Bu çalışma, İspanyol Ministerio de Ciencia e Innovación'dan RTI2018-097617-J-I00 ve Universidad de Jaén'den Acción 9'a hibe PGC2018-096486-B-I00, İspanyol Ministerio de Ciencia e Innovación'dan hibe -096486-B-I00 ve AB Horizon 2020 programından M.T.'ye H2020-MSCA-ITN-2016-722427 hibe ile desteklenmiştir. JMG, İspanya Bilim Bakanlığı ve Fundación Severo Ochoa'dan (PRE2022-101884) bir doktora bursu ile desteklenmiştir. Hem CNIC hem de CBMSO, İspanya Bilim Bakanlığı tarafından desteklenmektedir ve CNIC, ProCNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir.

Tüm hayvan prosedürleri, CNIC Hayvan Deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylandı ve 53/2013 sayılı Gerçek Kararname uyarınca İspanyol Yasası tarafından uygulanan AB Direktifi 2010/63EU ve 2007/526/EC sayılı Tavsiye Kararı dahil olmak üzere mevcut mevzuata uygun hale getirildi. Bu protokol için, 15-21 haftalık dişi vahşi tip CD-1 fareleri kullanıldı. Kullanılan hayvanlar, reaktifler ve ekipmanlarla ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Plazmit ve alet hazırlama
<ol><li>İlk olarak, istenen plazmit DNA'yı 1 μg/μL'lik bir nihai konsantrasyonda buza ekleyerek elektroporasyon karışımını hazırlayın. Daha sonra, %6 nihai konsantrasyonda (PBS içinde çözülmüş) sakaroz,% 0.01'de biyouyumlu bir boya ekleyerek karışımı tamamlayın ve 30 μL'lik bir son hacme kadar PBS ile tamamlayın. NOT: Numune başına yaklaşık 1-2 μL elektroporasyon karışımı kullanılır. Elektroporasyon karışımının oranlarını deneydeki numune sayısına göre ölçeklendirin. Elektroporasyon için DNA'nın bakteri kültüründen saflaştırılması gerektiğini, optimum stabilite ve minimum kirletici madde sağladığını lütfen unutmayın. Bu çalışma için kullanılan plazmitler hakkında daha fazla ayrıntı için lütfen temsili sonuçlar bölümüne bakın.</li>
	<li>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) %10 fetal sığır serumu (FBS), %2 Hepes tamponu ve %1 penisilin / streptomisin ile destekleyerek Büyüme Ortamı hazırlayın. Ortamı kullanana kadar 37 ° C'de bir inkübatörde tutun. Ek olarak, büyüme ortamı ile birlikte 1x PBS'yi 37 °C'de ısıtın.</li>
	<li>Aşağıdaki koşullara sahip bir pipet çektirme kullanarak 20 μm çapında bir cam kılcal damarı gererek iğneleri hazırlayın: ısı = 550; çekme = 100; hız = 250; zaman = 120. Çektikten sonraki son çap yaklaşık 5-8 μm arasında olmalıdır.</li>
	<li>Elektroporatör parametrelerini 900 ms aralıklarla 40 V'ta beş adet 50 ms'lik döngüye ayarlayın. Elektrotları, ağız pipetini ve künt iğneyi hazırlayın (Şekil 3A). DNA'yı yüklemek için pipeti iğne ile donatın (Şekil 3A).</li>
</ol>2. Embriyo diseksiyonu ve kalp ekstraksiyonu
<ol><li>Vahşi tip CD-1 fareleri arasında bir çaprazlama ayarlayın. Ertesi sabah, vajinal tıkaç sergileyen dişileri seçin ve bu zamanı embriyonik gün E0.5 olarak not edin. Hayvanları embriyonik gün E12-12.5'te servikal çıkık ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).</li>
	<li>Uterusu fareden dikkatlice çıkarın ve kuru bir kağıt havluya koyun. Bunu takiben, makasın ucunu mezomiyal tarafa sokarak ve bıçağın kenarını tüm uzunluk boyunca yavaşça hareket ettirerek ince bir makas kullanarak uterusu kesin. Desiduae'yi açığa çıkarın ve onları büyüme ortamına aktarın. Daha fazla ayrıntı için lütfen Behringer ve ark.20'nin çalışmasına bakınız.</li>
	<li>Embriyoları çıkarmak için desiduaları inceleyin, ardından embriyoları ılık büyüme ortamına sahip 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. İnce forseps kullanarak, embriyonun kuyruğunu ve başını dikkatlice kesin, böylece sadece vücudun gövdesi kalır. Embriyoların evresi, Wong ve ark.21 tarafından tarif edildiği gibi anatomik özelliklerin değerlendirilmesiyle doğrulanabilir.</li>
	<li>Ardından, kalbe veya pulmoner ve aort arterlerine zarar vermeden embriyonun gövdesinden mümkün olduğunca fazla doku çıkarın. Kalp açığa çıktıktan sonra, hemen yeni, sıcak bir büyüme ortamına koyun ve elektroporasyona kadar 37 ° C'de bir inkübatörde tutun. NOT: Kalbin sıcaklığını korumak, hayatta kalması için çok önemlidir. Ortamın her zaman sıcak olduğundan emin olun ve her 5-10 dakikada bir değiştirin. Öte yandan, prosedürün verimliliğini etkilemeyeceği için numuneler steriliteyi korumadan ele alınabilir. Büyüme ortamının antibiyotik içerdiğini lütfen unutmayın.</li>
</ol>3. Kalp elektroporasyonu ve ex vivo kültür
<ol><li>Yaklaşık 10 μL plazmit karışımını (adım 1.1'de hazırlanmıştır) ağız pipeti ile dikkatlice aspire ederek iğneye yükleyin.</li>
	<li>37 °C'ye ısıtılmış steril 1x PBS ile temiz bir 60 mm Petri kabına yerleştirerek elektroporasyon için tek bir kalp hazırlayın. Çanağı diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin (Şekil 3A).</li>
	<li>Pozitif ve negatif kutuplar arasındaki mesafeyi yaklaşık 4 mm'ye ayarlayarak elektrotları hazırlayın (Şekil 3B). NOT: 4 mm, bu çalışmada kullanılan elektrotlara E12.5 fare kalplerinin sığdığı açıklık mesafesidir. Lütfen bu mesafeyi farklı numune boyutlarına veya elektrot özelliklerine göre değiştirmeyi düşünün.</li>
	<li>Ağız pipetindeki iğne ile kalbin en yüzeysel tabakasını nazikçe delin. Plazmit karışımının 1-2 μL'sini dikkatlice pipetleyin ve iğneyi çıkarın. Optimal penetrasyonu sağlamak ve ayrıca elektroporasyonlu hücrelerin sayısını artırmak için çoklu enjeksiyonlar yapılabilir.</li>
	<li>Elektrotları, kalp her iki kutup arasında yer alacak şekilde yerinde tutun (Şekil 3C). Ardından, kalbi yukarıda belirtilen koşullarla elektriklendirin. NOT: Maksimum elektroporasyon verimliliğini sağlamak için, elektrotların polaritesini değiştirmek ve başka bir darbe vermek mümkündür.</li>
	<li>Elektroporasyonlu kalbi 1 mL büyüme ortamı içeren 12 oyuklu yeni bir plakaya aktarın ve 37 ° C,% 5 CO2'ye yerleştirin.</li>
	<li>Deneydeki tüm numuneler elektroporasyonlu olana kadar 3.1 ila 3.6 arasındaki adımları tekrarlayın. Son olarak, tüm kalpleri bir inkübatörde 37 ° C,% 5 CO 2'de 24 saat veya analize kadar inkübe edin. NOT: Ellerimizde, kalpler belirgin bir bozulma belirtisi olmadan 48 saate kadar kültürde bırakılabilir (Ek Film 1; Ek Film 2; Ek Şekil 1).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig03.jpg"> Şekil 3: Elektroporasyon kurulumu. (A) Elektroporasyon için kullanılan kurulum. Kırmızı oklar, kalplerin elektroporasyona tabi tutulduğu elektroporatörü, elektrotları ve Petri kabını gösterir. (Bir') Beyaz dikdörtgen ile (A)'da vurgulandığı gibi elektroporasyon iğnesinin yakın detayı. (B) E12.5 kalplerinde kullanılan elektrotların ayarlanmış mesafesinin detayı. (C) Elektroporasyonun şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Hücre sınıflandırma ve immünohistokimya analizi
<ol><li>Örneklerin hücre sıralama analizi için, 400 μL liberaz (5 mg/ml), 300 μL dispas (0.1 g/mL), 4 μL CaCl2 (0.4 μM), 50 μL MgCl2 (5 μM) ile karıştırarak dokuyu ayırmak için bir sindirim ortamı hazırlayın ve 10 mL DMEM'e kadar tamamlayın. Kullanana kadar buz üzerinde tutun. Her kalbin yaklaşık 1 mL Sindirim Ortamına ihtiyacı vardır. Hacimleri numune sayısına göre ayarlayın. NOT: İmmünohistokimya için, kalpleri RT'de 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de 1.5 mL% 4 PFA'da doğrudan sabitleyin. Ertesi gün, kalpleri 3 kez PBS ile yıkayın ve aşağı akış histolojik ve immün boyama prosedürlerine devam edin. Ayrıntılı bir immünohistokimya protokolü için Morris ve ark.22'ye bakınız.</li>
	<li>Kültürdeki her kalbi 1 mL buz gibi soğuk sindirim ortamı içeren yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Ayrışmayı kolaylaştırmak için, bir şırınga ile 3-4 kez hafifçe uygulayarak dokuyu doğrayın ve hemen 37 ° C, 600 rpm'de 45 dakika boyunca sıcak bir plakada inkübe edin.</li>
	<li>Sindirim karışımını 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir tüpe süzün ve yerçekimi akışıyla boşalmasına izin verin. Ardından, geçiş hacmini kurtarın ve 40 μm'lik bir hücre süzgeci kullanarak 50 mL'lik yeni bir tüpe tekrar süzün.</li>
	<li>500 μL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin ve soğuk DMEM kullanarak 30 mL'ye kadar tamamlayın.</li>
	<li>Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 240 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve 50 mL'lik tüpü tamamen kuruması için bir kağıt havlunun üzerine baş aşağı yerleştirin. NOT: Bu, hücre peletini dondurarak deneyi duraklatmak için uygun bir noktadır. Eğer öyleyse, hücreleri FBS'de% 10 DMSO ile yeniden süspanse edin ve -80 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Hücre sıralaması için, hücreleri 300 μL sıralama tamponunda (% 1 FBS,% 1 penisilin / streptomisin) yeniden süspanse edin ve 0.3 μL DAPI (1000x) ekleyin. Hücre sıralama işlemini gerçekleştirin.</li>
</ol>

Fare Kalplerinde Kardiyak Hücrelerin Elektroporasyona Dayalı Transgenezi

<ol>
	<li>Tyser, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat.">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, e17113 (2016).</li><li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+common+progenitor+pool+of+the+epicardium+and+myocardium.">Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium.</a> Science. 371 (6533), 2986 (2021).</li><li>Sendra, M., Dom&#237;nguez, J., Torres, M., Oca&#241;a, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells.">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).</li><li>Ivanovitch, K., Temi&#241;o, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis.">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, e30668 (2017).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+functions+in+second+heart+field+to+promote+right+ventricular+growth.">Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth.</a> PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).</li><li>Zimmerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+burden+of+congenital+heart+disease,+1990-2017:+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).</li><li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mending+broken+hearts:+Cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair.">Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Cao, J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+hub+for+heart+regeneration.">The epicardium as a hub for heart regeneration.</a> Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li><li>Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium.">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).</li><li>Hesse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+defines+heterogeneity+of+epicardial+cells+and+fibroblasts+within+the+infarcted+murine+heart.">Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart.</a> eLife. 10, e65921 (2021).</li><li>Streef, T. J., Smits, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+contribution+to+the+developing+and+injured+heart:+Exploring+the+Cellular+composition+of+the+epicardium.">Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 750243 (2021).</li><li>Sanchez-Fernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+epicardial+cell+heterogeneity+during+cardiogenesis+and+heart+regeneration.">Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376 (2023).</li><li>Quijada, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+endothelial+cell+positioning+and+fate+specification+by+the+epicardium.">Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium.</a> Nat Commun. 12 (1), 4155 (2021).</li><li>Mantri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+RNA+sequencing+of+developing+chicken+hearts+identifies+interplay+between+cellular+differentiation+and+morphogenesis.">Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis.</a> Nat Commun. 12 (1), 1771 (2021).</li><li>Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeobox+gene+Meis1+modulates+cardiovascular+regeneration.">Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).</li><li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pbx/Meis+deficiencies+demonstrate+multigenetic+origins+of+congenital+heart+disease.">Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease.</a> Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Meis1+act+as+a+new+regulator+of+ischemic+arrhythmias+in+mice.">Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice.</a> J Adv Res. 39, 275-289 (2022).</li><li>Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).</li><li>Wong, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+atlas+of+the+mouse+embryo+for+precise+morphological+staging.">4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging.</a> Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).</li><li>Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdTomato+and+EGFP+identification+in+histological+sections:+Insight+and+alternatives.">TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives.</a> Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).</li><li>Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+myosins:+expression+patterns+and+functional+significance.">Developmental myosins: expression patterns and functional significance.</a> Skelet. Muscle. 5 (1), 22 (2015).</li><li>Eissa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+genes+for+messenger+RNA+quantification+by+real-time+pcr+in+mouse+dextran+sodium+sulfate+experimental+colitis.">Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis.</a> PLOS One. 11 (5), e0156289 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2&#8722;&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2&#8722;&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+using+a+plasmid+construct+expressing+short-hairpin+RNA.">RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA.</a> Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).</li><li>Carmona, R., Barrena, S., L&#243;pez Gambero, A. J., Rojas, A., Mu&#241;oz-Ch&#225;puli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+cell+lineages+and+the+origin+of+the+coronary+endothelium.">Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium.</a> FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).</li><li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+types,+methods+and+strategies:+A+technical+review.">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> Peer J. 9, e11165 (2021).</li><li>Ka&#322;u&#380;na, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+human+heart+ex+vivo-Current+possibilities+and+strive+for+future+applications.">Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications.</a> JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+culture+method+for+the+embryonic+mouse+heart.">A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. (75), e50359 (2013).</li></ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Genel olarak, burada açıklanan metodoloji, Meis1 aşırı ekspresyonu (Şekil 4C) ile gösterildiği gibi, gelişmekte olan epikarddaki transgenik yapıları ifade etmek için sağlam bir çerçeve sunar (Şekil 4B). Uygun yapılarla, bu protokol, belirli bir genin fonksiyon kazancının (GOF) veya fonksiyon kaybının (LOF) etkisini geçici olarak değerlendirmek için kullanılabilir. LOF, RNA interferansı26 yoluyla bir aday geni hed...

Kalp, embriyonik gelişim sırasında oluşan ilk organdır. Bu süreç, embriyonun farklı bölgelerinden çeşitli progenitör hücre popülasyonlarının uzay-zamansal koordinasyonunu içerir. Bütün bunlar, gelişmekte olan kalp atmaya ve çalışmaya devam ederken meydana gelir ve oluşumu için gereken olağanüstü koordinasyonu vurgular 1,2,3. Kalbin kritik rolü göz önüne alındığında, düzgün oluşumu için hücresel ve moleküler seviyelerde sıkı düzenleme şarttır 4,5. Kalp gelişimini kontrol eden mekanizmaların belirlenmesi, dünya çapında önemli sayıda hastayı etkileyen konjenital kalp bozukluklarının çözülmesi için çok önemli olduğu için büyük ilgi görmüştür6. Ayrıca, doğum sonrası memeli kalpleri yetişkinlikte kaybedilen veya engellenen bir rejeneratif kapasiteyi koruduğundan, kalp gelişimini anlamak kardiyak rejenerasyonun deşifre edilmesinde çok önemlidir 7,8. Sonuç olarak, konjenital kalp hastalığı ve kardiyak rejenerasyon ile ilgili araştırma çabalarını ilerletmek için kalp gelişiminin moleküler düzenleyicilerinin diseksiyonu zorunludur.
Bu amaç doğrultusunda, epikardiumun kardiyak gelişim ve rejenerasyondaki rolünü araştırmaya artan bir odaklanma olmuştur9. Epikardium, memeli kalbinin en dış tabakasını oluşturan ince bir mezotelyal doku tabakasıdır (Şekil 1). Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kardiyak yaralanma sırasında epikardın önemini göstermiş ve bu dokunun hasarı hafifletmek için etkilenen bölgedeki kardiyomiyositlere proliferasyon sinyalleri gönderebildiğini ortaya koymuştur10,11. Epikardın önemine rağmen, daha fazla moleküler araştırma yapmak, muazzam heterojenliği nedeniyle sorgulanmıştır. Tek hücreli RNAseq deneyleri, farklı transkriptomik imzalara sahip çoklu hücre alt popülasyonlarını barındıran epikardın heterojenliğini ortaya çıkarmıştır 12,13,14,15,16. Bu nedenle, kardiyak gelişimin potansiyel düzenleyicilerini taramak için bir strateji, epikardiyal progenitör hücrelerin çeşitliliğini barındırmalıdır.
Bu anlamda, fare modelinin genetik modifikasyona yatkınlığı, kalp gelişimi için çok önemli olan çok sayıda genin tanımlanmasını kolaylaştırmış ve belirli genlerin işlev kazancı (GOF) veya işlev kaybı (LOF) ile mutant hatların oluşturulmasına izin vermiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar önemli bir zaman ve deneysel kaynak yatırımı anlamına gelir; bu nedenle, çok sayıda aday genin rollerini değerlendirirken pratik değildirler. Ayrıca, gelişimsel genler genellikle farklı dokularda pleiotropik işlevler gösterir veya erken embriyonik gelişim için gereklidir, bu da belirli bir süreçte gelişime katkılarının yorumlanmasını engeller. Gen fonksiyonunu belirli yapılarda veya gelişimsel zaman noktalarında hedeflemek mümkün olsa da, bu genellikle üretilmesi zor olabilen veya genellikle mevcut olmayan daha karmaşık genetik yapıların kullanılmasını gerektirir.
Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, geçici transgenez için fare embriyonik kalplerini elektropore etmek için bir metodoloji sunuyoruz (Şekil 2). Ex vivo kültür ve floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile eşleştirilen bu strateji, kalp gelişimi ve rejenerasyonunda rol oynayan iyi karakterize edilmiş bir gen olan Meis1'in geçici GOF yoluyla yeteneklerini gösterir 17,18,19. Bu makalede, bu metodolojinin diğer potansiyel uygulamaları da araştırılmakta ve avantajları ve sınırlamaları tartışılmakta ve ayrıca gen ekspresyonunu geçici olarak modüle etmek için mevcut protokollerle karşılaştırılmaktadır. Sunulan çerçeve ve görsel örneklerin, gelişim ve hastalık sırasında epikard biyolojisinin anlaşılmasını geliştireceğine inanıyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg"> Resim 1: Fare embriyonik kalp katmanları. Bir E13-14 fare embriyonik kalbinin koronal görünümünün şematik diyagramı. Kalbin üç ana hücresel tabakası sarı (endokard), kırmızı (miyokard) ve mavi (epikard) ile temsil edilir. Perikard kahverengi bir çizgi ile temsil edilir. Kalbin dört odacığı LV, sol ventrikül olarak kısaltılır; RV, sağ ventrikül; LA, sol atriyum; RA, sağ atriyum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg"> Şekil 2: Kalp elektroporasyon protokolüne şematik genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm vise table&#160;</td>
			<td>Grandado</td>
			<td>SKU 8798771617573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Policlonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10262</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-6503-82</td>
			<td>1:500 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 Wild Type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Animalary Unit (CNIC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>1:400 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase/collagenase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51032720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stereoscopic Microscope S8AP0</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11524102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller Model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>SU-P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#89689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 &#215; 10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 &#215; 15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reused from old laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>9979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>1:300 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Wave Electroporator CUY21SC</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY664-10X15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided and autoclaved by technical unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes with variable gap</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient transgenesis approach for gene delivery in the mouse embryonic heart

Memeli kalbi, gelişim sırasında çok çeşitli progenitör hücre popülasyonları yoluyla oluşan karmaşık bir organdır. Bu ataların kökeni, işe alınma zamanlaması ve kaderi, bu organın düzgün gelişimi için hayati önem taşır. Kalbin morfogenezini yöneten moleküler mekanizmalar, konjenital kalp hastalıklarının ve embriyonik kardiyak rejenerasyonun patogenezini anlamak için gereklidir. Bu mekanizmaları araştırmak için klasik yaklaşımlar, kardiyak gelişim sırasında spesifik genlerin işlevini değerlendirmek için transgenik farelerin neslini kullanmıştır. Bununla birlikte, fare transgenezi, kalp gelişimi sırasında belirli genlerin rolünü değerlendirmek için genellikle gerçekleştirilemeyen karmaşık, zaman alıcı bir süreçtir. Bunu ele almak için, fare embriyonik kalplerinin verimli elektroporasyonu ve kültürü için bir protokol geliştirdik ve geçici transgenezin kardiyak gelişimde yer alan genlerin fonksiyon kazanımı veya kaybının etkisini hızlı bir şekilde değerlendirmesini sağladık. Bu metodolojiyi kullanarak, epikardiyal hücre transfeksiyonu tercihi ile embriyonik kalpte Meis1'i başarılı bir şekilde aşırı eksprese ettik ve tekniğin yeteneklerini gösterdik.

The heart is the first organ formed during embryonic development. This process involves the spatiotemporal coordination of various populations of progenitor cells from distinct areas of the embryo. All this occurs while the developing heart continues to beat and function, emphasizing the remarkable coordination required for its formation1,2,3. Given the crucial role of the heart, tight regulation at the cellular and molecular levels is essential for its proper formation4,5. Identifying the mechanisms that control heart development has been of great interest, as they are crucial for unraveling congenital heart disorders, which impact a substantial number of patients worldwide6. Furthermore, comprehending heart development is pivotal in deciphering cardiac regeneration, as postnatal mammalian hearts retain a regenerative capacity that is lost or hindered in adulthood7,8. Consequently, dissecting molecular regulators of heart development is imperative to advance research efforts on congenital heart disease and cardiac regeneration.
In pursuit of this objective, there has been a growing focus on investigating the role of the epicardium in cardiac development and regeneration9. The epicardium is a thin layer of mesothelial tissue that comprises the outermost layer of the mammalian heart (Figure 1). Recent studies have shown the importance of the epicardium during cardiac injury, revealing that this tissue is able to send proliferation signals to cardiomyocytes in the affected area to mitigate the damage10,11. Despite the importance of the epicardium, conducting further molecular investigations has been challenged by its immense heterogeneity. Single-cell RNAseq experiments have revealed the epicardium&#39;s heterogeneity, housing multiple cell subpopulations with distinct transcriptomic signatures12,13,14,15,16. Thus, a strategy to screen potential regulators of cardiac development should accommodate the diversity of epicardial progenitor cells.
In this sense, the mouse model&#39;s amenability to genetic modification has facilitated the identification of numerous genes crucial for heart development, allowing the generation of mutant lines with gain-of-function (GOF) or loss-of-function (LOF) of specific genes. However, these approaches imply a considerable investment of time and experimental resources; therefore, they are impractical when assessing the roles of a large number of candidate genes. Besides, developmental genes often exert pleiotropic functions in different tissues or are required for early embryonic development, hampering the interpretation of their contribution to development in a specific process. While it is possible to target gene function at specific structures or developmental time points, this usually requires the use of more complex genetic constructions, which can be difficult to generate or are generally unavailable.
To overcome these limitations, we present a methodology to electroporate mouse embryonic hearts for transient transgenesis (Figure 2). Paired with ex vivo culture and fluorescence-activated cell sorting (FACS), this strategy demonstrates its capabilities through transient GOF of Meis1, a well-characterized gene implicated in heart development and regeneration17,18,19. In this article, other potential applications of this methodology are also explored, and its advantages and limitations are discussed, as well as compared to existing protocols for transiently modulating gene expression. We believe the framework and visual examples presented will enhance the understanding of epicardium biology during development and disease.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Mouse embryonic heart layers. Schematic diagram of a coronal view of an E13-14 mouse embryonic heart. The three main cellular layers of the heart are represented in yellow (endocardium), red (myocardium), and blue (epicardium). The pericardium is represented in a brown line. The four chambers of the heart are abbreviated as LV, left ventricle; RV, right ventricle; LA, left atrium; RA, right atrium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg" /> 
Figure 2: Schematic overview of the heart electroporation protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Yazar Spotlight: Hızlı Gen Taraması için Kardiyak Hücre Transgenezi

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Bu tekniğin, ilgili kalp gelişimsel düzenleyicileri için fonksiyon kazancı (GOF) deneyleri gerçekleştirmedeki etkinliğini göstermek için, Meis1 transkripsiyon faktörünü aşırı eksprese eden bir yapı elektroporasyona tabi tutuldu. Bunu başarmak için, E9.5 embriyolarından RNA ekstrakte edildi ve tamamlayıcı DNA (cDNA) elde etmek için ters transkripsiyon yapıldı. cDNA'yı bir şablon olarak kullanarak, Meis1 kodlama dizisi klonlandı (Ek Tablo 1) bir pCAG ekspresyon ...

Bu protokol, gelişmekte olan fare kalplerinde kalp hücrelerinin elektroporasyona dayalı transgenezi için ayrıntılı bir metodolojik çerçeve sunar. Burada sağlanan video varlıkları, bu çok yönlü tekniğin öğrenilmesini kolaylaştıracaktır.

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

an-efficient-transgenesis-approach-for-gene-delivery-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

416 Görüntüleme.  Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO). Kalp gelişimini anlamak için belirli bir genin aşırı ekspresyonunu veya aşağı regülasyonunu kolaylaştıran yeni bir metodoloji oluşturmayı amaçlıyoruz. Fare transgenezi, büyük bir zaman ve emek yatırımıdır. Genleri tek tek değerlendirmek, bu nedenle ve ayrıca genomun yüksek karmaşıklığı nedeniyle gerçekçi değildir.Bu nedenle, hızlı bir tarama yöntemine ihtiyaç vardır. Kalp gelişimi sırasında aday bir genin işlev ...

Video: Yazar Spotlight: Hızlı Gen Taraması için Kardiyak Hücre Transgenezi

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.