Araştırmamız, kistik fibroz ortamındaki mikroplar arasındaki karmaşık etkileşimleri ve bunun antimikrobiyal toleransın artmasına nasıl yol açtığını anlamak için karmaşık polimikrobiyal modeller kullanmaya odaklandı. Bu bilgiyi yeni terapötik müdahaleler geliştirmek için kullanmayı umuyoruz. Biyofilm alanındaki ilerlemeler, biyofiziksel yaklaşımların yanı sıra niceleme metodolojileri ile birlikte görselleştirme tarafından yönlendirilmektedir.
Bu, mikro ve nano ölçeğe kadar uzamsal çözünürlük sağlayan 3D OrbiSIMS gibi teknikleri içerir. Bu araştırma, KF hastalarında antibiyotik tedavilerinde görülenleri temsil eden bir karmaşıklık seviyesini koruyan polimikrobiyal bir model oluşturmayı amaçlamaktadır. Aynı zamanda daha yüksek verim, daha ilgili çıktılar ve diğer suşlara ve koşullara uyarlanabilirlik sağlayacaktır.
Bu protokol, CF patojenleri için ilgili bir test ortamı sunar. Sağlamdır ve nispeten yüksek bir verime sahiptir. Ayrıca, daha karmaşık çalışmaların yapılmasına izin veren birden fazla uç noktaya da uygundur.
Bu araştırma, KF ile ilgili bir ortamın mikrobiyal duyarlılığı değiştirdiğini göstermiştir. Ek olarak, mevcut mantar türü de Pseudomonas aeruginosa'nın duyarlılığını değiştirebilir ve bunun önemli klinik önemi olabilir. Başlamak için, üstel faza kadar büyüyen Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ve Candida albicans kültürlerini alın.
Bir mikropipet kullanarak, her sıvı kültürün bir mililitresini ayrı bir steril 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Bakteri veya mantarları peletlemek için tüpleri 8.000 x g'da iki dakika santrifüjleyin. Bundan sonra, bir pipet kullanarak, süpernatanı her tüpten aspire edin ve peletleri bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.
Yeniden süspanse edilmiş Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus hücrelerini PBS'de bir ila 10 oranında seyreltin. Daha sonra bir spektrofotometre kullanarak, optik yoğunluğu 600 nanometre dalga boyunda ölçün. Yıkanmış Candida albicans örneklerini PBS'de bir ila 100 oranında seyrelttikten sonra, her bir numunenin 10 mikrolitresini bir hemositometrenin iki ayrı odasına pipetleyin.
Ardından Candida albicans örneğini PBS'de mililitre başına sekiz CFU kuvvetine 1 x 10'a ayarlayın. İnokulumu biyofilme eklenmek üzere hazırlamak için, PBS kullanarak Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans ve Staphylococcus aureus inoculum'u ayarlayın. Tek tür biyofilmler için, 10 delikli plakalarda SCFM2 %1.5 teknik agar üzerine yerleştirilen bir polikarbonat diskin merkezine 10 mikrolitre seyreltilmiş mikrop pipetleyin.
Tedavi veya bozulmadan önce plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede statik olarak inkübe edin. Polimikrobiyal biyofilmler için, aynı polikarbonat disk üzerinde üst üste her bir Staphylococcus aureus ve Candida albicans'tan 10 mikrolitre ekleyin. Aşılanmış diski 37 santigrat derecede 24 saat statik olarak inkübe edin.
Steril forseps kullanılarak inkübasyonun ardından, polikarbonat diskleri taze SCFM2 %1,5 teknik agar plakalarına aktarın. Önceden kurulmuş Staphylococcus aureus, Candida albicans biyofilminin üzerine Pseudomonas aeruginosa'nın mililitre seyreltilmesi başına dört CFU'nun gücüne 1 x 10'dan 10 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat derecede 24 saat daha inkübe edin.
Başlamak için, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus ve Candida albicans'ın katı hava arayüzü koloni biyofilmini alın. Plakaya 2,8 milimetre çapında seramik boncuklar ekleyin ve plakayı UV çapraz bağlayın. Alevle sterilize edilmiş forseps kullanarak, beş seramik boncuğu steril iki mililitrelik homojenizatör tüpüne aktarın.
İki mililitrelik homojenizasyon tüpüne bir mililitre PBS pipetleyin. Tüpleri en az 10 saniye boyunca veya görsel inceleme ile belirlendiği gibi biyofilm polikarbonat diskten çıkarılana kadar vorteksleyin. Çıkarıldıktan sonra, polikarbonat diski çıkarın, ardından boncuklu tüpleri homojenizatöre yerleştirin ve vuruşlar arasında on saniyelik bir aralıkla saniyede altı metre hızla 10 saniye boyunca iki kez çırpın.
Şimdi, bozulmuş biyofilmi homojenizatör tüpünden dört mililitre PBS içeren yedi mililitrelik bir bijou'ya dökün ve beş mililitrelik bir nihai hacim elde edin. Homojenizatör tüplerini 8.000 x g'da iki dakika santrifüjleyin. Ardından, tüm sıvının aktarıldığından emin olmak için kalan sıvıyı yedi mililitrelik bijou'ya aktarın.
Bozulmuş biyofilmden 200 mikrolitreyi şeffaf tabanlı siyah 96 oyuklu bir plakaya ekleyin, ardından her bir oyuğa 10 mikrolitre% 0.02 resazurin çözeltisi pipetleyin. Resazurinle muamele edilmiş biyofilmi 37 santigrat derecede bir plaka okuyucuda inkübe edin. Herhangi bir floresan okuması yapmadan önce 200 RPM'de 10 saniye boyunca her 30 dakikada bir orbital sallama uygulayın.
540 nanometrelik bir uyarma dalga boyu ve 590 nanometrelik bir emisyon dalga boyu kullanarak floresansı ölçün. Mono-tür biyofilmler, polimikrobiyal biyofilmlere kıyasla %50 öldürme elde etmek için önemli ölçüde daha düşük meropenem ve tobramisin konsantrasyonları gerektirdi ve ikincisi için gerekli olan antibiyotik konsantrasyonunda iki log artış oldu. Pseudomonas aeruginosa sağkalımı, mililitre tobramisin başına 64 mikrogram ile polimikrobiyal biyofilmlerde artarken, meropenem benzer koşullar altında sağkalımda bir azalma gösterdi.
Tek tür biyofilmlerde, Pseudomonas aeruginosa'nın sağkalımı ile hem meropenam hem de tobramisin ile tedavi edildiğinde metabolik aktivitesi arasında güçlü bir korelasyon gözlenmiştir.
