 5 CO2'ye yerleştirin.</li>
	<li>Deneydeki tüm numuneler elektroporasyonlu olana kadar 3.1 ila 3.6 arasındaki adımları tekrarlayın. Son olarak, tüm kalpleri bir inkübatörde 37 ° C,% 5 CO 2'de 24 saat veya analize kadar inkübe edin. NOT: Ellerimizde, kalpler belirgin bir bozulma belirtisi olmadan 48 saate kadar kültürde bırakılabilir (Ek Film 1; Ek Film 2; Ek Şekil 1).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig03.jpg"> Şekil 3: Elektroporasyon kurulumu. (A) Elektroporasyon için kullanılan kurulum. Kırmızı oklar, kalplerin elektroporasyona tabi tutulduğu elektroporatörü, elektrotları ve Petri kabını gösterir. (Bir') Beyaz dikdörtgen ile (A)'da vurgulandığı gibi elektroporasyon iğnesinin yakın detayı. (B) E12.5 kalplerinde kullanılan elektrotların ayarlanmış mesafesinin detayı. (C) Elektroporasyonun şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Hücre sınıflandırma ve immünohistokimya analizi
<ol><li>Örneklerin hücre sıralama analizi için, 400 μL liberaz (5 mg/ml), 300 μL dispas (0.1 g/mL), 4 μL CaCl2 (0.4 μM), 50 μL MgCl2 (5 μM) ile karıştırarak dokuyu ayırmak için bir sindirim ortamı hazırlayın ve 10 mL DMEM'e kadar tamamlayın. Kullanana kadar buz üzerinde tutun. Her kalbin yaklaşık 1 mL Sindirim Ortamına ihtiyacı vardır. Hacimleri numune sayısına göre ayarlayın. NOT: İmmünohistokimya için, kalpleri RT'de 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de 1.5 mL% 4 PFA'da doğrudan sabitleyin. Ertesi gün, kalpleri 3 kez PBS ile yıkayın ve aşağı akış histolojik ve immün boyama prosedürlerine devam edin. Ayrıntılı bir immünohistokimya protokolü için Morris ve ark.22'ye bakınız.</li>
	<li>Kültürdeki her kalbi 1 mL buz gibi soğuk sindirim ortamı içeren yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Ayrışmayı kolaylaştırmak için, bir şırınga ile 3-4 kez hafifçe uygulayarak dokuyu doğrayın ve hemen 37 ° C, 600 rpm'de 45 dakika boyunca sıcak bir plakada inkübe edin.</li>
	<li>Sindirim karışımını 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir tüpe süzün ve yerçekimi akışıyla boşalmasına izin verin. Ardından, geçiş hacmini kurtarın ve 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak 50 mL'lik yeni bir tüpe tekrar süzün.</li>
	<li>500 μL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin ve soğuk DMEM kullanarak 30 mL'ye kadar tamamlayın.</li>
	<li>Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 240 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve 50 mL'lik tüpü tamamen kuruması için bir kağıt havlunun üzerine baş aşağı yerleştirin. NOT: Bu, hücre peletini dondurarak deneyi duraklatmak için uygun bir noktadır. Eğer öyleyse, hücreleri FBS'de% 10 DMSO ile yeniden süspanse edin ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Hücre sıralaması için, hücreleri 300 μL sıralama tamponunda (% 1 FBS,% 1 penisilin / streptomisin) yeniden süspanse edin ve 0.3 μL DAPI (1000x) ekleyin. Hücre sıralama işlemini gerçekleştirin.</li>
</ol>

Fare Kalplerinde Kardiyak Hücrelerin Elektroporasyona Dayalı Transgenezi

<ol>
	<li>Tyser, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat.">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, e17113 (2016).</li><li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+common+progenitor+pool+of+the+epicardium+and+myocardium.">Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium.</a> Science. 371 (6533), 2986 (2021).</li><li>Sendra, M., Dom&#237;nguez, J., Torres, M., Oca&#241;a, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells.">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).</li><li>Ivanovitch, K., Temi&#241;o, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis.">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, e30668 (2017).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+functions+in+second+heart+field+to+promote+right+ventricular+growth.">Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth.</a> PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).</li><li>Zimmerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+congenital+heart+disease,+1990-2017:+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).</li><li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mending+broken+hearts:+Cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair.">Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Cao, J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+hub+for+heart+regeneration.">The epicardium as a hub for heart regeneration.</a> Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li><li>Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium.">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).</li><li>Hesse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+defines+heterogeneity+of+epicardial+cells+and+fibroblasts+within+the+infarcted+murine+heart.">Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart.</a> eLife. 10, e65921 (2021).</li><li>Streef, T. J., Smits, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+contribution+to+the+developing+and+injured+heart:+Exploring+the+Cellular+composition+of+the+epicardium.">Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 750243 (2021).</li><li>Sanchez-Fernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+epicardial+cell+heterogeneity+during+cardiogenesis+and+heart+regeneration.">Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376 (2023).</li><li>Quijada, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+endothelial+cell+positioning+and+fate+specification+by+the+epicardium.">Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium.</a> Nat Commun. 12 (1), 4155 (2021).</li><li>Mantri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+RNA+sequencing+of+developing+chicken+hearts+identifies+interplay+between+cellular+differentiation+and+morphogenesis.">Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis.</a> Nat Commun. 12 (1), 1771 (2021).</li><li>Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeobox+gene+Meis1+modulates+cardiovascular+regeneration.">Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).</li><li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pbx/Meis+deficiencies+demonstrate+multigenetic+origins+of+congenital+heart+disease.">Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease.</a> Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Meis1+act+as+a+new+regulator+of+ischemic+arrhythmias+in+mice.">Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice.</a> J Adv Res. 39, 275-289 (2022).</li><li>Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).</li><li>Wong, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+atlas+of+the+mouse+embryo+for+precise+morphological+staging.">4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging.</a> Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).</li><li>Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdTomato+and+EGFP+identification+in+histological+sections:+Insight+and+alternatives.">TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives.</a> Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).</li><li>Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+myosins:+expression+patterns+and+functional+significance.">Developmental myosins: expression patterns and functional significance.</a> Skelet. Muscle. 5 (1), 22 (2015).</li><li>Eissa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+genes+for+messenger+RNA+quantification+by+real-time+pcr+in+mouse+dextran+sodium+sulfate+experimental+colitis.">Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis.</a> PLOS One. 11 (5), e0156289 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2&#8722;&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2&#8722;&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+using+a+plasmid+construct+expressing+short-hairpin+RNA.">RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA.</a> Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).</li><li>Carmona, R., Barrena, S., L&#243;pez Gambero, A. J., Rojas, A., Mu&#241;oz-Ch&#225;puli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+cell+lineages+and+the+origin+of+the+coronary+endothelium.">Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium.</a> FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).</li><li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+types,+methods+and+strategies:+A+technical+review.">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> Peer J. 9, e11165 (2021).</li><li>Ka&#322;u&#380;na, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+human+heart+ex+vivo-Current+possibilities+and+strive+for+future+applications.">Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications.</a> JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+culture+method+for+the+embryonic+mouse+heart.">A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (75), e50359 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Genel olarak, burada açıklanan metodoloji, Meis1 aşırı ekspresyonu (Şekil 4C) ile gösterildiği gibi, gelişmekte olan epikarddaki transgenik yapıları ifade etmek için sağlam bir çerçeve sunar (Şekil 4B). Uygun yapılarla, bu protokol, belirli bir genin fonksiyon kazancının (GOF) veya fonksiyon kaybının (LOF) etkisini geçici olarak değerlendirmek için kullanılabilir. LOF, RNA interferansı26 yoluyla bir aday geni hed...

Kalp, embriyonik gelişim sırasında oluşan ilk organdır. Bu süreç, embriyonun farklı bölgelerinden çeşitli progenitör hücre popülasyonlarının uzay-zamansal koordinasyonunu içerir. Bütün bunlar, gelişmekte olan kalp atmaya ve çalışmaya devam ederken meydana gelir ve oluşumu için gereken olağanüstü koordinasyonu vurgular 1,2,3. Kalbin kritik rolü göz önüne alındığında, düzgün oluşumu için hücresel ve moleküler seviyelerde sıkı düzenleme şarttır 4,5. Kalp gelişimini kontrol eden mekanizmaların belirlenmesi, dünya çapında önemli sayıda hastayı etkileyen konjenital kalp bozukluklarının çözülmesi için çok önemli olduğu için büyük ilgi görmüştür6. Ayrıca, doğum sonrası memeli kalpleri yetişkinlikte kaybedilen veya engellenen bir rejeneratif kapasiteyi koruduğundan, kalp gelişimini anlamak kardiyak rejenerasyonun deşifre edilmesinde çok önemlidir 7,8. Sonuç olarak, konjenital kalp hastalığı ve kardiyak rejenerasyon ile ilgili araştırma çabalarını ilerletmek için kalp gelişiminin moleküler düzenleyicilerinin diseksiyonu zorunludur.
Bu amaç doğrultusunda, epikardiumun kardiyak gelişim ve rejenerasyondaki rolünü araştırmaya artan bir odaklanma olmuştur9. Epikardium, memeli kalbinin en dış tabakasını oluşturan ince bir mezotelyal doku tabakasıdır (Şekil 1). Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kardiyak yaralanma sırasında epikardın önemini göstermiş ve bu dokunun hasarı hafifletmek için etkilenen bölgedeki kardiyomiyositlere proliferasyon sinyalleri gönderebildiğini ortaya koymuştur10,11. Epikardın önemine rağmen, daha fazla moleküler araştırma yapmak, muazzam heterojenliği nedeniyle sorgulanmıştır. Tek hücreli RNAseq deneyleri, farklı transkriptomik imzalara sahip çoklu hücre alt popülasyonlarını barındıran epikardın heterojenliğini ortaya çıkarmıştır 12,13,14,15,16. Bu nedenle, kardiyak gelişimin potansiyel düzenleyicilerini taramak için bir strateji, epikardiyal progenitör hücrelerin çeşitliliğini barındırmalıdır.
Bu anlamda, fare modelinin genetik modifikasyona yatkınlığı, kalp gelişimi için çok önemli olan çok sayıda genin tanımlanmasını kolaylaştırmış ve belirli genlerin işlev kazancı (GOF) veya işlev kaybı (LOF) ile mutant hatların oluşturulmasına izin vermiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar önemli bir zaman ve deneysel kaynak yatırımı anlamına gelir; bu nedenle, çok sayıda aday genin rollerini değerlendirirken pratik değildirler. Ayrıca, gelişimsel genler genellikle farklı dokularda pleiotropik işlevler gösterir veya erken embriyonik gelişim için gereklidir, bu da belirli bir süreçte gelişime katkılarının yorumlanmasını engeller. Gen fonksiyonunu belirli yapılarda veya gelişimsel zaman noktalarında hedeflemek mümkün olsa da, bu genellikle üretilmesi zor olabilen veya genellikle mevcut olmayan daha karmaşık genetik yapıların kullanılmasını gerektirir.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, geçici transgenez için fare embriyonik kalplerini elektropore etmek için bir metodoloji sunuyoruz (Şekil 2). Ex vivo kültür ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile eşleştirilen bu strateji, kalp gelişimi ve rejenerasyonunda rol oynayan iyi karakterize edilmiş bir gen olan Meis1'in geçici GOF yoluyla yeteneklerini gösterir 17,18,19. Bu makalede, bu metodolojinin diğer potansiyel uygulamaları da araştırılmakta ve avantajları ve sınırlamaları tartışılmakta ve ayrıca gen ekspresyonunu geçici olarak modüle etmek için mevcut protokollerle karşılaştırılmaktadır. Sunulan çerçeve ve görsel örneklerin, gelişim ve hastalık sırasında epikard biyolojisinin anlaşılmasını geliştireceğine inanıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg"> Resim 1: Fare embriyonik kalp katmanları. Bir E13-14 fare embriyonik kalbinin koronal görünümünün şematik diyagramı. Kalbin üç ana hücresel tabakası sarı (endokard), kırmızı (miyokard) ve mavi (epikard) ile temsil edilir. Perikard kahverengi bir çizgi ile temsil edilir. Kalbin dört odacığı LV, sol ventrikül olarak kısaltılır; RV, sağ ventrikül; LA, sol atriyum; RA, sağ atriyum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg"> Şekil 2: Kalp elektroporasyon protokolüne şematik genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm vise table&#160;</td>
			<td>Grandado</td>
			<td>SKU 8798771617573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Policlonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10262</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-6503-82</td>
			<td>1:500 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 Wild Type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Animalary Unit (CNIC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>1:400 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase/collagenase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51032720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stereoscopic Microscope S8AP0</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11524102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller Model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>SU-P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#89689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 &#215; 10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 &#215; 15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reused from old laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>9979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>1:300 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Wave Electroporator CUY21SC</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY664-10X15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided and autoclaved by technical unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes with variable gap</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient transgenesis approach for gene delivery in the mouse embryonic heart

Memeli kalbi, gelişim sırasında çok çeşitli progenitör hücre popülasyonları yoluyla oluşan karmaşık bir organdır. Bu ataların kökeni, işe alınma zamanlaması ve kaderi, bu organın düzgün gelişimi için hayati önem taşır. Kalbin morfogenezini yöneten moleküler mekanizmalar, konjenital kalp hastalıklarının ve embriyonik kardiyak rejenerasyonun patogenezini anlamak için gereklidir. Bu mekanizmaları araştırmak için klasik yaklaşımlar, kardiyak gelişim sırasında spesifik genlerin işlevini değerlendirmek için transgenik farelerin neslini kullanmıştır. Bununla birlikte, fare transgenezi, kalp gelişimi sırasında belirli genlerin rolünü değerlendirmek için genellikle gerçekleştirilemeyen karmaşık, zaman alıcı bir süreçtir. Bunu ele almak için, fare embriyonik kalplerinin verimli elektroporasyonu ve kültürü için bir protokol geliştirdik ve geçici transgenezin kardiyak gelişimde yer alan genlerin fonksiyon kazanımı veya kaybının etkisini hızlı bir şekilde değerlendirmesini sağladık. Bu metodolojiyi kullanarak, epikardiyal hücre transfeksiyonu tercihi ile embriyonik kalpte Meis1'i başarılı bir şekilde aşırı eksprese ettik ve tekniğin yeteneklerini gösterdik.

Bu tekniğin, ilgili kalp gelişimsel düzenleyicileri için fonksiyon kazancı (GOF) deneyleri gerçekleştirmedeki etkinliğini göstermek için, Meis1 transkripsiyon faktörünü aşırı eksprese eden bir yapı elektroporasyona tabi tutuldu. Bunu başarmak için, E9.5 embriyolarından RNA ekstrakte edildi ve tamamlayıcı DNA (cDNA) elde etmek için ters transkripsiyon yapıldı. cDNA'yı bir şablon olarak kullanarak, Meis1 kodlama dizisi klonlandı (Ek Tablo 1) bir pCAG ekspresyon ...

Yazar Spotlight: Hızlı Gen Taraması için Kardiyak Hücre Transgenezi

Bu protokol, gelişmekte olan fare kalplerinde kalp hücrelerinin elektroporasyona dayalı transgenezi için ayrıntılı bir metodolojik çerçeve sunar. Burada sağlanan video varlıkları, bu çok yönlü tekniğin öğrenilmesini kolaylaştıracaktır.

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

an-efficient-transgenesis-approach-for-gene-delivery-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

524 Görüntüleme.  Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO). Kalp gelişimini anlamak için belirli bir genin aşırı ekspresyonunu veya aşağı regülasyonunu kolaylaştıran yeni bir metodoloji oluşturmayı amaçlıyoruz. Fare transgenezi, büyük bir zaman ve emek yatırımıdır. Genleri tek tek değerlendirmek, bu nedenle ve ayrıca genomun yüksek karmaşıklığı nedeniyle gerçekçi değildir.Bu nedenle, hızlı bir tarama yöntemine ihtiyaç vardır. Kalp gelişimi sırasında aday bir genin işlev ...

Video: Yazar Spotlight: Hızlı Gen Taraması için Kardiyak Hücre Transgenezi

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Primer Hücre Kültürü Araştırmaları Chick retina Verimli Gen Transferi: Bir<em&gt; Eski-ovo</em&gt; Elektroporasyon Yaklaşımı

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Gelişim Biyolojisi

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

This protocol provides a method for the collection of mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) derived from serum (fetal bovine serum, FBS)- and feeder (mouse embryonic fibroblasts, MEFs)-free conditions for a cell-free approach. It may be applicable for the treatment of aging and aging-associated diseases.

Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanopartikül aracılı siRNA Gene susturmak yetişkin zebra balığı kalbinde

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Embriyonik Cardiomyocytes kuş embriyo implantasyonu Vivo için Mikroenjeksiyon tabanlı sistem

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

Genle Manipüle Edilmiş Fare Modelleri Geliştirmek için Embriyonik Kök Hücrelerde CRISPR / Cas9 Aracılı Yüksek Verimli Gen Hedefleme

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...