تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة RTI2018-097617-J-I00 من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية و Acción 9 من جامعة جيان إلى O.H.O. Grant PGC2018-096486-B-I00 من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية ومنحة H2020-MSCA-ITN-2016-722427 من برنامج EU Horizon 2020 إلى MT. تم دعم JMG بزمالة دكتوراه من وزارة العلوم الإسبانية ومؤسسة Severo Ochoa (PRE2022-101884). يتم دعم كل من CNIC و CBMSO من قبل وزارة العلوم الإسبانية ، ويتم دعم CNIC من قبل مؤسسة ProCNIC.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على CNIC وتتوافق مع التشريعات الحالية ، بما في ذلك توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63EU والتوصية 2007/526 / EC ، على النحو الذي يفرضه القانون الإسباني بموجب Real Decreto 53/2013. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم استخدام إناث الفئران من النوع البري CD-1 الذين تتراوح أعمارهم بين 15 و 21 أسبوعا. يتم سرد التفاصيل المتعلقة بالحيوانات والكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.
1. إعداد البلازميد والأداة
<ol><li>أولا ، قم بإعداد مزيج التثقيب الكهربائي عن طريق إضافة الحمض النووي البلازميد المطلوب في الثلج بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / ميكرولتر. بعد ذلك ، أكمل المزيج بإضافة السكروز بتركيز نهائي 6٪ (مذاب في PBS) ، وصبغة متوافقة حيويا بنسبة 0.01٪ ، واستكماله ب PBS حتى الحجم النهائي 30 ميكرولتر. ملاحظة: يتم استخدام ما يقرب من 1-2 ميكرولتر من مزيج التثقيب الكهربائي لكل عينة. قم بقياس نسب مزيج التثقيب الكهربائي وفقا لعدد العينات في التجربة. يرجى تذكر أنه يجب تنقية الحمض النووي للتثقيب الكهربائي من الثقافة البكتيرية ، مما يضمن الاستقرار الأمثل والحد الأدنى من الملوثات. لمزيد من التفاصيل حول البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة ، يرجى الرجوع إلى قسم النتائج التمثيلية.</li>
	<li>قم بإعداد وسط النمو عن طريق استكمال وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع مصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS) ، و 2٪ عازل Hepes ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. احتفظ بالوسط في حاضنة عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتسخين 1x PBS عند 37 درجة مئوية ، جنبا إلى جنب مع وسط النمو.</li>
	<li>تحضير الإبر عن طريق تمديد شعرية زجاجية قطرها 20 ميكرومتر باستخدام مجتذب ماصة بالشروط التالية: الحرارة = 550 ؛ سحب = 100 ؛ السرعة = 250 ؛ الوقت = 120. يجب أن يكون القطر النهائي بعد السحب حوالي 5-8 ميكرومتر.</li>
	<li>قم بإعداد معلمات الكهربائي إلى خمس دورات 50 مللي ثانية عند 40 فولت بفواصل زمنية تبلغ 900 مللي ثانية. قم بإعداد الأقطاب الكهربائية وماصة الفم والإبرة الحادة (الشكل 3 أ). جهز الماصة بالإبرة لتحميل الحمض النووي (الشكل 3 أ).</li>
</ol>2. تشريح الجنين واستخراج القلب
<ol><li>قم بإعداد تقاطع بين الفئران CD-1 من النوع البري. في صباح اليوم التالي ، حدد الإناث التي تظهر سدادة مهبلية ولاحظ هذه المرة على أنها يوم جنيني E0.5. القتل الرحيم للحيوانات في اليوم الجنيني E12-12.5 عن طريق خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).</li>
	<li>استخرج الرحم بعناية من الماوس وضعه في منشفة ورقية جافة. بعد ذلك ، قم بقص الرحم باستخدام مقص ناعم عن طريق إدخال طرف المقص في الجانب mesometrial وتشغيل حافة الشفرة ببطء طوال الطول. فضح deciduae ونقلها إلى وسط النمو. لمزيد من التفاصيل ، يرجى الاطلاع على عمل Behringer et al.20.</li>
	<li>تشريح deciduae لاستخراج الأجنة ، ثم وضع الأجنة في طبق بتري 60 مم مع وسط نمو دافئ. باستخدام ملقط دقيق ، قم بقص ذيل الجنين ورأسه بعناية بحيث يبقى جذع الجسم فقط. يمكن التحقق من مرحلة الأجنة من خلال تقييم السمات التشريحية ، كما وصفها Wong et al.21.</li>
	<li>ثم قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة من جذع الجنين بحذر دون الإضرار بالقلب أو الشرايين الرئوية والشريان الأورطي. بمجرد تعرض القلب ، ضعه على الفور في وسط نمو دافئ جديد واحتفظ به في حاضنة عند 37 درجة مئوية حتى التثقيب الكهربائي. ملاحظة: الحفاظ على درجة حرارة القلب أمر بالغ الأهمية لبقائه. تأكد من أن الوسط دافئ دائما واستبدله كل 5-10 دقائق. من ناحية أخرى ، يمكن التعامل مع العينات دون الحفاظ على العقم ، لأن هذا لن يؤثر على كفاءة الإجراء. يرجى ملاحظة أن وسط النمو يحتوي على مضادات حيوية.</li>
</ol>3. التثقيب الكهربائي للقلب والثقافة خارج الجسم الحي 
<ol><li>قم بتحميل ما يقرب من 10 ميكرولتر من مزيج البلازميد (المحضر في الخطوة 1.1) في الإبرة عن طريق الشفط بعناية باستخدام ماصة الفم.</li>
	<li>قم بإعداد قلب واحد للتثقيب الكهربائي عن طريق وضعه في طبق بتري نظيف 60 مم مع معقم 1x PBS دافئ إلى 37 درجة مئوية. ضع الطبق تحت مجهر التشريح (الشكل 3 أ).</li>
	<li>قم بإعداد الأقطاب الكهربائية عن طريق ضبط المسافة بين القطبين الموجب والسالب إلى حوالي 4 مم (الشكل 3 ب). ملاحظة: 4 مم هي مسافة الفتحة التي تتناسب فيها قلوب الماوس E12.5 مع الأقطاب الكهربائية المستخدمة في هذا العمل. يرجى التفكير في تغيير هذه المسافة بناء على أحجام العينات المختلفة أو مواصفات القطب الكهربائي.</li>
	<li>ثقب بلطف الطبقة الأكثر سطحية من القلب مع الإبرة في ماصة الفم. ماصة بعناية 1-2 ميكرولتر من مزيج البلازميد وإزالة الإبرة. يمكن إجراء حقن متعددة لضمان الاختراق الأمثل ، وكذلك لزيادة عدد الخلايا الكهربائية.</li>
	<li>ثبت الأقطاب الكهربائية في مكانها بحيث يقع القلب بين كلا القطبين (الشكل 3C). ثم ، كهربائي القلب مع الشروط المحددة أعلاه. ملاحظة: لضمان أقصى قدر من كفاءة التثقيب الكهربائي ، من الممكن تبديل قطبية الأقطاب الكهربائية وإعطاء نبضة أخرى.</li>
	<li>انقل القلب الكهربائي إلى صفيحة جديدة ذات 12 بئرا تحتوي على 1 مل من وسط النمو وضعها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.</li>
	<li>كرر الخطوات من 3.1 إلى 3.6 حتى يتم ثقب جميع العينات في التجربة بالكهرباء. أخيرا ، احتضان جميع القلوب في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، لمدة 24 ساعة أو حتى التحليل. ملاحظة: في أيدينا ، يمكن ترك القلوب في الثقافة لمدة تصل إلى 48 ساعة دون علامات تدهور واضحة (الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم التكميلي 1 ؛ الفيلم الت الفيلم التكميلي 2 ؛ الشكل التكميلي 1).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig03.jpg"> الشكل 3: إعداد التثقيب الكهربائي. (أ) الإعداد المستخدم للتثقيب الكهربائي. تشير الأسهم الحمراء إلى جهاز الحفر الكهربائي والأقطاب الكهربائية وطبق بتري حيث يتم حفر القلوب بالكهرباء. (أ') التفاصيل الدقيقة لإبرة التثقيب الكهربائي كما هو موضح في (A) بواسطة المستطيل الأبيض. (ب) تفاصيل المسافة المعدلة للأقطاب الكهربائية المستخدمة في قلوب E12.5. ج: تمثيل تخطيطي للتثقيب الكهربي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
4. فرز الخلايا وتحليل الكيمياء المناعية
<ol><li>لتحليل فرز الخلايا للعينات ، قم بإعداد وسط هضم لفصل الأنسجة عن طريق خلط 400 ميكرولتر من الليبراز (5 مجم / مل) ، 300 ميكرولتر من ديسباز (0.1 جم / مل) ، 4 ميكرولتر من CaCl2 (0.4 ميكرومتر) ، 50 ميكرولتر من MgCl2 (5 ميكرومتر) وكاملة حتى 10 مل من DMEM. الحفاظ على الجليد حتى الاستخدام. يحتاج كل قلب إلى حوالي 1 مل من وسط الهضم. اضبط وحدات التخزين وفقا لعدد العينات. ملاحظة: بالنسبة للكيمياء الهيستولوجية المناعية ، ثبت القلوب مباشرة في 1.5 مل من 4٪ PFA لمدة ساعتين عند RT أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل القلوب 3x باستخدام برنامج تلفزيوني وانتقل إلى الإجراءات النسيجية والمناعية. للحصول على بروتوكول مفصل للكيمياء المناعية ، راجع Morris et al.22.</li>
	<li>نقل كل قلب في الثقافة إلى أنبوب جديد يحتوي على 1 مل من وسط الهضم المثلج.</li>
	<li>لتسهيل التفكك ، يقطع المنديل عن طريق تطبيق المتعة بلطف باستخدام حقنة 3-4 مرات واحتضانها على الفور في طبق ساخن عند 37 درجة مئوية ، 600 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة.</li>
	<li>قم بتصفية مزيج الهضم من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب جديد واتركه فارغا عن طريق تدفق الجاذبية. بعد ذلك ، قم بإنقاذ حجم التمرير وترشيحه مرة أخرى باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر في أنبوب جديد سعة 50 مل.</li>
	<li>أضف 500 ميكرولتر من مصل بقري الجنين (FBS) واستكمل ما يصل إلى 30 مل باستخدام DMEM البارد.</li>
	<li>جهاز طرد مركزي المزيج عند 240 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تخلص من المادة الطافية وضع الأنبوب سعة 50 مل رأسا على عقب على منشفة ورقية حتى يجف تماما. ملاحظة: هذه نقطة ملائمة لإيقاف التجربة مؤقتا عن طريق تجميد حبيبات الخلية. إذا كان الأمر كذلك ، فأعد تعليق الخلايا التي تحتوي على 10٪ DMSO في FBS وتخزينها عند -80 درجة مئوية.</li>
	<li>لفرز الخلايا ، أعد تعليق الخلايا في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفرز (1٪ FBS ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين في PBS) وأضف 0.3 ميكرولتر من DAPI (1000x). إجراء فرز الخلايا.</li>
</ol>

التحوير القائم على التثقيب الكهربائي لخلايا القلب في قلوب الفئران

<ol>
	<li>Tyser, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+handling+precedes+cardiac+differentiation+to+initiate+the+first+heartbeat.">Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat.</a> eLife. 5, e17113 (2016).</li><li>Tyser, R. C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+common+progenitor+pool+of+the+epicardium+and+myocardium.">Characterization of a common progenitor pool of the epicardium and myocardium.</a> Science. 371 (6533), eabb2986 (2021).</li><li>Sendra, M., Dom&#237;nguez, J., Torres, M., Oca&#241;a, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+complexity+of+early+heart+progenitor+cells.">Dissecting the complexity of early heart progenitor cells.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 9 (1), 5 (2021).</li><li>Ivanovitch, K., Temi&#241;o, S., Torres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+heart+tube+development+in+mouse+reveals+alternating+phases+of+cardiac+differentiation+and+morphogenesis.">Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis.</a> eLife. 6, e30668 (2017).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Canonical+Wnt+signaling+functions+in+second+heart+field+to+promote+right+ventricular+growth.">Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth.</a> PNAS. 104 (22), 9319-9324 (2007).</li><li>Zimmerman, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+burden+of+congenital+heart+disease,+1990-2017:+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional, and national burden of congenital heart disease, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Lancet Chil Adolesc Heal. 4 (3), 185-200 (2020).</li><li>Xin, M., Olson, E. N., Bassel-Duby, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mending+broken+hearts:+Cardiac+development+as+a+basis+for+adult+heart+regeneration+and+repair.">Mending broken hearts: Cardiac development as a basis for adult heart regeneration and repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 529-541 (2013).</li><li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart.">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).</li><li>Cao, J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+hub+for+heart+regeneration.">The epicardium as a hub for heart regeneration.</a> Nat Rev Cardiol. 15 (10), 631-647 (2018).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> JCI. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li><li>Van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., Van Den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium.">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PLOS One. 7 (9), e44692 (2012).</li><li>Hesse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomics+defines+heterogeneity+of+epicardial+cells+and+fibroblasts+within+the+infarcted+murine+heart.">Single-cell transcriptomics defines heterogeneity of epicardial cells and fibroblasts within the infarcted murine heart.</a> eLife. 10, e65921 (2021).</li><li>Streef, T. J., Smits, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+contribution+to+the+developing+and+injured+heart:+Exploring+the+Cellular+composition+of+the+epicardium.">Epicardial contribution to the developing and injured heart: Exploring the Cellular composition of the epicardium.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 750243 (2021).</li><li>Sanchez-Fernandez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+epicardial+cell+heterogeneity+during+cardiogenesis+and+heart+regeneration.">Understanding epicardial cell heterogeneity during cardiogenesis and heart regeneration.</a> J Cardiovasc Dev Dis. 10 (9), 376 (2023).</li><li>Quijada, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+endothelial+cell+positioning+and+fate+specification+by+the+epicardium.">Coordination of endothelial cell positioning and fate specification by the epicardium.</a> Nat Commun. 12 (1), 4155 (2021).</li><li>Mantri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+single-cell+RNA+sequencing+of+developing+chicken+hearts+identifies+interplay+between+cellular+differentiation+and+morphogenesis.">Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis.</a> Nat Commun. 12 (1), 1771 (2021).</li><li>Paul, S., Zhang, X., He, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeobox+gene+Meis1+modulates+cardiovascular+regeneration.">Homeobox gene Meis1 modulates cardiovascular regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 100, 52-61 (2020).</li><li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pbx/Meis+deficiencies+demonstrate+multigenetic+origins+of+congenital+heart+disease.">Pbx/Meis deficiencies demonstrate multigenetic origins of congenital heart disease.</a> Circ Res. 103 (7), 702-709 (2008).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Meis1+act+as+a+new+regulator+of+ischemic+arrhythmias+in+mice.">Transcription factor Meis1 act as a new regulator of ischemic arrhythmias in mice.</a> J Adv Res. 39, 275-289 (2022).</li><li>Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2014).</li><li>Wong, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4D+atlas+of+the+mouse+embryo+for+precise+morphological+staging.">4D atlas of the mouse embryo for precise morphological staging.</a> Development. 142 (20), 3583-3591 (2015).</li><li>Morris, L., Klanke, C., Lang, S., Lim, F. Y., Crombleholme, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdTomato+and+EGFP+identification+in+histological+sections:+Insight+and+alternatives.">TdTomato and EGFP identification in histological sections: Insight and alternatives.</a> Biotech Histochem. 85 (6), 379-387 (2010).</li><li>Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+myosins:+expression+patterns+and+functional+significance.">Developmental myosins: expression patterns and functional significance.</a> Skelet. Muscle. 5 (1), 22 (2015).</li><li>Eissa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+reference+genes+for+messenger+RNA+quantification+by+real-time+pcr+in+mouse+dextran+sodium+sulfate+experimental+colitis.">Stability of reference genes for messenger RNA quantification by real-time pcr in mouse dextran sodium sulfate experimental colitis.</a> PLOS One. 11 (5), e0156289 (2016).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2&#8722;&#916;&#916;CT+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2&#8722;&#916;&#916;CT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Lai, S. R., Andrews, L. G., Tollefsbol, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+using+a+plasmid+construct+expressing+short-hairpin+RNA.">RNA interference using a plasmid construct expressing short-hairpin RNA.</a> Methods Mol Biol. 405, 31-37 (2007).</li><li>Carmona, R., Barrena, S., L&#243;pez Gambero, A. J., Rojas, A., Mu&#241;oz-Ch&#225;puli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+cell+lineages+and+the+origin+of+the+coronary+endothelium.">Epicardial cell lineages and the origin of the coronary endothelium.</a> FASEB J. 34 (4), 5223-5239 (2020).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P. F. M., Mentink, M. M. T., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82 (10), 1043-1052 (1998).</li><li>Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+types,+methods+and+strategies:+A+technical+review.">Transfection types, methods and strategies: A technical review.</a> Peer J. 9, e11165 (2021).</li><li>Ka&#322;u&#380;na, E., Nadel, A., Zimna, A., Rozwadowska, N., Kolanowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+human+heart+ex+vivo-Current+possibilities+and+strive+for+future+applications.">Modeling the human heart ex vivo-Current possibilities and strive for future applications.</a> JTERM. 16 (10), 853-874 (2022).</li><li>Aguilera-Castrejon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+utero+mouse+embryogenesis+from+pre-gastrulation+to+late+organogenesis.">Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis.</a> Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).</li><li>Dyer, L. A., Patterson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ex+vivo+culture+method+for+the+embryonic+mouse+heart.">A novel ex vivo culture method for the embryonic mouse heart.</a> J Vis Exp. 75, e50359 (2013).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

بشكل عام ، تقدم المنهجية الموصوفة هنا إطارا قويا للتعبير عن التركيبات المعدلة وراثيا في النخاب النامي (الشكل 4 ب) ، كما يتضح من التعبير المفرط ل Meis1 (الشكل 4C). مع التركيبات المناسبة ، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم تأثير إما كسب الوظيفة (GOF) أو فقدان الوظيف...

القلب هو أول عضو يتشكل أثناء التطور الجنيني. تتضمن هذه العملية التنسيق الزماني المكاني لمجموعات مختلفة من الخلايا السلفية من مناطق متميزة من الجنين. كل هذا يحدث بينما يستمر القلب النامي في النبض والعمل ، مع التركيز على التنسيق الرائع المطلوب لتكوينه1،2،3. نظرا للدور الحاسم للقلب ، فإن التنظيم الصارم على المستويين الخلوي والجزيئي ضروري لتكوينه بشكل صحيح 4,5. كان تحديد الآليات التي تتحكم في نمو القلب ذا أهمية كبيرة ، لأنها ضرورية لكشف اضطرابات القلب الخلقية ، والتي تؤثر على عدد كبير من المرضى في جميع أنحاء العالم6. علاوة على ذلك ، يعد فهم نمو القلب أمرا محوريا في فك رموز تجديد القلب ، حيث تحتفظ قلوب الثدييات بعد الولادة بقدرة متجددة تضيع أو تعوق في مرحلة البلوغ 7,8. وبالتالي ، فإن تشريح المنظمين الجزيئيين لنمو القلب أمر حتمي لتعزيز الجهود البحثية حول أمراض القلب الخلقية وتجديد القلب.
سعيا لتحقيق هذا الهدف ، كان هناك تركيز متزايد على التحقيق في دور النخاب في نمو القلب وتجديده9. النخاب هو طبقة رقيقة من النسيج الظهاري المتوسط الذي يتكون من الطبقة الخارجية لقلب الثدييات (الشكل 1). أظهرت الدراسات الحديثة أهمية النخاب أثناء إصابة القلب ، وكشفت أن هذا النسيج قادر على إرسال إشارات الانتشار إلى خلايا عضلة القلب في المنطقة المصابة للتخفيف من الضرر10,11. على الرغم من أهمية النخاب ، فقد واجه إجراء المزيد من التحقيقات الجزيئية تحديا بسبب عدم تجانسه الهائل. كشفت تجارب RNAseq أحادية الخلية عن عدم تجانس النخاب ، حيث تضم مجموعات فرعية متعددة من الخلايا مع توقيعات نسخية مميزة12،13،14،15،16. وبالتالي ، فإن استراتيجية فحص المنظمين المحتملين لتطور القلب يجب أن تستوعب تنوع الخلايا السلفية النخابية.
وبهذا المعنى ، سهلت قابلية نموذج الفأر للتعديل الجيني تحديد العديد من الجينات الحاسمة لنمو القلب ، مما سمح بتوليد خطوط متحولة مع اكتساب الوظيفة (GOF) أو فقدان الوظيفة (LOF) لجينات معينة. ومع ذلك ، فإن هذه النهج تنطوي على استثمار كبير للوقت والموارد التجريبية. لذلك ، فهي غير عملية عند تقييم أدوار عدد كبير من الجينات المرشحة. إلى جانب ذلك ، غالبا ما تمارس الجينات التنموية وظائف متعددة الاتجاهات في أنسجة مختلفة أو تكون مطلوبة للتطور الجنيني المبكر ، مما يعيق تفسير مساهمتها في التطور في عملية محددة. في حين أنه من الممكن استهداف وظيفة الجينات في هياكل محددة أو نقاط زمنية تنموية ، فإن هذا يتطلب عادة استخدام تركيبات جينية أكثر تعقيدا ، والتي قد يكون من الصعب توليدها أو غير متوفرة بشكل عام.
للتغلب على هذه القيود ، نقدم منهجية لإلكتروبور القلوب الجنينية للفأر من أجل الجينات المحورة العابرة (الشكل 2). بالاقتران مع الثقافة خارج الجسم الحي وفرز الخلايا المنشط بالتألق (FACS) ، توضح هذه الاستراتيجية قدراتها من خلال GOF العابر ل Meis1 ، وهو جين مميز جيدا متورط في نمو القلب وتجديده17،18،19. في هذه المقالة ، يتم أيضا استكشاف التطبيقات المحتملة الأخرى لهذه المنهجية ، وتناقش مزاياها وقيودها ، وكذلك مقارنتها بالبروتوكولات الحالية لتعديل التعبير الجيني بشكل عابر. نعتقد أن الإطار والأمثلة المرئية المقدمة ستعزز فهم بيولوجيا النخاب أثناء التطور والمرض.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg"> الشكل 1: طبقات القلب الجنينية للفأر. رسم تخطيطي لمنظر إكليلي لقلب جنيني للفأر E13-14. يتم تمثيل الطبقات الخلوية الرئيسية الثلاث للقلب باللون الأصفر (الشغاف) والأحمر (عضلة القلب) والأزرق (النخاب). يتم تمثيل التامور بخط بني. يتم اختصار غرف القلب الأربع باسم LV ، البطين الأيسر. RV ، البطين الأيمن. لوس أنجلوس ، الأذين الأيسر ؛ RA ، الأذين الأيمن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg"> الشكل 2: نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول التثقيب الكهربائي للقلب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#55 Forceps</td>
			<td>Dumont&#160;</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm vise table&#160;</td>
			<td>Grandado</td>
			<td>SKU 8798771617573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Policlonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A10262</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14-6503-82</td>
			<td>1:500 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 Wild Type mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by Animalary Unit (CNIC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>9661</td>
			<td>1:400 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Cell Signalling Technologies</td>
			<td>4083</td>
			<td>1:1000 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase/collagenase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM - Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10313021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10438-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51032720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Stereoscopic Microscope S8AP0</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11524102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller Model P-97</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>SU-P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCAG expression plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#89689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 &#215; 10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 60 &#215; 15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P3532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reused from old laboratory equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td>9979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab89901</td>
			<td>1:300 dilution used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Wave Electroporator CUY21SC</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY664-10X15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided and autoclaved by technical unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>84100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrodes with variable gap</td>
			<td>Nepa Gene</td>
			<td>CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an efficient transgenesis approach for gene delivery in the mouse embryonic heart

قلب الثدييات هو عضو معقد يتكون أثناء التطور عبر مجموعات متنوعة للغاية من الخلايا السلفية. إن أصل هؤلاء الأسلاف وتوقيتهم ومصيرهم أمر حيوي للتطور السليم لهذا العضو. الآليات الجزيئية التي تحكم تشكل القلب ضرورية لفهم التسبب في أمراض القلب الخلقية وتجديد القلب الجنيني. استخدمت الأساليب الكلاسيكية للتحقيق في هذه الآليات توليد الفئران المعدلة وراثيا لتقييم وظيفة جينات معينة أثناء نمو القلب. ومع ذلك ، فإن الجينات المحورة للفأر هي عملية معقدة تستغرق وقتا طويلا ولا يمكن إجراؤها في كثير من الأحيان لتقييم دور جينات معينة أثناء نمو القلب. ولمعالجة هذا الأمر، قمنا بتطوير بروتوكول للتثقيب الكهربائي الفعال وزراعة القلوب الجنينية للفئران، مما يمكن الجينات المحورة العابرة من التقييم السريع لتأثير اكتساب أو فقدان وظيفة الجينات المشاركة في نمو القلب. باستخدام هذه المنهجية ، نجحنا في التعبير عن Meis1 في القلب الجنيني ، مع تفضيل نقل الخلايا النخابية ، مما يدل على قدرات التقنية.

The heart is the first organ formed during embryonic development. This process involves the spatiotemporal coordination of various populations of progenitor cells from distinct areas of the embryo. All this occurs while the developing heart continues to beat and function, emphasizing the remarkable coordination required for its formation1,2,3. Given the crucial role of the heart, tight regulation at the cellular and molecular levels is essential for its proper formation4,5. Identifying the mechanisms that control heart development has been of great interest, as they are crucial for unraveling congenital heart disorders, which impact a substantial number of patients worldwide6. Furthermore, comprehending heart development is pivotal in deciphering cardiac regeneration, as postnatal mammalian hearts retain a regenerative capacity that is lost or hindered in adulthood7,8. Consequently, dissecting molecular regulators of heart development is imperative to advance research efforts on congenital heart disease and cardiac regeneration.
In pursuit of this objective, there has been a growing focus on investigating the role of the epicardium in cardiac development and regeneration9. The epicardium is a thin layer of mesothelial tissue that comprises the outermost layer of the mammalian heart (Figure 1). Recent studies have shown the importance of the epicardium during cardiac injury, revealing that this tissue is able to send proliferation signals to cardiomyocytes in the affected area to mitigate the damage10,11. Despite the importance of the epicardium, conducting further molecular investigations has been challenged by its immense heterogeneity. Single-cell RNAseq experiments have revealed the epicardium&#39;s heterogeneity, housing multiple cell subpopulations with distinct transcriptomic signatures12,13,14,15,16. Thus, a strategy to screen potential regulators of cardiac development should accommodate the diversity of epicardial progenitor cells.
In this sense, the mouse model&#39;s amenability to genetic modification has facilitated the identification of numerous genes crucial for heart development, allowing the generation of mutant lines with gain-of-function (GOF) or loss-of-function (LOF) of specific genes. However, these approaches imply a considerable investment of time and experimental resources; therefore, they are impractical when assessing the roles of a large number of candidate genes. Besides, developmental genes often exert pleiotropic functions in different tissues or are required for early embryonic development, hampering the interpretation of their contribution to development in a specific process. While it is possible to target gene function at specific structures or developmental time points, this usually requires the use of more complex genetic constructions, which can be difficult to generate or are generally unavailable.
To overcome these limitations, we present a methodology to electroporate mouse embryonic hearts for transient transgenesis (Figure 2). Paired with ex vivo culture and fluorescence-activated cell sorting (FACS), this strategy demonstrates its capabilities through transient GOF of Meis1, a well-characterized gene implicated in heart development and regeneration17,18,19. In this article, other potential applications of this methodology are also explored, and its advantages and limitations are discussed, as well as compared to existing protocols for transiently modulating gene expression. We believe the framework and visual examples presented will enhance the understanding of epicardium biology during development and disease.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Mouse embryonic heart layers. Schematic diagram of a coronal view of an E13-14 mouse embryonic heart. The three main cellular layers of the heart are represented in yellow (endocardium), red (myocardium), and blue (epicardium). The pericardium is represented in a brown line. The four chambers of the heart are abbreviated as LV, left ventricle; RV, right ventricle; LA, left atrium; RA, right atrium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig01largev2.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66754/66754fig02.jpg" /> 
Figure 2: Schematic overview of the heart electroporation protocol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66754/66754fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

تسليط الضوء على المؤلف: تحويل خلايا القلب لفحص الجينات السريع

نهج فعال للجينات المعدلة لتوصيل الجينات في القلب الجنيني للفأر

We aim to establish a new methodology that facilitates the overexpression or downregulation of a certain gene to understand heart development. Mouse transgenesis is a great investment of time and effort. Assessing genes one by one is not realistic because of this and also because of the high complexity of the genome.Hence, there is a need for a rapid method of screening. We have presented a tool available to any researcher to analyze the gain or loss of function of a candidate gene during heart development. The main advantage of our protocol is that it's much quicker and less expensive than mouse transgenesis.Perhaps it could be used to assess different genes of interest before commencing a transgenesis experiment.

لإثبات فعالية هذه التقنية في إجراء تجارب كسب الوظيفة (GOF) لمنظمات نمو القلب ذات الصلة ، تم بناء كهربائي مفرط في التعبير عن عامل النسخ Meis1. لتحقيق ذلك ، تم استخراج الحمض النووي الريبي من أجنة E9.5 ، وتم إجراء النسخ العكسي للحصول على الحمض النووي التكميلي (cDNA). باستخدام cDNA كقالب ، تم استنساخ تسلسل...

يقدم هذا البروتوكول إطارا منهجيا مفصلا للجينات المحورة القائمة على التثقيب الكهربائي لخلايا القلب في قلوب الفئران النامية. ستسهل أصول الفيديو المتوفرة هنا تعلم هذه التقنية متعددة الاستخدامات.

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

an-efficient-transgenesis-approach-for-gene-delivery-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

412 Views.  Severo Ochoa Center for Molecular Biology (CBMSO). نهدف إلى إنشاء منهجية جديدة تسهل الإفراط في التعبير أو تقليل التنظيم لجين معين لفهم نمو القلب. يعد تحويل الجينات في الماوس استثمارا كبيرا للوقت والجهد. تقييم الجينات واحدا تلو الآخر ليس واقعيا بسبب هذا وأيضا بسبب التعقيد العالي للجينوم.وبالتالي ، هنا...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: تحويل خلايا القلب لفحص الجينات السريع

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Extraction and Electroporation of Mouse Embryo Heart as a Transgenesis Approach

To begin, use a pipette puller to stretch a 20 micrometer wide glass capillary. Place an extracted mouse uterus on a dry paper towel. Then, insert the tip of a pair of fine scissors into the myometrial side of the uterus, and slowly run the edge of the blade through the whole length and cut it.Now, expose and cut the decidui. Transfer them into a dish with growth medium. Dissect the decidui to extract the embryos.Transfer the embryos into a 60 millimeter Petri dish containing warm growth medium. With a pair of fine forceps, carefully cut the tail and the head of the embryo, and leave only the trunk of the body. Carefully remove as much tissue as possible from the trunk without damaging the heart or pulmonary and aorta arteries.Insert a new stretched out needle into the tip of the mouth pipette, and carefully aspirate and load 10 microliters of a prepared plasmid mix into the stretched out needle. Place a single heart into a clean 60 millimeter Petri dish containing prewarmed PBS. Place the dish under a dissecting microscope.Adjust the distance between the poles of positive and negative electrodes to about four millimeters. Next, use a needle in the mouth pipette to gently puncture the most superficial layer of the heart. Transfer one to two microliters of the plasmid mix into the heart.Remove the needle carefully. Hold the electrode in place so that the heart is located between both poles. Then, electroporate the heart.Transfer the electroporated heart to a new 12 well plate, containing one milliliter of growth medium. Incubate the plate at 37 degrees Celsius under 5%carbon dioxide until analysis.

استخراج قلب جنين الفأر وتثقيبه كهربائيا كنهج وراثي

Electroporated Mouse Cardiac Cell Isolation for Cell Sorting and Analysis

To begin, obtain electro operated mouse hearts extracted from wild type CD1 mice, 12 to 12.5 days after crossing. Transfer a heart into a tube containing one milliliter of ice cold digestion medium. With a syringe, apply gentle pressure on the heart a few times to chop it.Incubate the chopped tissue on a hot plate at 37 degrees Celsius for 45 minutes at 600 rotations per minute. Then filter the digestion mixture through a 70 micrometer cell strainer into a new tube. Next, filter the pass through volume again with a 40 micrometer cell strainer into a new 50 milliliter tube.Pipette 500 microliters of the FBS into the filtrate. Make up the volume up to 30 milliliters with cold DMEM. Centrifuge the suspension at 240G for 10 minutes at room temperature.Discard the supernatant. Then place the tube upside down on a paper towel to dry completely. For cell sorting, resuspend the cells in 300 microliters of sorting buffer.Finally, add 0.3 microliters of DAPI and perform cell sorting. The hearts were beating and appeared to be in good condition 24 hours post electroporation. The myocardium and epicardium did not show any signs of apoptosis.Analysis of the fluorescence activity showed a mosaic GFP signal in almost all four chambers of the heart.