Agradecemos al Centro de Medicina Comparativa e Investigación de Dartmouth College por proporcionar la cría diaria de los animales utilizados en este protocolo. También agradecemos a Leah Jacob y Adwaita Bose por su ayuda para probar el protocolo y fotografiar a los animales. Por último, agradecemos al laboratorio de Ann Miller por su formación en la práctica del tatuaje. Este trabajo fue apoyado por la subvención R00 de los NIH GM147826 a J.L.

Todos los procedimientos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College.
1. Configuración del equipo
NOTA: Se incluye un flujo de trabajo para el procedimiento y un ejemplo de configuración del banco (Figura 1).
<ol><li>Conecte la pistola de tatuaje y el pedal a la fuente de alimentación. Coloque el pedal debajo de la superficie de trabajo.</li>
	<li>Montaje de la pistola de tatuajes<ol><li>Con una llave Allen o un destornillador hexagonal, afloje los tornillos de la empuñadura (Figura 2A, con un círculo rojo).</li>
		<li>Inserte la punta de plástico completamente en la empuñadura. Apriete el tornillo para mantenerlo en su lugar.</li>
		<li>Inserte el tubo de metal en la parte posterior de la empuñadura (Figura 2A). Esto se ajustará, así que insértelo a la mitad de su longitud. Apriete el tornillo para mantenerlo en su lugar.</li>
		<li>Inserte una aguja de tatuaje a través de la parte posterior de la empuñadura para que se asiente cómodamente en la punta de plástico en la parte delantera de la empuñadura (Figura 2B).</li>
		<li>Deslice la parte posterior de la aguja y el tubo de metal a través de la abrazadera del tubo. Ajuste el tubo de metal para que la aguja quepa cómodamente en la punta de plástico (Figura 2B). Apriete a mano la abrazadera del tubo hasta que el tubo no pueda moverse (Figura 2C).</li>
		<li>Retire la junta tórica negra y enganche la aguja en el brazo del rotor; vuelva a colocar la junta tórica para asegurar la aguja en su lugar (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>Ajuste el voltaje de la fuente de alimentación para que haya suficiente energía para perforar la piel, pero no tan potente como para que sea difícil de controlar. Una vez que la fuente de alimentación esté enchufada y conectada, presione el pedal para asegurarse de que la máquina esté funcionando. Tenga cuidado de no apuntar la aguja hacia usted mismo o hacia otras personas. NOTA: La máquina de tatuar utilizada en este protocolo funciona mejor entre 6.0 y 9.0 V, pero esto puede variar entre las máquinas de tatuar y las fuentes de voltaje y debe determinarse empíricamente.</li>
	<li>Llene la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o un tintero de plástico provisto con tinta negra para tatuajes hasta aproximadamente tres cuartas partes de su capacidad.</li>
</ol>2. Anestesia
<ol><li>Prepare la anestesia en un tanque lo suficientemente grande como para sumergir una rana hembra adulta de X. laevis .<ol><li>Usando agua segura para ranas (sin cloro), agregue tricaína a la concentración final de 1.5 g/L y bicarbonato de sodio a la concentración final de 3.5 g/L. Mezcle para disolver. El pH de esta solución es de 7,15. PRECAUCIÓN: La tricaína es un irritante.</li>
	</ol></li>
	<li>Sumerge una rana en el tanque de anestesia. Asegúrese de que la rana permanezca sumergida en la solución de tricaña hasta que esté anestesiada (7-8 min).<ol><li>Para verificar si la rana está completamente anestesiada, levántela, sujétala boca abajo y apriétala firmemente en una pata. Si la rana no se inmuta ni responde, se puede tatuar.</li>
		<li>Si las ranas tardan más de 10 minutos en ser anestesiadas, prepare una solución fresca de tricaína tamponada con bicarbonato de sodio. NOTA: Las ranas no deben pasar más de 30 minutos en la solución de tricaína15.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Tatuaje
NOTA: Antes de tatuar un animal vivo, puede ser útil practicar con una pieza de fruta con una cáscara firme (como un limón o un plátano).
<ol><li>Prepara un tanque de recuperación para las ranas antes de tatuarlas. Llene un tanque con 10-15 L de agua fresca segura para ranas y agregue una isla de espuma de poliestireno. Esto proporcionará una superficie para que la rana se despierte sin ahogarse. NOTA: Se puede hacer una isla de espuma de poliestireno con la tapa de un contenedor de envío frío de espuma de poliestireno colocado dentro de una bolsa con cierre hermético.</li>
	<li>Coloque a la rana anestesiada boca arriba sobre una toalla de papel seca o papel de banco (Figura 3A). Use toallas de papel sin blanquear (marrones) para todo el trabajo que involucre ranas.</li>
	<li>Con una toallita seca sin pelusa, limpia el agua y la mucosidad del pecho de la rana.</li>
	<li>Encuentra el esternón en el centro del pecho de la rana con los dedos y, con la mano no dominante, mantén la piel tensa.</li>
	<li>Marcando la rana<ol><li>Sostenga la pistola de tatuaje ensamblada verticalmente en relación con la superficie de trabajo y sumerja la aguja en la tinta (Figura 3B).</li>
		<li>Manteniendo la pistola de tatuaje montada en posición vertical, presiona la punta de la aguja sobre la piel de la rana antes de pisar el pedal. Dibuja líneas en la piel de la rana mientras aplicas una presión uniforme. NOTA: Es normal que haya un poco de sangrado o enrojecimiento, al igual que un poco de descamación de la piel.</li>
		<li>Si la aguja se engancha en la piel de la rana, limpia el exceso de tinta o piel de la aguja con una toallita. El exceso de tinta es normal durante el tatuaje.</li>
		<li>Si el pecho de la rana está cubierto con demasiada tinta para ver claramente el área que se está marcando (Figura 3C), limpie el exceso de tinta con agua apta para ranas y una toallita (Figura 3C'). Luego, absorba la humedad con una toallita seca y continúe entintando. NOTA: Se puede preparar una botella exprimible de agua apta para ranas antes de tatuar.</li>
		<li>Continúe entintando la misma área hasta que queden oscuros y legibles después de limpiar el exceso de tinta (Figura 3D). En lugar de dibujar toda la marca o el número de un solo trazo, haz repetidamente trazos más pequeños, especialmente para las curvas.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Recuperación
<ol><li>Moje una toalla de papel con agua apta para ranas y colóquela plana sobre la isla de espuma de poliestireno (Figura 4A).</li>
	<li>Devolver las ranas a los tanques en pie<ol><li>Coloque la rana boca abajo sobre la toalla frente al agua (Figura 4B). Dobla la mitad de la toalla de papel sobre la mitad trasera de la rana y, con las manos ahuecadas, humedece la parte superior de la rana. Una vez que una rana emerge de la anestesia (aproximadamente 1 h después del tatuaje), entrará en el agua de forma independiente y nadará normalmente.</li>
		<li>Regrese las ranas a un alojamiento a largo plazo después de 24 horas, una vez que el tatuaje haya sanado por completo.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Limpieza y mantenimiento de equipos
<ol><li>Reutilización y esterilización en autoclave de agujas de tatuaje<ol><li>Enjuague las agujas con isopropanol al 100% y agua desionizada para aflojar la tinta y frotar la tinta restante que no se haya disuelto.</li>
		<li>Después de fregar, coloque las agujas en un estuche metálico para esterilizar en autoclave o envuélvalas con papel de aluminio y autoclave durante 30 minutos en un ciclo seco.</li>
	</ol></li>
	<li>Si hay tinta en pedazos de la máquina de tatuar u otro equipo, límpialo con etanol al 100% y una toalla de papel.</li>
	<li>La solución anestésica tiene una concentración final de tricaína de aproximadamente el 0,5%. Deséchelo de acuerdo con las pautas institucionales de manejo de desechos peligrosos.</li>
	<li>Almacenamiento y mantenimiento de equipos<ol><li>Si es posible, guarda la máquina de tatuar en una habitación seca. El exceso de humedad dañará los componentes eléctricos y reducirá la longevidad de la máquina.</li>
		<li>Para mantener la máquina de tatuar en buen estado de funcionamiento, revise el cojinete del rotor (Figura 2C) para asegurarse de que no se haya soltado por las vibraciones22. Esto se puede apretar con una llave Allen o un destornillador hexagonal.</li>
		<li>Aproximadamente una vez al mes, lubrique el rodamiento en el brazo del rotor con una grasa lubricante espesa22.</li>
		<li>En algunas máquinas de tatuar, el brazo del rotor puede atascarse y no vibrar. Para corregir esto, gire el brazo del rotor o comprima el resorte para que la aguja quede en la posición bajada (Figura 2C).</li>
	</ol></li>
</ol>

Optimización del marcado de anfibios: una guía para tatuar Xenopus

<ol>
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Los autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Tatuar humanos es una forma de arte que se remonta a miles de años, y durante el tiempo que los humanos se han tatuado a sí mismos, también han tatuado o marcado animales23. El equipo y las técnicas para marcar animales, en particular mamíferos, están bien establecidos, bien documentados y son ampliamente accesibles. Si bien el marcado de animales fue originalmente para distinguir el ganado y disuadir el robo23, su papel en la investigación biomédica se ha vuelto ig...

Los modelos animales son herramientas útiles para investigar cuestiones relacionadas con la salud humana. En la práctica, la investigación biomédica con modelos animales requiere una organización y un mantenimiento cuidadosos de una colonia animal sana. Las mejores prácticas para el manejo y la cría éticos de animales tienen como objetivo reducir el número de animales necesarios para la experimentación y perfeccionar las prácticas para garantizar el bienestar animal1. El género de ranas con garras, incluyendo Xenopus laevis (X. laevis; Rana africana de garras) y Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Rana de uñas occidental), se han utilizado en la investigación biomédica desde la década de 1930, cuando los médicos sudafricanos utilizaron X. laevis para realizar las primeras pruebas de embarazo2. Si bien las pruebas de embarazo modernas ya no requieren ranas, el papel de la investigación sobre Xenopus persiste. Las ventajas de usar Xenopus para la investigación biomédica incluyen sus genomas bien anotados3, la ovulación inducible durante todo el año de grandes nidadas de huevos4 y huevos puestos externamente susceptibles de fertilización in vitro. Estas características los convierten en un activo útil para la embriología y el desarrollo de vertebrados 5,6,7, la biología molecular y celular básica 7,8,9,10 y para modelar enfermedades humanas 7,11,12,13.
Los métodos fiables para el seguimiento de animales individuales de Xenopus son esenciales para registrar las réplicas biológicas y mejorar el rigor y la reproducibilidad en la investigación. Dado que los Xenopus se alojan con frecuencia en grupos, el marcaje de animales permite a los investigadores rastrear fácilmentea los animales individuales. Mantener un registro preciso de los animales puede ahorrar tiempo y recursos y mejorar la capacidad de realizar un seguimiento de la salud de los animales. Por ejemplo, la identificación individual de animales puede mejorar los flujos de trabajo de organización para generar líneas de Xenopus transgénicos, ya que esto requiere múltiples generaciones de ranas con genotipos específicos verificados por secuenciación14, lo que requiere organización e identificación individual de animales. Esto es particularmente cierto cuando estas mutaciones carecen de fenotipos adultos fácilmente discernibles. Del mismo modo, el uso de ovocitos y embriones de Xenopus para estudiar la biología celular básica y del desarrollo se beneficia del seguimiento de animales individuales. Después de inducir la ovulación, los animales necesitan descansar durante un mínimo de 3 meses para prevenir complicaciones de salud como el síndrome de hiperovulación15. Los métodos de identificación individual garantizan que los animales no sean inducidos a ovular con demasiada frecuencia.
El marcado y el seguimiento de los animales también permiten al personal del laboratorio realizar un seguimiento de los problemas de salud de los animales. El hecho de que los animales del mismo genotipo enfermen puede indicar una endogamia excesiva o problemas de salud imprevistos asociados con el transgén. Del mismo modo, los animales que se enferman después de una ovulación reciente pueden indicar problemas con los reactivos, los materiales o las técnicas. El seguimiento de los animales y su salud permite al personal de laboratorio y a los veterinarios hacer un seguimiento cuando vuelven a surgir preocupaciones y tomar medidas preventivas para prevenir futuras enfermedades. En los mamíferos, existen numerosos métodos de identificación. Los métodos permanentes para ratones incluyen perforaciones en las orejas, marcas en las orejas, tatuajes y microchips subcutáneos16. Estos pueden diferenciar de manera clara y confiable a los animales dentro de una colonia o jaula y pueden ser administrados fácilmente por el personal del laboratorio. Métodos como el punzado de orejas son mínimamente invasivos, requieren solo una pieza de equipo especializado y funcionan para animales de la mayoría de las edades. Si bien estos sistemas son sencillos y útiles para los ratones, su uso en las ranas presenta un conjunto único de desafíos. Las ranas y otros anfibios carecen de pabellón auricular (estructura del oído externo). Algunos investigadores han colocado etiquetas en la mandíbula, el dedo del pie o la extremidad trasera del animal 17,18. Este enfoque dio lugar a varios problemas: las marcas en la mandíbula causaban irritación y las ranas agitadas intentaban arrancar las etiquetas con sus extremidades delanteras17. Las marcas de los dedos perforaban la membrana entre los dedos, lo que perjudicaba el movimiento y conllevaba el riesgo de perderse. Como tal, los anfibios requieren sus propios métodos para su identificación. Históricamente, el corte de los dedos de los pies también se ha utilizado para marcar anfibios17,19. El dedo del pie se corta con un par de tijeras afiladas, y el animal se puede identificar por la longitud de los dedos de las patas delanteras y traseras o por el ángulo en el que el dedo ha vuelto a crecer (en las salamandras). Sin embargo, este método plantea la preocupación ética de que el corte de los dedos de los pies pueda afectar el movimiento del animal17. Además, esto puede causar sangrado e introducir un riesgo de infección. Otro sistema de marcado establecido son los autoinjertos de piel, en los que se toma piel de una parte de la rana y se une quirúrgicamente a otra parte. Por ejemplo, se describe un método para marcar la espalda o el hombro de una rana utilizando un injerto de piel de color claro de su pecho20. Los injertos de piel también conllevan limitaciones y riesgos: el procedimiento es invasivo e introduce el riesgo de infección por Aeromonas hydrophila, o pata roja, una afección potencialmente mortal; La cicatrización completa del autoinjerto tarda hasta 6 semanas; Y con los métodos descritos, solo se pueden alojar 6 ranas juntas debido a que los lugares para colocar un autoinjerto son limitados20.
Los enfoques de marcado menos invasivos incluyen perlas de vidrio y chips de transpondedor17,19. En el método de cuentas de vidrio, las cuentas de vidrio se enhebran en una pequeña sutura y se cosen en la piel de la rana. Esto proporciona una mayor variabilidad que los autoinjertos de piel, con al menos 60 combinaciones de colores distintivas. Sin embargo, existe el riesgo de que la sutura se salga y se pierdan las cuentas. Alternativamente, se puede implantar un transpondedor de microchip debajo de la piel en el saco linfático dorsal de la rana. Este se considera el método de marcaje más permanente y permite identificar y catalogar individualmente un número potencialmente infinito de animales. Sin embargo, este es también el método más caro, ya que los microchips individuales son caros y sería costoso marcar una colonia grande. Los microchips también requieren un escáner especial para leer19. Un enfoque común para la identificación de Xenopus es referirse a la coloración y el patrón natural de los animales. Esto funciona especialmente bien para ranas como X. laevis, que tienen patrones distintos que permanecen durante toda la edad adulta. Sin embargo, estos patrones pueden cambiar con el tiempo con el estrés, y la coloración puede parecer diferente cuando las ranas se muevenentre contenedores transparentes y teñidos. Además, este método de identificación es menos útil para X. tropicalis, que tiene patrones de marca menos distintivos en comparación con X. laevis, o para los animales albinos, que no tienen marcas de color21. Incluso para especies con marcas distintas, el personal del laboratorio puede interpretar la ubicación y el tamaño de las marcas de manera diferente, lo que puede causar errores en la identificación. Debido a esto, fotografiar animales es más confiable junto con un método de identificación adicional. Por lo tanto, buscamos marcar e identificar a los animales Xenopus utilizando una técnica que sea fácilmente discernible, permanente y mínimamente invasiva.
Hay recursos publicados limitados que describen los métodos para tatuar anfibios. El tatuaje se ha descrito junto con otras técnicas de marca, incluidas las marcas de calor, las marcas de nitrato de plata y las marcas de congelación17. En el mismo recurso, el tatuaje se realizó dibujando números con una aguja hipodérmica de 27 G, y se observó que el proceso no causaba infección, en contraste con las otras técnicas de marcado, que usaban un alambre en forma de número u otra marca. En otra fuente, se utilizó una máquina de tatuar eléctrica (descrita como una aguja vibratoria) para marcar ranas, pero se proporcionaron pocos detalles sobre la técnica17,19. Los autores advierten que al perturbar la capa protectora de baba de la rana, este procedimiento aumenta el riesgo de patas rojas. Si bien no existe un método de marcado o identificación que sea completamente no invasivo (como las fotografías) y permanente (como los microchips), el tatuaje proporciona un compromiso efectivo. El tatuaje es relativamente sencillo en comparación con otras técnicas, como los autoinjertos de piel. Los beneficios adicionales incluyen una curva de aprendizaje más pequeña y un equipo relativamente económico. Tatuar anfibios acuáticos conlleva ciertos desafíos, que pueden intimidar a los investigadores y perjudicar el marcaje exitoso de los animales. Este artículo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores métodos bien documentados para tatuar Xenopus adulto con una máquina de tatuar rotativa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1203RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 Needle Round Disposable ULTRA</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>HTIPRS5-U</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1205RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 needle round liners</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>1207RLB</td>
			<td>Packaged sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clip Cord</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foot pedal</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inkpots</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, delicate task wipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RCA Connection</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scream Ink Pitch Black, 1oz</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>SI101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel grips</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>STEALTH2-SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam island</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This is the lid of a styrofoam cold shipping container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>CAUTION: IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unbleached paper towels</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Voltage Supply</td>
			<td>Worldwide Tattoo Supply</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (with frog-safe water)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0340923T</td>
			<td>Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X. laevis adult female</td>
			<td>Xenopus1</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zip-top plastic bag</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This bag should be large enough to hold the styrofoam island</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for tattooing xenopus laevis with a rotary tattoo machine

Los modelos animales amplían el alcance de la investigación biomédica, lo que mejora nuestra comprensión de la biología del desarrollo, molecular y celular y permite a los investigadores modelar enfermedades humanas. El registro y el seguimiento de animales individuales permite a los investigadores reducir el número de animales necesarios para el estudio y perfeccionar las prácticas para mejorar el bienestar animal. Existen varios métodos bien documentados para marcar y rastrear mamíferos, incluidos los puñetazos en las orejas y las marcas en las orejas. Sin embargo, los métodos para marcar las especies de anfibios acuáticos son limitados, ya que los recursos existentes son obsoletos, ineficaces o prohibitivamente costosos. En este manuscrito, describimos los métodos y las mejores prácticas para marcar Xenopus laevis con una máquina de tatuar rotativa. Un tatuaje adecuado da como resultado tatuajes de alta calidad, lo que hace que las personas sean fácilmente distinguibles para los investigadores y representan un riesgo mínimo para la salud de los animales. También destacamos las causas de los tatuajes de mala calidad, que pueden dar lugar a tatuajes que se desvanecen rápidamente y causan daños innecesarios a los animales. Este enfoque permite a los investigadores y veterinarios marcar a los anfibios, lo que les permite rastrear réplicas biológicas y líneas transgénicas y mantener registros precisos de la salud animal.

Animal models are useful tools for investigating questions pertaining to human health. In practice, biomedical research using animal models requires careful organization and maintenance of a healthy animal colony. Best practices for ethical animal handling and husbandry aim to reduce the number of animals needed for experimentation and refine practices to ensure animal welfare1. The clawed frog genus, including Xenopus laevis (X. laevis; African clawed frog) and Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Western clawed frog), have been used in biomedical research since the 1930s when X. laevis were used by South African doctors to conduct the first pregnancy tests2. While modern pregnancy tests no longer require frogs, the role of Xenopus research persists. Advantages of using Xenopus for biomedical research include their well-annotated genomes3, year-round inducible ovulation of large clutches of eggs4, and externally laid eggs amenable to in vitro fertilization. These features make them a useful asset for vertebrate embryology and development5,6,7, basic molecular and cellular biology7,8,9,10, and for modeling human disease7,11,12,13.
Reliable methods for tracking individual Xenopus animals are essential for recording biological replicates and improving rigor and reproducibility in research. As Xenopus are frequently housed in groups, animal marking allows researchers to easily track individual animals4. Maintaining an accurate record of animals can save time and resources and improve the ability to track animals&#39; health. For example, individual identification of animals can improve organization workflows for generating transgenic Xenopus lines, as this requires multiple generations of frogs with specific genotypes verified by sequencing14, which requires organization and individual identification of animals. This is particularly true when these mutations lack easily discernible adult phenotypes. Similarly, the use of Xenopus oocytes and embryos to study basic cellular and developmental biology benefits from tracking individual animals. After inducing ovulation, animals need to rest for a minimum of 3 months to prevent health complications such as hyper-ovulation syndrome15. Individual identification methods ensure that animals are not induced to ovulate too frequently.
Marking and tracking animals also enables lab personnel to track animals&#39; health concerns. Animals of the same genotype falling ill can indicate excessive inbreeding or unanticipated health concerns associated with the transgene. Similarly, animals falling ill after recent ovulation can indicate issues with reagents, materials, or techniques. Tracking animals and their health enables lab personnel and veterinarians to follow up when concerns resurface and take preventative measures to prevent future illness. In mammals, there are numerous identification methods. Permanent methods for mice include ear punching, ear tags, tattooing, and subcutaneous microchips16. These can clearly and reliably differentiate animals within a colony or cage and can be easily administered by laboratory personnel. Methods such as ear punching are minimally invasive, require only one piece of specialized equipment, and work for animals of most ages. While these systems are straightforward and useful for mice, their use in frogs presents a unique set of challenges. Frogs and other amphibians lack a pinna (external ear structure). Some researchers have attached tags to the animal&#39;s jaw, toe, or hind limb17,18. This approach resulted in various problems: jaw tags caused irritation, and agitated frogs attempted to pull off tags with their forelimbs17. Toe tags pierced the webbing between toes, impairing movement and carrying the risk of becoming lost. As such, amphibians require their own methods for identification. Historically, toe-clipping has also been used to mark amphibians17,19. The toe is clipped with a sharp pair of scissors, and the animal can be identified by the length of toes on the forefeet and hind feet or by the angle at which the toe has grown back (in salamanders). However, this method poses the ethical concern that toe clipping may impair the animal&#39;s movement17. In addition, this can cause bleeding and introduce a risk of infection. Another established marking system is skin autografts, in which skin is taken from one part of the frog and surgically attached to another part. For example, a method is described for marking a frog&#39;s back or shoulder using a light-colored skin graft from its chest20. Skin grafts also come with limitations and risks: the procedure is invasive and introduces the risk of Aeromonas hydrophila infection, or red leg, a potentially fatal affliction; complete healing of the autograft takes up to 6 weeks; and with the methods described, only 6 frogs can be housed together because of limited places to put an autograft20.
Less invasive marking approaches include glass beads and transponder chips17,19. In the glass bead method, glass beads are threaded onto a small suture and sewn into the frog&#39;s skin. This provides greater variability than skin autografts, with at least 60 distinctive color combinations. There is, however, a risk that the suture can come out and result in the beads being lost. Alternatively, a microchip transponder can be implanted under the skin in the frog&#39;s dorsal lymph sac. This is considered the most permanent marking method and enables a potentially infinite number of animals to be individually identified and cataloged. However, this is also the most expensive method, as individual microchips are expensive, and a large colony would be costly to mark. Microchips also require a special scanner to read19. One common approach for Xenopus identification is referring to animals&#39; natural coloring and patterning. This works especially well for frogs such as X. laevis, which have distinct patterns that remain throughout adulthood. However, these patterns can change over time with stress, and coloring can appear different when frogs are moved between transparent and tinted containers15. Additionally, this identification method is less useful for X. tropicalis, which has less distinct marking patterns compared to X. laevis, or for albino animals, which have no color markings21. Even for species with distinct markings, lab personnel can interpret the placement and size of markings differently, which can cause errors in identification. Because of this, photographing animals is most reliable in conjunction with an additional identification method. Therefore, we seek to mark and identify Xenopus animals using a technique that is easily discernable, permanent, and minimally invasive.
There are limited published resources describing methods for tattooing amphibians. Tattooing has been described alongside other branding techniques, including heat brands, silver nitrate brands, and freeze brands17. In the same resource, tattooing was done by drawing numerals with a 27G hypodermic needle, and the process was noted not to cause infection, in contrast to the other branding techniques, which used a wire shaped into a numeral or other mark. In another source, an electric tattooing machine (described as a vibrating needle) was used to mark frogs, but little detail was provided on the technique17,19. The authors warn that by disturbing the frog&#39;s protective slime layer, this procedure increases the risk of red leg. While there is no marking or identification method that is both completely noninvasive (such as photographs) and permanent (such as microchips), tattooing provides an effective compromise. Tattooing is relatively straightforward compared to other techniques, such as skin autografts. Additional benefits include a smaller learning curve and relatively inexpensive equipment. Tattooing aquatic amphibians comes with certain challenges, which can intimidate researchers and impair successful animal marking. This paper aims to provide researchers with well-documented methods for tattooing adult Xenopus with a rotary tattoo machine.

Autor destacado: Refinamiento de técnicas de marcado de Xenopus laevis para estudios biomédicos

Métodos para tatuar Xenopus laevis con una máquina de tatuar rotativa

Our research is focused on investigating the organization of the cell cortex using Xenopus egg extracts and supported lipid bilayers. We are trying to understand how dynamic cytoskeletal patterns are regulated within the cortex and how these patterns support basic cell functions like cell division. This protocol outlines an effective and safe method for marking Xenopus laevis.This approach enables researchers to track genetic lines and experimental replicates and to monitor animal health. Tattooing is a cost-effective permanent marking technique for amphibians. It's much less invasive than other permanent methods, such as skin graft or tags, it's also more reliable than qualitative methods, like photos or pattern recognition.

Los tatuajes de alta calidad tendrán trazos oscuros y legibles en el pecho de la rana y se pueden diferenciar claramente a varios pies de distancia (Figura 5A). En general, los números y marcas más grandes son mejores para la legibilidad, pero los nombres y números más largos se pueden hacer más pequeños para que quepan cómodamente en el pecho de la rana. La longevidad de los tatuajes es más difícil de juzgar, pero los tatuajes de ranas de alta calidad deben permanecer oscuros y le...

Aquí, describimos métodos para tatuar Xenopus laevis adulto (rana africana con garras) con una máquina de tatuar rotativa. Un tatuaje adecuado da como resultado números oscuros y fácilmente legibles que duran varios meses y hacen que los animales se distingan fácilmente para fines de investigación y mantenimiento de registros.

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Tattooing Xenopus laevis with a Rotary Tattoo Machine

377 vistas.  Dartmouth College. Nuestra investigación se centra en investigar la organización de la corteza celular utilizando extractos de huevo de Xenopus y bicapas lipídicas soportadas. Estamos tratando de entender cómo se regulan los patrones dinámicos del citoesqueleto dentro de la corteza y cómo estos patrones apoyan las funciones celulares básicas como la división celular. Este protocolo describe un método eficaz y seguro para marcar Xenopus laevis.Este enfoque permit...

Video: Autor destacado: Refinamiento de técnicas de marcado de Xenopus laevis para estudios biomédicos

Animal models expand the scope of biomedical research, furthering our understanding of developmental, molecular, and cellular biology and enabling researchers to model human disease. Recording and tracking individual animals allows researchers to reduce the number of animals required for study and refine practices to improve animal wellbeing. Several well-documented methods exist for marking and tracking mammals, including ear punching and ear tags. However, methods for marking aquatic amphibian species are limited, with the existing resources being outdated, ineffective, or prohibitively costly. In this manuscript, we outline methods and best practices for marking Xenopus laevis with a rotary tattoo machine. Proper tattooing results in high-quality tattoos, making individuals easily distinguishable for researchers and posing minimal risk to animals' health. We also highlight the causes of poor-quality tattoos, which can result in tattoos that fade quickly and cause unnecessary harm to animals. This approach allows researchers and veterinarians to mark amphibians, enabling them to track biological replicates and transgenic lines and to keep accurate records of animal health.

Here, we describe methods for tattooing adult Xenopus laevis (African clawed frog) with a rotary tattoo machine. Proper tattooing results in dark, easily legible numerals that last for several months and make animals easily distinguishable for research and recordkeeping purposes.

Investigación

Biología

Preparation of the Tattoo Gun to Mark Frogs for Research Purposes

To begin, connect the tattoo gun and foot pedal to the power supply. Position the foot pedal underneath the working surface. For assembling the tattoo gun, loosen the screws in the grip with an Allen wrench.Insert the plastic tip all the way into the grip and tighten the screw to hold it in place. Then insert the metal tube in the back of the grip to half of its length and tighten the screw while adjusting the length. Insert a tattoo needle through the back of the grip to secure it in the plastic tip at the front of the grip.Slide the back of the needle and metal tube through the tube clamp. After adjusting the metal tube, hand tighten the tube clamp until it cannot move. Remove the black O-ring, hook the needle onto the rotor arm, and replace the O-ring.Next, set the required voltage on the power supply. Once the power supply is plugged in, press the foot pedal to check if the machine works. Fill the plastic ink pot with black tattoo ink to about three quarters full before tattooing.

Preparación de la pistola de tatuajes para marcar ranas con fines de investigación

Rotary Tattoo Method for Long-Term Marking of Xenopus in Research Environments

To begin, set up the equipment for tattooing. Place the anesthetized frog on its back on a dry, unbleached paper towel. Using a dry, lint-free wipe, clear the water and mucus from the frog's chest.Then find the sternum in the center of the frog's chest with fingers, and using the non-dominant hand, hold the skin taught. Position the assembled tattoo gun vertically relative to the working surface and dip the needle into the ink. Keeping the gun vertical, press the needle tip onto the frog's skin, followed by the foot pedal.Draw lines onto the frog's skin while applying even pressure. If the needle gets stuck, clear excess ink or skin from the needle with a wipe. If necessary, clear excess ink on the frog's chest with frog-safe water and a wipe, and then wick away moisture with a dry wipe.Continue to ink the same area until dark, legible numbers persist after wiping away excess ink. Fill a tank with 10 to 15 liters of fresh frog-safe water and add a styrofoam island to provide a surface for the frog to wake up without drowning. Wet a paper towel with frog-safe water and place it flat on the styrofoam island.Next, lay the frog belly down on the towel facing the water. Fold half of the paper towel over the back half of the frog, and using cupped hands, wet its top portion. After 24 hours, when the tattoo is healed, return the frog to its long-term housing unit.Of the frogs tattooed, 100%had visible tattoos immediately after tattooing, 100%had them 24 hours after tattooing, and 91%had them four months after tattooing.