开发多微生物菌落生物膜模型以测试囊性纤维化中的抗菌剂

我们的研究重点是使用复杂的多微生物模型来了解囊性纤维化环境中微生物之间的复杂相互作用，以及这如何导致抗菌素耐受性增加。我们希望利用这些知识来开发新的治疗干预措施。生物膜领域的进步是由可视化、量化方法和生物物理方法推动的。

这包括 3D OrbiSIMS 等技术，这些技术可提供低至微米和纳米尺度的空间分辨率。本研究旨在创建一个多微生物模型，该模型保持一定程度的复杂性，代表 CF 患者抗生素治疗中所见的情况。它还将提高通量、更相关的输出以及对其他菌株和条件的适应性。

该协议为 CF 病原体提供了相关的测试环境。它很健壮，并且具有相对较高的吞吐量。它也适用于多个终点，允许进行更复杂的研究。

这项研究表明，与 CF 相关的环境会改变和微生物易感性。此外，存在的真菌类型也可以改变铜绿假单胞菌的易感性，这可能具有重要的临床意义。首先，以生长到指数期的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的培养物为例。

使用微量移液器，将每种液体培养物的 1 毫升转移到单独的无菌 1.5 毫升试管中。将试管以 8， 000 x g 离心 2 分钟，以沉淀细菌或真菌。之后，使用移液器从每个试管中吸出上清液，并将沉淀重悬于一毫升 PBS 中。

在 PBS 中稀释重悬的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌细胞 1 至 10。然后使用分光光度计测量 600 纳米波长的光密度。在 PBS 中稀释洗涤过的白色念珠菌样品 1 至 100 后，将每个样品的 10 微升移液到血细胞计数器的两个单独腔室中。

然后将白色念珠菌样品调整为 1 x 10 至 PBS 中每毫升 8 CFU 的幂。为了准备添加到生物膜中的接种物，使用 PBS 调整铜绿假单胞菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌接种物。对于单一物种生物膜，将 10 微升稀释的微生物移液到放置在 6 孔板中 SCFM2 1.5% 工业琼脂上的聚碳酸酯圆盘的中心。

在处理或破碎之前，将板在 37 摄氏度下静态孵育 24 小时。对于多微生物生物膜，在同一聚碳酸酯圆盘上将金黄色葡萄球菌和白色念珠菌各 10 微升相互叠加。将接种的圆盘在 37 摄氏度下静态孵育 24 小时。

使用无菌镊子孵育后，将聚碳酸酯圆盘转移到新鲜的 SCFM2 1.5% 技术琼脂平板上。在预先建立的金黄色葡萄球菌、白色念珠菌生物膜上，以每毫升 4 CFU 的幂比例稀释铜绿假单胞菌加入 10 μL 的 1 x 10 的剂量。在 24 摄氏度下再孵育 37 小时。

首先，取铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的固体空气界面菌落生物膜。将直径为 2.8 毫米的陶瓷珠添加到板上，并在板上进行紫外线交联。使用火焰灭菌镊子，将五个陶瓷珠转移到无菌的 2 毫升均质管中。

将 1 毫升 PBS 移液到 2 毫升匀浆管中。涡旋试管至少 10 秒，或直到目视检查确定生物膜从聚碳酸酯盘上去除。取出后，取出聚碳酸酯圆盘，然后将带有珠子的试管放入均质器中，以每秒 6 米的速度敲打两次，持续 10 秒，每次拍打间隔 10 秒。

现在将均质管中被破坏的生物膜倒入含有 4 毫升 PBS 的 7 毫升 bijou 中，最终体积为 5 毫升。将均质管以 8， 000 x g 离心 2 分钟。然后将剩余的液体转移到 7 毫升的珠宝中，以确保所有液体都被转移。

将 200 微升被破坏的生物膜加入透明底部黑色 96 孔板中，然后将 10 微升 0.02% 刃天青溶液移液到每个孔中。在 37 摄氏度的读板器中孵育刃天青处理的生物膜。在读取任何荧光读数之前，每 30 分钟以 200 RPM 的速度进行一次轨道振荡，持续 10 秒。

使用 540 纳米的激发波长和 590 纳米的发射波长测量荧光。与多微生物生物膜相比，单一物种生物膜需要显着降低浓度的美罗培南和妥布霉素才能达到 50% 的杀伤效果，后者所需的抗生素浓度增加了两个对数。铜绿假单胞菌在每毫升妥布霉素 64 μg 的多微生物生物膜中的存活率增加，而美罗培南在类似条件下的存活率降低。

在单物种生物膜中，当用美罗培南和妥布霉素处理时，观察到铜绿假单胞菌的存活与其代谢活性之间存在很强的相关性。