Nuestra investigación se centra en optimizar la preparación de antígenos para los ensayos de inhibición de la hemaglutinación. Para mejorar la precisión de la detección de anticuerpos contra el VEN, proporcionamos un método para la preparación rápida y precisa de la solución de antígeno 4-HAU. El ensayo HI sigue siendo el método más común para la detección de anticuerpos contra el VEN.
Sin embargo, las nuevas tecnologías, incluidos los sistemas automatizados de manejo de líquidos, las plataformas serológicas de alto rendimiento y las herramientas de imagen avanzadas, también se pueden integrar en el ensayo HI. Permiten un análisis más rápido y preciso, especialmente cuando se manejan lotes de gran tamaño. Establecimos un método eficiente para una detección más precisa de los títulos de HA de la solución madre de antígenos, combinado con un riguroso método de valoración inversa y un proceso de ajuste bien definido.
Este enfoque proporciona un método preciso y minimiza las tareas computacionales, aumentando la eficiencia y fiabilidad de las pruebas, y contribuyendo a mejorar la vigilancia y el control de enfermedades en las poblaciones avícolas. La suspensión de glóbulos rojos de pollo y la lectura visual de los resultados de HA HI aún contribuyen a la variabilidad. Nuestro laboratorio se centrará en la estandarización de la suspensión de RBC y en explorar la visión por ordenador u otros métodos para digitalizar los resultados del ensayo HA HI, reduciendo la subjetividad y mejorando la consistencia.
Para comenzar, agregue tres mililitros de solución de Alserver en un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 mililitros. Recoja un mililitro de sangre de la vena del ala de cada uno de los tres pollos no inmunes. A continuación, transfiera inmediatamente la sangre recogida al tubo anticoagulante y mezcle suavemente el contenido por inversión.
Llene el tubo con PBS estéril para llevar el volumen total a 12 mililitros. Mezcle la solución suavemente para asegurar una distribución uniforme de los componentes. A continuación, coloque el tubo en una centrífuga equipada con un rotor horizontal y centrifuga a 500 G durante 10 minutos.
Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante y la capa de glóbulos blancos del tubo. Con una pipeta, invierta un mililitro de la pastilla RBC en 99 mililitros de solución PBS estéril para preparar una suspensión de RBC al 1%. Para reconstituir el antígeno liofilizado, añadir dos mililitros de PBS estéril a la ampolla que lo contiene.
Agite suavemente la ampolla para disolver completamente el contenido y déjela reposar durante dos o tres minutos para minimizar la formación de burbujas. Solución reconstituida alícuota en tubos de centrífuga de 1,5 mililitros y almacenarla en un congelador a menos 20 grados centígrados hasta su uso. Para comenzar, dispense 40, 80, 120 y 160 microlitros de PBS respectivamente en cuatro pocillos adyacentes de una placa de microtitulación desechable de 96 pocillos con fondo en V.
Agregue 20 microlitros del antígeno reconstituido a cada pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces para crear dilución. Luego, etiquete claramente una nueva placa de microtitulación para los pasos posteriores y dispense 25 microlitros de PBS en cada pocillo en las filas uno a cinco. Con una pipeta multicanal, coloque 25 microlitros de las soluciones de antígeno diluido en los primeros pocillos de las filas uno a cinco.
Pipetear el contenido hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces para asegurar una distribución uniforme. Luego, transfiera 25 microlitros del primer pocillo de cada fila al segundo pocillo, mezclando bien. Deseche 25 microlitros de la solución final después de la 11ª columna.
A continuación, agregue 25 microlitros de PBS y suspensión de glóbulos rojos de pollo al 1% respectivamente a cada pocillo, comenzando con los pocillos que contienen la concentración de antígeno más baja. Coloque la placa de microtitulación en el agitador de microplacas para mezclar bien. Deje la placa intacta en la mesa de trabajo a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos para permitir que los glóbulos rojos de la columna 12 se asienten por completo.
Calcule el factor de dilución para preparar la solución de antígeno 4-HAU utilizando la fórmula que se muestra aquí. Determine el volumen total de la solución de 4-HAU necesaria y los volúmenes requeridos de la solución madre de antígenos y PBS utilizando la fórmula dada. Con una pipeta, transfiera el volumen calculado de PBS a un recipiente.
Agregue el volumen correspondiente de solución madre de antígeno y mezcle bien para preparar la solución de antígeno 4-HAU. Luego, dispense 25, 50, 75, 100, 125 y 150 microlitros de PBS en seis pocillos adyacentes de una placa de microtitulación. Agregue 25 microlitros de la solución de antígeno 4-HAU a cada pocillo y pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces para garantizar una dilución adecuada.
Con una pipeta multicanal, transfiera 25 microlitros de cada solución de antígeno diluida de la fila inicial a los pocillos de la otra fila. Luego, agregue 25 microlitros de PBS a cada pocillo, seguidos de 25 microlitros de una suspensión de glóbulos rojos al 1% en cada pocillo. Coloque el plato en un agitador de microplacas durante aproximadamente 20 segundos para mezclar bien el contenido.
Observe cuidadosamente los patrones de hemaglutinación en los pocillos y registre los resultados.
