私たちの研究は、複雑な多微生物モデルを使用して、嚢胞性線維症環境における微生物間の複雑な相互作用と、これが抗菌耐性の増加にどのようにつながるかを理解することに焦点を当てました。私たちは、この知識を使用して、新しい治療介入を開発したいと考えています。バイオフィルム分野の進歩は、生物物理学的アプローチと並ぶ定量化方法論と組み合わせた視覚化によって推進されています。
これには、マイクロスケールやナノスケールまでの空間分解能を提供する3D OrbiSIMSのような手法が含まれます。この研究は、CF患者の抗生物質治療に見られるものを代表する、複雑さのレベルを維持する多微生物モデルを作成することを目的としています。また、スループットの向上、より関連性の高い出力、他の菌株や条件への適応性も可能になります。
このプロトコルは、CF病原体に関連する試験環境を提供します。堅牢で、比較的高いスループットを備えています。また、複数のエンドポイントに対応しているため、より複雑な研究を行うことができます。
この研究は、CFに関連する環境が変化し、微生物の感受性が変化することを示しています。さらに、存在する真菌の種類も緑膿菌の感受性を変える可能性があり、これは臨床的に重要な関連性を持っている可能性があります。まず、指数関数的に成長したPseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、およびCandida albicansの培養物を取ります。
マイクロピペットを使用して、各液体培養物の1ミリリットルを別々の滅菌1.5ミリリットルチューブに移します。チューブを 8, 000 x g で 2 分間遠心分離し、細菌または真菌をペレット化します。その後、ピペットを使用して、各チューブから上清を吸引し、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。
再懸濁した緑膿菌と黄色ブドウ球菌の細胞をPBSで1〜10個希釈します。次に、分光光度計を使用して、600ナノメートルの波長で光学密度を測定します。カンジダ・アルビカンスの洗浄済みサンプルをPBSで1〜100に希釈した後、各サンプルの10マイクロリットルを血球計算盤の2つの個別のチャンバーにピペットで移します。
次に、カンジダ・アルビカンスのサンプルを1 x 10に調整し、PBSで1ミリリットルあたり8CFUの累乗にします。バイオフィルムに添加する接種物を調製するには、PBSを使用して緑膿菌、カンジダ・アルビカンス、および黄色ブドウ球菌接種物を調整します。単一種のバイオフィルムの場合、希釈した微生物の10マイクロリットルを、6ウェルプレートのSCFM2 1.5%テクニカル寒天上に置いたポリカーボネートディスクの中心にピペットで移します。
プレートを37°Cで静的にインキュベートしてから、処理または破壊前に24時間インキュベートします。ポリマイクロバイオフィルムの場合は、黄色ブドウ球菌とカンジダ・アルビカンスをそれぞれ10マイクロリットルずつ、同じポリカーボネートディスク上に重ねて追加します。接種した椎間板を37°Cで24時間静的にインキュベートします。
滅菌鉗子を使用してインキュベートした後、ポリカーボネートディスクを新鮮なSCFM2 1.5%テクニカル寒天プレートに移します。既定の黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンスのバイオフィルムの上に、緑膿菌の希釈液1ミリリットルあたり4CFUの累乗に1×10の10マイクロリットルを加えます。摂氏37度でさらに24時間インキュベートします。
まず、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、およびCandida albicansの固体空気界面コロニーバイオフィルムを取ります。プレートに直径2.8mmのセラミックビーズを加え、プレートをUV架橋します。火炎滅菌鉗子を使用して、5つのセラミックビーズを滅菌した2ミリリットルのホモジナイザーチューブに移します。
1ミリリットルのPBSを2ミリリットルの均質化チューブにピペットで移します。少なくとも10秒間、または目視検査で判断されたようにバイオフィルムがポリカーボネートディスクから除去されるまで、チューブをボルテックスします。取り外したら、ポリカーボネートディスクを取り出し、ビーズの入ったチューブをホモジナイザーに入れ、10秒間隔で秒速6メートルで10秒間2回叩きます。
次に、ホモジナイザーチューブからの破壊されたバイオフィルムを、4ミリリットルのPBSを含む7ミリリットルのビジューに注ぎ、最終容量を5ミリリットルにします。ホモジナイザーチューブを8, 000 x gで2分間遠心分離します。次に、残りの液体を7ミリリットルのビジューに移して、すべての液体が移動していることを確認します。
200マイクロリットルの破壊されたバイオフィルムを透明な底の黒い96ウェルプレートに加え、次に10マイクロリットルの0.02%レサズリン溶液を各ウェルにピペットで移します。レサズリン処理したバイオフィルムをプレートリーダーで摂氏37度でインキュベートします。蛍光測定値を取得する前に、30分ごとに200RPMで10秒間オービタル振とうを適用します。
励起波長540ナノメートル、発光波長590ナノメートルを用いて蛍光を測定します。単一種のバイオフィルムは、ポリマイクロバイオフィルムと比較して50%の殺傷を達成するために有意に低い濃度のメロペネムとトブラマイシンを必要とし、後者に必要な抗生物質濃度が2対数増加しました。緑膿菌の生存率は、トブラマイシンの1ミリリットルあたり64マイクログラムの多微生物バイオフィルムで増加しましたが、メロペネムは同様の条件下で生存率の低下を示しました。
単一種のバイオフィルムでは、緑膿菌の生存と、メロペナムとトブラマイシンの両方で処理した場合のその代謝活性との間に強い相関関係が観察されました。
