Nossa pesquisa se concentrou no uso de modelos polimicrobianos complexos para entender as interações complexas entre micróbios no ambiente de fibrose cística e como isso resulta em maior tolerância antimicrobiana. Esperamos usar esse conhecimento para desenvolver novas intervenções terapêuticas. Os avanços no campo do biofilme estão sendo impulsionados pela visualização, juntamente com metodologias de quantificação juntamente com abordagens biofísicas.
Isso inclui técnicas como o 3D OrbiSIMS que fornecem resolução espacial até a micro e nanoescala. Esta pesquisa tem como objetivo criar um modelo polimicrobiano que mantenha um nível de complexidade, representativo do que é visto nos tratamentos com antibióticos em pacientes com FC. Também permitirá maior rendimento, resultados mais relevantes e adaptabilidade a outras cepas e condições.
Este protocolo oferece um ambiente de teste relevante para patógenos da FC. É robusto e tem um rendimento relativamente alto. Também é passível de vários endpoints, permitindo a realização de estudos mais complexos.
Esta pesquisa mostrou que um ambiente relevante para a FC altera a suscetibilidade microbiana. Além disso, o tipo de fungo presente também pode alterar a suscetibilidade de Pseudomonas aeruginosa, e isso pode ter relevância clínica significativa. Para começar, pegue culturas de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans cultivadas até a fase exponencial.
Usando uma micropipeta, transfira um mililitro de cada cultura líquida para um tubo estéril separado de 1,5 mililitro. Centrifugue os tubos por dois minutos a 8.000 x g para pellet as bactérias ou fungos. Em seguida, aspirar o sobrenadante de cada tubo com uma pipeta e ressuspender os pellets em um mililitro de PBS.
Dilua as células ressuspensas de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus de um a 10 em PBS. Em seguida, usando um espectrofotômetro, meça a densidade óptica em um comprimento de onda de 600 nanômetros. Depois de diluir as amostras lavadas de Candida albicans de um a 100 em PBS, pipetar 10 microlitros de cada amostra em duas câmaras individuais de um hemocitômetro.
Em seguida, ajuste a amostra de Candida albicans para 1 x 10 elevado a oito UFC por mililitro em PBS. Para preparar o inóculo para adição ao biofilme, ajuste o inóculo de Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans e Staphylococcus aureus usando PBS. Para biofilmes monoespécies, pipetar 10 microlitros do micróbio diluído no centro de um disco de policarbonato colocado no ágar SCFM2 1,5% técnico em placas de 6 poços.
Incubar a placa estaticamente a 37 graus Celsius por 24 horas antes do tratamento ou interrupção. Para biofilmes polimicrobianos, adicione 10 microlitros de cada Staphylococcus aureus e Candida albicans um sobre o outro no mesmo disco de policarbonato. Incubar o disco inoculado estaticamente durante 24 horas a 37 graus Celsius.
Após a incubação com pinça estéril, transfira os discos de policarbonato para placas de ágar SCFM2 1,5% técnicas frescas. Adicione 10 microlitros do 1 x 10 à potência de quatro UFC por mililitro de diluição de Pseudomonas aeruginosa em cima do biofilme pré-estabelecido de Staphylococcus aureus, Candida albicans. Incube por mais 24 horas a 37 graus Celsius.
Para começar, pegue o biofilme de colônia de interface de ar sólido de Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida albicans. Adicione esferas de cerâmica com um diâmetro de 2,8 milímetros à placa e reticule a placa com UV. Usando uma pinça esterilizada por chama, transfira cinco esferas de cerâmica para um tubo homogeneizador estéril de dois mililitros.
Pipetar um mililitro de PBS para o tubo de homogeneização de dois mililitros. Vortex os tubos por pelo menos 10 segundos ou até que o biofilme tenha sido removido do disco de policarbonato, conforme determinado por inspeção visual. Uma vez removido, retire o disco de policarbonato, coloque os tubos com as esferas no homogeneizador e bata-os duas vezes por 10 segundos a seis metros por segundo com um intervalo de dez segundos entre os batimentos.
Agora despeje o biofilme interrompido do tubo homogeneizador em uma bijuteria de sete mililitros contendo quatro mililitros de PBS, resultando em um volume final de cinco mililitros. Centrifugar os tubos homogeneizadores a 8 000 x g durante dois minutos. Em seguida, transfira o líquido restante para a bijuteria de sete mililitros para garantir que todo o líquido seja transferido.
Adicione 200 microlitros do biofilme interrompido em uma placa preta de 96 poços de fundo transparente e, em seguida, pipete 10 microlitros de solução de resazurina a 0,02% em cada poço. Incube o biofilme tratado com resazurina em um leitor de placas a 37 graus Celsius. Aplique agitação orbital a cada 30 minutos por 10 segundos a 200 RPM antes de fazer qualquer leitura fluorescente.
Meça a fluorescência usando um comprimento de onda de excitação de 540 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 590 nanômetros. Os biofilmes monoespécies exigiram concentrações significativamente mais baixas de meropeném e tobramicina para atingir 50% de morte em comparação com os biofilmes polimicrobianos, com um aumento de dois log na concentração de antibióticos necessária para o último. A sobrevida de Pseudomonas aeruginosa aumentou em biofilmes polimicrobianos com 64 microgramas por mililitro de tobramicina, enquanto o meropenem apresentou diminuição na sobrevida em condições semelhantes.
Em biofilmes monoespécies, foi observada uma forte correlação entre a sobrevivência de Pseudomonas aeruginosa e sua atividade metabólica quando tratados com meropenam e tobramicina.
