Name: preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts
Uploaded: 2016-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
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We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).

Todos los pasos descritos se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité de Bioseguridad y el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Hospital Infantil de Boston. Hospital Infantil de Boston tiene instalaciones libres de patógenos de ratón con regulados por la luz / oscuridad ciclos y climatizador. jaulas de cambio de personal veterinario y cuidado de los animales y garantizar la salud de los ratones. Las instalaciones están certificadas AAALAC y tienen certificación activa Animal Welfare Aseguramiento (AAALAC acreditación otorgada el 24/02/1992 Garantía de Bienestar Animal. Number: A3303-01). Los ratones fueron sacrificados por CO 2 emitido desde una fuente de gas comprimido. Las muestras de tejido fueron recogidos después de confirmar que la frecuencia cardíaca, el movimiento y la respiración de los animales habían cesado. Roedores neonatales son resistentes a CO 2 eutanasia y se sacrificaron por decapitación usando unas tijeras afiladas. Estos métodos son consistentes con las recomendaciones del Grupo sobre la eutanasia de la American Veterinary Medical Asociación. 1. Generación de constructos rAAV9 por clonación de un ADNc o shRNA cassette de expresión en el esqueleto del plásmido NOTA: El plásmido rAAV9, que contiene las repeticiones terminales invertidas (RTI) de AAV2, que se utiliza para la sobreexpresión de genes se ha modificado para albergar el TNNT2 pollo promotor (rAAV9.cTNT), que permite la expresión de los cardiomiocitos-específico de genes transducidos 25,26,29. sitios únicos NheI y KpnI se han introducido en el plásmido, corriente abajo del promotor. Los fragmentos de ADNc que codifican los genes de interés se pueden clonar en la columna vertebral rAAV9 el uso de estos dos sitios de restricción 25,26,29. Aquí, como un ejemplo, se generó el vector rAAV9 para la sobreexpresión del gen de la GFP en los corazones de ratón. El plásmido resultante contiene el cTNT :: casete de GFP flanqueado por dos ITR sitios (Figura 1). construcciones rAAV9.U6 :: shRNA fueron utilizados para el gen desmontables 25. Diseño shRNAs usandolos servidores en línea de diseño shRNA. rAAV9.U6 :: shRNA se puede generar ya sea por hibridación y ligación de oligos que contienen secuencias de ADN shRNA en las enzimas de restricción digerido vectores rAAV9 que albergan el promotor U6, o por PCR de largo alcance e intra-molecular a base de montaje Gibson &quot;sin costuras&quot; construcción 30. El plásmido resultante debería contener el casete de U6-shRNA flanqueado por dos ITR sitios (Figura 2). Aquí, como un ejemplo, el vector de rAAV9.U6 :: shRNA se construyó para desmontables TRBP ARNm (secuencia TRBP shRNA: GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG). A scramble shRNA se utilizó como control negativo (CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG). <ol><li> Clonar el casete de expresión de ADNc o shRNA en el plásmido columna vertebral rAAV9. Transformar el ADN en las células de E. coli competentes 25. NOTA: Use células de E. coli stbl2 o stbl3 para la transformación del ADN rAAV9 para minimizar la recombinación ITR no deseado. </li><li> Recoge laclon positivo a partir de las células de E. coli transformadas. Amplificar el cultivo en 500 ml de medio de Lilly-Barnett y extraer el plásmido rAAV9 de las células bacterianas 25-30. NOTA: Midi / Maxi preparar el plásmido rAAV9 para obtener una alta cantidad de ADN (&gt; 100 mg). Antes de generar el virus, siempre analizar la integridad de la secuencia de los plásmidos de VAA mediante digestión de restricción y electroforesis en gel de agarosa, como se describió previamente (http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html). </li></ol> 2. Transfección de células HEK293 con plásmidos rAAV9 <ol><li> Preparar 1 mg / l de solución de polietilenimina lineal (PEI). Disuelva el polvo de PEI en DH libre de endotoxina de O 2 que se ha calentado a 70-80 ° C. Después de enfriar a RT, neutralizar la solución a pH 7,0 con HCl 1. Se esteriliza con filtro (0,22 micras) la solución. Alícuota de la / l PEI solución de 1 g (1,400 l / tubo) y almacenar el solutión a -20 ° C. </li><li> células HEK293 Cultura en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina. Cultivar las células en un incubador a 37ºC con dióxido de carbono 5 ± 0,5% (CO 2). </li><li> En el día 0, la placa de células HEK293 en diez platos de 150 mm 18-20 h antes de la transfección mediante el fraccionamiento de&gt; 90% de células confluentes en una dilución 1: 2. NOTA: En el día 1, las células deben alcanzar el 90% de confluencia. </li><li> En el día 1, transfectar células HEK293 con el plásmido rAAV9 (por ejemplo, rAAV9.cTNT :: GFP o rAAV6.U6 :: shRNA construye), plásmido Ad-ayudante, y el plásmido AAV-Rep / Cap usando PEI 25,26,29. <ol><li> Para 10 platos de células en 90% de confluencia, mezclar 70 g de AAV-Rep plásmido / Cap, 70 g pf rAAV9 plásmido, y 200 g de Ad-Helper plásmido en un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Si las células son menos confluentes, ajustar la cantidad de ADN proporcionalmente. Por ejemplo, si las células están en 75% confluentes, reducir ella cantidad de ADN de forma proporcional (75/90 de la cantidad que se muestra en el paso 2.4.1): mezclar 70 x 75/90 = 58,3 g de AAV-Rep plásmido / Cap, 70 x 75/90 = 58,3 g de plásmido rAAV9, y 200 x 75/90 = 166,7 g de Ad-Helper plásmido en un tubo de centrífuga de 50 ml. </li><li> Añadir 49 ml de RT DMEM (sin FBS) al tubo de 50 ml y se mezcla bien. </li><li> Añadir 1,360 l de solución de PEI para que el PEI: relación de ADN (v / w) sea de 4: 1. Mezclar bien. Incubar a TA durante 15 - 30 min. </li><li> Añadir 5 ml de la mezcla preparada en la etapa 2.4.4 a cada placa de 150 mm (50 ml de la mezcla durante diez platos 150 mm). </li></ol></li><li> Cultivar las células en una incubadora a 37 ° con 5 ± 0,5% de CO2 durante 60 a 72 hr. </li></ol> 3. Cosecha de células HEK293 transfectadas y purificación de vectores rAAV9 <ol><li> Recoger las células 60-72 horas después de la transfección. Desalojar y suspender las células en los platos pipeteando arriba y abajo con el medio de cultivo. Transferir todas las suspensiones celulares a estérilestubos de 50 ml. </li><li> Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min. Resuspender el sedimento celular con 5 ml de PBS en cada tubo y combinar todas las suspensiones de células en un tubo de 50 ml. </li><li> Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante. En este paso, almacenar el sedimento celular a -80 ° C o inmediatamente purificar el AAV a partir del sedimento, como se describe en los pasos 3.4-3.15. </li><li> Preparar el tampón de lisis: NaCl 150 mM y Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Se esteriliza con filtro (0,22 M). Almacenar el tampón a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado con 10 ml de tampón de lisis. </li><li> Congelar el lisado a -80 ° C o en el baño de hielo seco / etanol, y luego descongelar a 37 ° C. Vortex durante 1 min. Congelar y descongelar el lisado 3 veces. </li><li> Añadir solución de MgCl 2 al lisado descongelado (hacer la concentración final de MgCl 2 en el lisado ser 1 mM). Añadir la nucleasa a una concentración final de 250 U / ml. Incubar a 37 ° C durante 15 min para disolver el ADN aggr / proteínadele-. NOTA: Si la agregación de ADN / proteína no quede disuelto después de nucleasa o endonucleasa de tratamiento, Dounce homogeneizar los lisados ​​20 veces. </li><li> Centrifugar la muestra a 4.800 xg durante 20 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante. </li><li> Mientras tanto, preparar la solución de gradiente de iodixanol: <ol><li> Preparar el 17% de la solución de gradiente mediante la mezcla de 5 ml de 10x PBS, 0,05 ml de 1 M MgCl 2, 0,125 ml de 1 M de KCl, 10 ml de 5 M NaCl, y 12,5 ml ofdensity medio de gradiente. Ajustar el volumen total a 50 ml usando H 2 O. </li><li> Preparar la solución de 25% mediante la mezcla de 5 ml de 10x PBS, 0,05 ml de 1 M MgCl 2, 0,125 ml de 1 M KCl, 20 ml de medio de gradiente de densidad, y 0,2 ml de 0,5% (w / v) de rojo de fenol. Ajustar el volumen total a 50 ml usando H 2 O. </li><li> Preparar la solución de 40% mediante la mezcla de 5 ml de 10x PBS, 0,05 ml de 1 M MgCl 2, 0,125 ml de 1 M KCl, y 33,3 ml de medio de gradiente de densidad. Ajustar el volumen total a 50 ml usandoH2O </li><li> Preparar la solución de 60% mediante la mezcla de 0,05 ml de 1 M MgCl 2, 0,125 ml de 1 M KCl, 50 ml de medio de gradiente de densidad, y 0,1 ml de 0,5% (w / v) de rojo fenol. </li></ol></li><li> Con una aguja y una jeringa, cargar la solución de gradiente de iodixanol en el tubo de polipropileno del orden de 5 ml de 17%, 5 ml de 25%, 5 ml de 40% y 5 ml de 60%, a partir de la parte inferior. Cargar todo el lisado obtenido de la etapa 3.8 (14-16 ml) en la parte superior de la pendiente. El gradiente, enumerados desde la parte inferior a la parte superior, es 60%, 40%, 25%, 17%, y la capa de lisado. Llenar el tubo con tampón de lisis y se cubre con el corcho. </li><li> Se centrifuga a 185.000 xg durante 90 minutos a 16 ° C. </li><li> Recoger la fracción viral (capa de 40%) con una jeringa. Insertar la aguja (calibre 21) en la intersección entre los 40% y 60% fracciones, solamente la aspiración de la capa de 40%. NOTA: Evitar la aspiración de la capa CUALQUIER 25%. </li><li> Mezclar la fracción viral con esterilizada de polioxietileno-polyoxyprosolución de copolímero de bloques de propileno PBS (10% de polioxietileno-polioxipropileno de bloques de copolímero de stock 1: 10.000 diluida en PBS) hasta un volumen total de 15 ml. Cargar la mezcla en el tubo de filtro (corte de PM = 100 kD). Centrifugar a 2000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Descartar la solución en la parte inferior. Vuelva a llenar el tubo de filtro con una solución de PBS copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno con un volumen total de 15 ml. Centrifugar a 2000 xg durante 20 min a 4 ° C. Repita este paso dos veces más. Recoger el virus rAAV9 purificado (la fracción por encima del filtro). </li><li> Transferir el rAAV9 purificado en el tubo de filtro para tubos de 1,7 ml. Alícuota de la rAAV9 purificado (100 a 400 l / tubo, dependiendo del volumen y el título del AAV) y almacenar el virus a -80 ° C. NOTA: Evitar repetidas congelaciones deshielos. </li></ol> 4. Medición del título de rAAV9 <ol><li> Preparar las muestras de ADN estándar. <ol><li> Diseño PCR específica y eficientecebadores para los vectores de rAAV9 y optimizar la condición de PCR. NOTA: Los primers utilizados en este estudio son &quot;Adelante: TCGGGATAAAAGCAGTCTGG; Reverso: TCGGACGGAGATACGTGAGT&quot;. La reacción de PCR se realizó con las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 3 min; 35 ciclos de 95 ° C para 20 segundos, 60 ° C durante 15 seg, y 72 ° C durante 10 seg; y la extensión final a 72 ° C durante 10 min. Sin embargo, los cebadores optimizados y las condiciones de PCR son plásmido específico, como la secuencia de inserción en el vector rAAV9 puede afectar a la especificidad y eficiencia de la PCR 31. </li><li> Realizar la reacción de PCR con las condiciones que se muestran en el paso 4.1.1. Se purifica el producto de PCR con un kit de extracción de gel. </li><li> Medir la concentración de ADN se purificó usando un espectrofotómetro. Calcular la concentración en número molecular de ADN basado en el peso / longitud molecular del producto de PCR. <ol><li> Calcular la concentración molecular utilizando la siguiente ecuación: moconcentración lecular (moléculas de ADN o fragmentos / ml) = 6,23 x 10 x 23 -1 moles Con. x 10 -6 / MW. Nota: (6,23 x 10 23 mol -1 es el número de Avogadro; concentración Con .: ADN en microgramos / ml; MW .: peso molecular en g / mol). Por ejemplo, si la concentración obtenida del producto de PCR es de 100 mg / ml y su longitud es 200 pb, el peso molecular del ADN de doble cadena es 2 x 200 x 310 = 124.000 (el peso molecular medio de cada nucleótido en la ADN de una sola cadena es de aproximadamente 310 g / mol). La concentración molecular (moléculas de ADN / ml) = 6,23 X 10 23 mol -1 x 100 mg / ml x 10 -6 / 124.000 g / mol = 5,18 x 10 14 moléculas de ADN / ml. </li><li> Realizar una serie de diluciones del fragmento de ADN y preparar las muestras estándar, con concentraciones de 10 13 moléculas / ml, 10 12 moléculas / ml, 10 11 moléculas / ml, 10 10 moléculas / ml, 10 9 moléculas / ml, 10 <sup&gt; 8 moléculas / ml, y 10 7 moléculas / ml. Utilice 1 l de solución para cada muestra estándar para la PCR cuantitativa (qPCR, en el paso 4.6). </li></ol></li></ol></li><li> Mezclar 5 l de solución de rAAV9 purificado con 5 l de 10x tampón de ADNasa, 1 l de ADNasa (10.000 U / ml), y 39 l de ddH 2 O. El volumen total debe ser de 50 l. </li><li> Incubar el vial a 37 ° C durante 30 min para eliminar el ADN plasmídico sin embalar residual. </li><li> Inactivar la DNasa a 95 ° C durante 10 min. Enfriar la solución, añadir 44 l de H2O, 5 l de 10x tampón de ADNasa, y 1 l de proteinasa K madre (10 mg / ml). </li><li> Incubar la solución a 50 ° C durante 2 hr. Detener la reacción e inactivar la proteinasa K a 95 ° C durante 10 min. </li><li> Utilice 1 l de la muestra para el ensayo de PCR cuantitativa (qPCR). Calcular el título. <ol><li> Ejecutar PCR cuantitativa (qPCR) con los cebadores diseñados en el paso 4.1.1 usando las muestras de frpaso om 4.1.4 (muestras estándar) y de la etapa 4.5 (muestras a medir). <ol><li> Para cada reacción, la mezcla 10 l de 2x mezcla maestra verde (que contiene la polimerasa Taq, mezcla de dNTP, tampón, MgCl2, y el tinte verde), 0,5 l de cebador directo (5 M), 0,5 l de cebador inverso (5 M), 8 l de H2O y 1 l de la muestra a medir. Realizar qPCR con las siguientes condiciones: mantener las muestras a 50 ° C durante 2 min y 95 ° C durante 10 min; realizar 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y a 60 ° C durante 1 min; para la etapa de fusión, se incuban las muestras a 95 ° C durante 30 seg y 60 ° C durante 15 s. Generar la curva estándar en base a los números de C T de las muestras patrón (Figura 3). </li></ol></li><li> Calcular la concentración molecular / título de la muestra de AAV en contra de la curva estándar. El rAAV9 tiene un genoma de ADN de cadena simple, por lo que la concentración molecular será 2 veces más alta que lavalor calculado (potencia 2x (10, y), la Figura 3B). Además, el título de la rAAV9 purificada será 20 veces más alta que la que se obtiene a partir del cálculo debido a la dilución 1:20 del virus en las reacciones de DNAsa y proteinasa K (5 l en 100 total de l). </li></ol></li></ol> 5. rAAV9 inyección en ratones recién nacidos y los ensayos de expresión génica en el corazón <ol><li> Preparar soluciones de trabajo rAAV9 en solución de PBS copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno. Hacer la reserva de virus con los títulos de 1-7 x 10 12 partículas / ml. NOTA: Entregar 50-70 l de solución rAAV9 en cada día posnatal 0,5-1,5 ratón mediante inyección subcutánea. Para lograr la sobreexpresión génica eficaz o desmontables, se recomienda realizar una prueba piloto para cada estudio para optimizar la cantidad de AAV inyectado. Utilice la misma cantidad de rAAV9.cTNT :: Luc o controles rAAV9.U6 :: scramble para cada estudio para minimizar el sesgo. NOTA: Se utilizó 1-1,510 x 11 partículas / cachorro para la sobreexpresión ya 2,5 - 5 x 10 11 partículas / cachorro de caída en el día postnatal 0,5-1,5 millas ce). </li><li> El tratamiento de ratones recién nacidos con rAAV9 en P0.5-P2.5 mediante inyección subcutánea. <ol><li> Pre-llenar un / 2, 0,33 x 12,7 mm jeringa de insulina 29G1 con la solución rAAV9. Tenga cuidado de eliminar las burbujas de aire. </li><li> Mantenga el cachorro crio-anestesiados en una mano con el pulgar y el índice. Antes de la inyección, desliza la piel de la espalda de la cría con un palo hisopo saturado con alcohol isopropílico al 70% para mantener la condición estéril. Insertar la aguja de la jeringa en el tejido subcutáneo anterior-dorsal del animal en un ángulo de 5 a 10 °. Inyectar 50 a 70 l de la solución rAAV9 utilizando la jeringa de insulina. NOTA: rAAV9 también puede ser entregado a la ratón a través de inyección intraperitoneal o intravenosa 26,27. La expresión eficiente de los genes entregados en el corazón se puede obtener. Sin embargo, inyección intraperitonealion a veces puede resultar en la expresión de fugas en el hígado. Después de la inyección, la condición de los cachorros se controló cada día. </li></ol></li><li> El nivel de la expresión génica en el corazón se puede controlar con qPCR, inmunofluorescencia o inmunotransferencia de tipo Western (resultados representativos se muestran en las figuras 4 y 5) 25,26. NOTA: Los ratones fueron sacrificados por CO 2 emitido desde una fuente de gas comprimido. Las muestras de tejido fueron recogidos después de confirmar que la frecuencia cardíaca, el movimiento y la respiración de los animales habían cesado. Roedores neonatales son resistentes a CO 2 eutanasia y se sacrificaron por decapitación usando unas tijeras afiladas. El método es consistente con las recomendaciones del Grupo sobre la eutanasia de la American Veterinary Medical Association. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+shRNA+by+AAV9+provides+highly+efficient+knockdown+of+ubiquitously+expressed+GFP+in+mouse+heart,+but+not+liver.">Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver.</a> PLoS One. 8, e75894 (2013).</li><li>Lovric, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+cardiac+and+skeletal+myocytes+induces+permissivity+to+AAV+transduction+by+relieving+inhibition+imposed+by+DNA+damage+response+proteins.">Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins.</a> Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Es importante minimizar la recombinación ITR no deseado durante la construcción del plásmido. Antes de generar el virus, hay que vigilar siempre la integridad de los plásmidos ITR de AAV mediante digestión de restricción y electroforesis en gel de agarosa. Es imposible obtener 100% plásmidos intactos, pero la relación de recombinación debe minimizarse tanto como sea posible. Menos de 20% es aceptable para el envasado rAAV9 éxito. Es de destacar que el cultivo de las bacterias a menor temperatura (30 ° C) con ...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.
One of the authors names and affiliation was corrected from:
Jian-Ming Jiang3,4 
3 Department of Genetics, Harvard Medical School 
4 Howard Hughes Medical Institute
to:
Jianming Jiang5 
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.

Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

El control de la expresión o actividad de genes específicos en diversos sistemas biológicos se ha convertido en una estrategia valiosa en el estudio de la función del gen 1. Un medio directo de lograr este objetivo es manipular secuencias de nucleótidos y generar alelos mutantes. A pesar de hacer cambios precisos, dirigidas al genoma de las células vivas es todavía un tiempo y la práctica intensiva en trabajo, el desarrollo de las poderosas herramientas y TALEN CRISPR / Cas9 ha abierto una nueva era de la edición genoma 2-5. Un método de laboratorio más habitual para la manipulación genética se ha centrado en la introducción de material genético (ADN y ARN que contienen secuencias codificadoras o siRNAs / shRNAs) en las células para expresar el gen o desmontables (s) de interés 1,6. En muchos casos, el principal cuello de botella para la manipulación genética es la entrega de ADN, ARN, o proteína en las células. Con respecto a los estudios in vitro, transfecti eficienteen los sistemas se han establecido en muchas líneas celulares cultivadas. Sin embargo, en el modelo de ratón, en particular, la entrega de genes in vivo en es más difícil. Hay una serie de barreras extra e intracelulares que necesitan ser pasado por alto con el fin de lograr la captación celular eficiente de los reactivos exógenos. Otros obstáculos incluyen la rápida eliminación y la corta duración del 7,8 entregado materiales. Una estrategia para evitar estos problemas es el uso de vectores virales como &quot;portadores&quot; o &quot;vehículos&quot; para la entrega de genes in vivo. Las propiedades de transducción evolucionado natural de los virus permiten la prestación eficiente de un gen de interés en células 7,9,10. Numerosos tipos de vectores virales se han desarrollado y permitir flexibilidad en la manipulación de genes in vivo en diferentes tipos de células y órganos en ratones. Los sistemas virales más comúnmente usados ​​incluyen Retrovirus, Lentivirus, adenovirus y virus adeno-asociado (AAV) <shasta&gt; 11. Los retrovirus son virus de ARN de cadena simple y se puede introducir su material genético al genoma de la célula huésped de una manera estable durante la división mitótica, proporcionando el potencial para la expresión de toda la vida de los genes transducidos en las células diana y órganos 12-14. Sin embargo, muchos tipos de retrovirus infectan solamente las células en división, y su eficacia en las células que no se dividen es muy baja 15. Esto limita su utilidad para la administración de genes. Lentivirus es un género de la familia Retroviridae. A diferencia de otros retrovirus, lentivirus puede infectar tanto a células que se dividen y que no se dividen y se ha utilizado ampliamente para la transferencia génica en post-mitótico y células diferenciadas altamente-16. El ciclo de vida de Lentivirus también implica la integración de ADN del vector en el genoma huésped. Por lo tanto el suministro de genes, Lentivirus mediada permite la expresión estable y de larga duración de los elementos genéticos transducidas 16-18. Sin embargo, esta función puede representar un doble-eespada DGED en el uso de estos virus para manipular la expresión génica, como la integración de ADN del vector puede dar lugar a la mutagénesis de inserción en las células huésped y puede causar efectos artefactual. Adenovirus es otro sistema de administración de genes ampliamente utilizado. A diferencia de los retrovirus y lentivirus, adenovirus son no integradas y no interfieren con la integridad genómica de las células huésped 8,10,11,19. Además, los adenovirus puede transfectar ADN en muchos tipos de células, y la infección no depende de la división celular activa 19. Otra característica importante de los adenovirus es la facilidad de purificación de vector, como los vectores virales tienen la capacidad de replicarse 19,20. Sin embargo, la principal advertencia de este sistema es que la infección por adenovirus puede desencadenar respuestas inmunes fuertes en las células diana y los órganos 19, restringiendo su uso en muchas investigaciones, en particular en los estudios de terapia génica. En comparación con este tipo diferentes de vectores virales, virus asociado a adeno recombinante (rAAV) parece ser el sistema de suministro de genes ideales 21,22. Exhibe inmunogenicidad y patogenicidad 23,24 mínima. Además, rAAV infecta a una amplia gama de tipos de células, incluyendo tanto las células que no se dividen y divisoria. En la mayoría de los casos, rAAV no se integra en el genoma de acogida; por lo tanto, el riesgo de cambios genéticos o genómicos no deseados en las células diana es baja 22. Recientemente, los sistemas de rAAV se han utilizado con éxito para la entrega in vivo de ADN que codifica proteínas, miRNAs, shRNAs, y CRISPR-gRNAs en ratón músculo cardíaco 23,25-29. Esta metodología ha facilitado las investigaciones fundamentales y los estudios de terapia génica en el campo de la investigación cardiovascular. Aquí, el procedimiento detallado para generar vectores rAAV9 que sobreexpresan de manera eficiente o desmontables los genes de interés en los corazones de ratón se ha descrito. El protocolo proporciona un método simple y eficaz dela manipulación de la expresión génica cardiaca en modelos experimentales murinos.

<table><tbody><tr><td>Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>#23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Polypropylene, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56)</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td># 362183</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease, ultrapure</td><td>SIGMA</td><td>#E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Density Gradient Medium(Iodixanol)</td><td>SIGMA</td><td>#D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>#UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory pipetting needle with 90&amp;deg; blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub</td><td>SIGMA</td><td>#CAD7942-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solution (Pluronic&amp;reg; F-68 solution)</td><td>SIGMA</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA</td><td>3115828001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge machine</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge System</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>rAAV9 vector</td><td>Penn Vector Core</td><td>P1967</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts

El control de la expresión o actividad de genes específicos a través de la entrega de miocardio de los materiales genéticos en modelos murinos permite la investigación de las funciones de genes. Su potencial terapéutico en el corazón también se puede determinar. Hay enfoques limitados para la intervención molecular in vivo en el corazón del ratón. Virus adeno-asociado (rAAV) basada en la ingeniería del genoma recombinante se ha utilizado como una herramienta esencial para la manipulación genética cardiaca in vivo. Las ventajas específicas de esta tecnología incluyen una alta eficiencia, alta especificidad, porcentajes de integración genómica baja, mínimo inmunogenicidad y patogenicidad mínima. A continuación, se describe un procedimiento detallado para construir, empaquetar y purificar los vectores rAAV9. La inyección subcutánea de rAAV9 en cachorros neonatales como resultado la expresión robusta o knockdown eficaz del gen (s) de interés en el corazón de ratón, pero no en el hígado y otros tejidos. Uso de la cardiaca específiSe obtuvo c TNNT2 promotor, la alta expresión de gen GFP en el corazón. Además, ARNm objetivo se inhibió en el corazón cuando se utilizó un rAAV9-U6-shRNA. Trabajando conocimiento de la tecnología rAAV9 puede ser útil para investigaciones cardiovasculares.

Las estrategias para la construcción de plásmidos rAAV9 rAAV9.U6 :: shRNA rAAV9.cTNT :: GFP o se muestran en las figuras 1 y 2, respectivamente. Como muestran los ejemplos, el vector rAAV9 fue generado para sobreexpresar el gen de la GFP en los corazones de ratón. El plásmido resultante contiene el cTNT :: casete de GFP flanqueado por dos ITR sitios (Figura 1). El vector rAAV9.U6 :: shRNA se construyó para desmontables TRBP mRNA <st...

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Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Preparación de rAAV9 que sobreexpresan o una caída en los genes de ratón Corazones

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

preparation-of-raav9-to-overexpress-or-knockdown-genes-in-mouse-hearts

Research

JoVE Journal

Genetics

12.7K vistas.  Boston Children's Hospital. In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described. 

Video: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

Entrega de ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Investigación

Genética

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Biología

Transgénesis basada en electroporación de células cardíacas en corazones de ratón

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Autor destacado: Transgénesis de células cardíacas para el cribado rápido de genes

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Un enfoque eficiente de transgénesis para la entrega de genes en el corazón embrionario de ratón

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Biología del Desarrollo

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Medicina

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Etiquetado de la célula y de inyección en Desarrollo de embriones de ratón Corazones

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblasts can be reprogrammed into induced cardiomyocytes (iCMs). These iCMs, when generated in situ in an infarcted heart, integrate electrically and mechanically with the surrounding myocardium, leading to a reduction in scar size and an improvement in heart function. Because of the relatively low reprogramming efficiency, purity, and quality of the iCMs, characterization of iCMs remains a challenge. The currently used methods in this field, including flow cytometry, immunocytochemistry, and qPCR, mainly focus on cardiac-specific gene and protein expression but not on the functional maturation of iCMs. Triggered by action potentials, the opening of voltage-gated calcium channels in cardiomyocytes leads to a rapid influx of calcium into the cell. Therefore, quantifying the rate of calcium influx is a promising method to evaluate cardiomyocyte function. Here, the protocol introduces a method to evaluate iCM function by calcium (Ca2+) flux. An &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mouse strain was established by crossing Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referred to as Myh6-Cre below) with Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mice. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) from P0-P2 neonatal mice were isolated and cultured in vitro, and a polycistronic construction of MGT was introduced to NCFs, which led to their reprogramming to iCMs. Because only successfully reprogrammed iCMs will express GCaMP3 reporter, the functional maturation of iCMs can be visually assessed by Ca2+ flux with fluorescence microscopy. Compared with un-reprogrammed NCFs, NCF-iCMs showed significant calcium transient flux and spontaneous contraction, similar to CMs. This protocol describes in detail the mouse strain establishment, isolation and selection of neonatal mice hearts, NCF isolation, production of retrovirus for cardiac reprogramming, iCM induction, the evaluation of iCM Ca2+ flux using our reporter line, and related statistical analysis and data presentation. It is expected that the methods described here will provide a valuable platform to assess the functional maturation of iCMs for cardiac reprogramming studies.

We describe here, the establishment and application of an Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mouse reporter line for cardiac reprogramming assessment. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) isolated from the mouse strain are converted into induced cardiomyocytes (iCMs), allowing for convenient and efficient evaluation of reprogramming efficiency and functional maturation of iCMs via calcium (Ca2+) flux.

Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

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Silenciamiento selectivo de genes en el plexo coroideo

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and pathological conditions. Recent research has shown that regulating ChP activity may offer protection against CNS disorders. However, studying the biological function of the ChP without affecting other brain regions is challenging due to its delicate structure. This study presents a novel method for gene knockdown in ChP tissue using adeno-associated viruses (AAVs) or cyclization recombination enzyme (Cre) recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT). The results demonstrate that after injecting AAV or CRE-TAT into the lateral ventricle, the fluorescence was exclusively concentrated in the ChP. Using this approach, the study successfully knocked down the adenosine A2A receptor (A2AR) in the ChP using RNA interference (RNAi) or Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) systems, and showed that this knockdown could alleviate the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This technique may have important implications for future research on the ChP's role in CNS disorders.

Autor destacado: Conocimientos e innovaciones en técnicas de manipulación de la expresión génica para la investigación del plexo coroideo 

Here, we describe a method to selectively alter gene expressions in the choroid plexus while avoiding any impact in other brain areas.

Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

Preparación de rAAV9 que sobreexpresan o una caída en los genes de ratón Corazones

Resumen

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Entrega de ARNm modificado en un modelo de ratón de infarto de miocardio

El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal

Un enfoque eficiente de transgénesis para la entrega de genes en el corazón embrionario de ratón

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Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

Etiquetado de la célula y de inyección en Desarrollo de embriones de ratón Corazones

Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo

Eliminación selectiva de genes en el plexo coroideo