Nuestra investigación se centró en el uso de modelos polimicrobianos complejos para comprender las complejas interacciones entre los microbios en el entorno de la fibrosis quística y cómo esto da lugar a una mayor tolerancia a los antimicrobianos. Esperamos utilizar este conocimiento para desarrollar nuevas intervenciones terapéuticas. Los avances dentro del campo de las biopelículas están siendo impulsados por la visualización, junto con las metodologías de cuantificación junto con los enfoques biofísicos.
Esto incluye técnicas como OrbiSIMS 3D que dan una resolución espacial a micro y nanoescala. Esta investigación tiene como objetivo crear un modelo polimicrobiano que mantenga un nivel de complejidad, representativo de lo que se observa en los tratamientos con antibióticos en pacientes con FQ. También permitirá un mayor rendimiento, resultados más relevantes y adaptabilidad a otras cepas y condiciones.
Este protocolo ofrece un entorno de prueba relevante para los patógenos de la FQ. Es robusto y tiene un rendimiento relativamente alto. También es susceptible a múltiples criterios de valoración, lo que permite realizar estudios más complejos.
Esta investigación ha demostrado que un entorno relevante para la FQ altera la susceptibilidad microbiana. Además, el tipo de hongos presentes también puede alterar la susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa, y esto puede tener importantes implicaciones clínicas. Para comenzar, tomemos cultivos de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans que crecieron hasta la fase exponencial.
Con una micropipeta, transfiera un mililitro de cada cultivo líquido a un tubo estéril separado de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos durante dos minutos a 8.000 x g para pellet las bacterias u hongos. A continuación, con una pipeta, aspire el sobrenadante de cada tubo y vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de PBS.
Diluir las células resuspendidas de Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus del uno al 10 en PBS. Luego, usando un espectrofotómetro, mida la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nanómetros. Después de diluir las muestras lavadas de Candida albicans de uno a 100 en PBS, pipetee 10 microlitros de cada muestra en dos cámaras individuales de un hemocitómetro.
A continuación, ajuste la muestra de Candida albicans a 1 x 10 a la potencia de ocho UFC por mililitro en PBS. Para preparar el inóculo para su adición a la biopelícula, ajuste el inóculo de Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans y Staphylococcus aureus usando PBS. En el caso de las biopelículas de una sola especie, pipetee 10 microlitros del microbio diluido en el centro de un disco de policarbonato colocado en el agar técnico SCFM2 al 1,5% en placas de 6 pocillos.
Incubar la placa estáticamente a 37 grados centígrados durante 24 horas antes del tratamiento o la interrupción. Para biopelículas polimicrobianas, agregue 10 microlitros de cada Staphylococcus aureus y Candida albicans uno encima del otro en el mismo disco de policarbonato. Incubar el disco inoculado de forma estática durante 24 horas a 37 grados centígrados.
Después de la incubación con pinzas estériles, transfiera los discos de policarbonato a placas de agar técnico SCFM2 al 1,5 % frescas. Añadir 10 microlitros del 1 x 10 a la potencia de cuatro UFC por mililitro de dilución de Pseudomonas aeruginosa sobre el biofilm preestablecido de Staphylococcus aureus, Candida albicans. Incubar durante otras 24 horas a 37 grados centígrados.
Para comenzar, tome la biopelícula de la colonia de interfaz de aire sólido de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans. Agregue cuentas de cerámica con un diámetro de 2,8 milímetros a la placa y reticule la placa con rayos UV. Usando pinzas esterilizadas con llama, transfiera cinco cuentas de cerámica a un tubo homogeneizador estéril de dos mililitros.
Pipetear un mililitro de PBS en el tubo de homogeneización de dos mililitros. Agite los tubos durante al menos 10 segundos o hasta que se haya eliminado la biopelícula del disco de policarbonato según lo determine la inspección visual. Una vez retirado, saque el disco de policarbonato, luego coloque los tubos con las cuentas en el homogeneizador y golpéelos dos veces durante 10 segundos a seis metros por segundo con un intervalo de diez segundos entre latidos.
Ahora vierta la biopelícula interrumpida del tubo homogeneizador en una joya de siete mililitros que contiene cuatro mililitros de PBS, lo que da como resultado un volumen final de cinco mililitros. Centrifugar los tubos homogeneizadores a 8.000 x g durante dos minutos. Luego, transfiera el líquido restante a la joya de siete mililitros para asegurarse de que se transfiera todo el líquido.
Agregue 200 microlitros de la biopelícula interrumpida en una placa negra de 96 pocillos con fondo transparente, luego pipetee 10 microlitros de solución de resazurina al 0,02% en cada pocillo. Incubar la biopelícula tratada con resazurina en un lector de placas a 37 grados centígrados. Aplique agitación orbital cada 30 minutos durante 10 segundos a 200 RPM antes de tomar cualquier lectura fluorescente.
Mida la fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 540 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 590 nanómetros. Las biopelículas de una sola especie requirieron concentraciones significativamente más bajas de meropenem y tobramicina para lograr el 50% de eliminación en comparación con las biopelículas polimicrobianas, con un aumento de dos logaritmos en la concentración de antibióticos necesario para este último. La supervivencia de Pseudomonas aeruginosa aumentó en biopelículas polimicrobianas con 64 microgramos por mililitro de tobramicina, mientras que el meropenem mostró una disminución en la supervivencia en condiciones similares.
En biopelículas monoespecies, se observó una fuerte correlación entre la supervivencia de Pseudomonas aeruginosa y su actividad metabólica cuando se trató con meropenam y tobramicina.
