Наше исследование было сосредоточено на использовании сложных полимикробных моделей для понимания сложных взаимодействий между микробами в среде муковисцидоза и того, как это приводит к повышению толерантности к противомикробным препаратам. Мы надеемся использовать эти знания для разработки новых терапевтических вмешательств. Прогресс в области биопленки обусловлен визуализацией в сочетании с методологиями количественной оценки наряду с биофизическими подходами.
Это включает в себя такие методы, как 3D OrbiSIMS, которые обеспечивают пространственное разрешение вплоть до микро- и наномасштаба. Это исследование направлено на создание полимикробной модели, которая поддерживает уровень сложности, репрезентативный для того, что наблюдается при лечении антибиотиками у пациентов с муковисцидозом. Это также позволит увеличить производительность, повысить производительность и адаптироваться к другим штаммам и условиям.
Этот протокол предлагает соответствующую среду для тестирования на патогены муковисцидоза. Он надежен и имеет относительно высокую пропускную способность. Он также поддается воздействию нескольких конечных точек, что позволяет проводить более сложные исследования.
Это исследование показало, что среда, связанная с муковисцидозом, изменяет и восприимчивость микроорганизмов. Кроме того, тип присутствующих грибов также может изменять восприимчивость к Pseudomonas aeruginosa, и это может иметь значительное клиническое значение. Для начала возьмем культуры Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Candida albicans, выращенные до экспоненциальной фазы.
С помощью микропипетки переложите по одному миллилитру каждой жидкой культуры в отдельную стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитра. Центрифугируйте пробирки в течение двух минут при давлении 8 000 x g, чтобы удалить бактерии или грибки. После этого с помощью пипетки аспирируйте надосадочную жидкость из каждой пробирки и повторно суспендируйте гранулы в одном миллилитре PBS.
Разбавьте ресуспендированные клетки Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus от одного до 10 в PBS. Затем с помощью спектрофотометра измерить оптическую плотность на длине волны 600 нанометров. После разведения промытых образцов Candida albicans один к 100 в PBS пипеткой по 10 микролитров каждого образца в две отдельные камеры гемоцитометра.
Затем отрегулируйте образец Candida albicans до 1 x 10 в степени восьми КОЕ на миллилитр в PBS. Чтобы подготовить инокулюм для добавления в биопленку, отрегулируйте инокулум Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans и Staphylococcus aureus inoculum с помощью PBS. Для моновидовых биопленок пипеткой 10 мкл разведенного микроба наносят на центр поликарбонатного диска, размещенного на 1,5%-ном техническом агаре SCFM2 в 6-луночных планшетах.
Статически инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов перед лечением или прерыванием работы. Для полимикробных биопленок добавьте по 10 микролитров Staphylococcus aureus и Candida albicans друг на друга на один и тот же поликарбонатный диск. Инкубируйте инокулированный диск статически в течение 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия.
После инкубации с помощью стерильных щипцов переложите поликарбонатные диски на свежие пластины из технического агара SCFM2 1,5%. Добавьте 10 микролитров из 1 x 10 в степени четырех КОЕ на миллилитр разведения Pseudomonas aeruginosa поверх предварительно созданной биопленки Staphylococcus aureus, Candida albicans. Инкубировать еще 24 часа при температуре 37 градусов Цельсия.
Для начала возьмите биопленку колонии твердого воздушного интерфейса Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Candida albicans. Добавьте к пластине керамические шарики диаметром 2,8 миллиметра и сшивите пластину ультрафиолетом. С помощью стерилизованных пламенем щипцов перенесите пять керамических бусин в стерильную двухмиллилитровую трубку-гомогенизатор.
Внесите пипеткой один миллилитр PBS в двухмиллилитровую гомогенизационную трубку. Делайте трубки вихревыми в течение не менее 10 секунд или до тех пор, пока биопленка не будет удалена с поликарбонатного диска в соответствии с визуальным осмотром. После снятия извлеките поликарбонатный диск, затем поместите трубки с шариками в гомогенизатор и взбейте их два раза в течение 10 секунд со скоростью шесть метров в секунду с десятисекундным интервалом между ударами.
Теперь вылейте разрушенную биопленку из трубки гомогенизатора в семимиллилитровую бижутерию, содержащую четыре миллилитра PBS, в результате чего итоговый объем составит пять миллилитров. Центрифугируйте пробирки гомогенизатора при давлении 8 000 x g в течение двух минут. Затем перелейте оставшуюся жидкость в семимиллилитровую бижутерию, чтобы убедиться, что вся жидкость перенесена.
Добавьте 200 микролитров разрушенной биопленки в черную 96-луночную пластину с прозрачным дном, затем внесите пипеткой 10 микролитров 0,02% раствора резазурина в каждую лунку. Инкубируйте обработанную резазурином биопленку в планшетном считывателе при температуре 37 градусов Цельсия. Применяйте орбитальное встряхивание каждые 30 минут в течение 10 секунд при 200 об/мин, прежде чем снимать какие-либо флуоресцентные показания.
Измерьте флуоресценцию с помощью длины волны возбуждения 540 нанометров и длины волны излучения 590 нанометров. Моновидовые биопленки требовали значительно более низких концентраций меропенема и тобрамицина для достижения 50%-ного уничтожения по сравнению с полимикробными биопленками с необходимым для последней двухлогарифмачным увеличением концентрации антибиотика. Выживаемость синегнойных грибов увеличилась в полимикробных биопленках с концентрацией 64 мкг на миллилитр тобрамицина, тогда как меропенем показал снижение выживаемости при аналогичных условиях.
В моновидовых биопленках наблюдалась сильная корреляция между выживаемостью Pseudomonas aeruginosa и ее метаболической активностью при обработке меропенамом и тобрамицином.
