M.Z. y K.S.F. y este trabajo fue apoyado por una subvención otorgada bajo el Pitt Innovation Challenge (PInCh), a través del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la Universidad de Pittsburgh, y la subvención NHLBI R01 HL153407, otorgada a M.Z.

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh aprobó todos los protocolos de animales especificados en esta publicación antes de llevar a cabo cualquiera de estos experimentos con animales.
NOTA: Este protocolo detalla cómo realizar estudios in vivo de aclaramiento mucociliario utilizando imágenes de radionúclidos con un escáner SPECT/CT de doble modalidad. Las técnicas demostradas son la realización de calibraciones del sistema, ratones anestesiantes, intubación traqueal de ratones, inculcar el isótopo en los pulmones, imágenes de doble modalidad, coregistro de estas imágenes y análisis.
1. Configuración del sistema SPECT/CT
<ol><li>Diseñe un flujo de trabajo adecuado y configure antes de ejecutar experimentos con animales vivos.<ol>
<li>Utilice una adquisición spect que consta de 60 proyecciones con un tamaño de paso de 6o entre proyecciones con un radio de rotación de 40 cm. La adquisición de TC consta de 220 proyecciones con un ángulo de 1,6o entre proyecciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asegúrese de que el sistema tenga los colimadores MWB correctos para ratones e imágenes SPECT en su lugar. Si los colimadores inapropiados están instalados, utilice el asistente de colimador para instalar los correctos.</li>
	<li>Ejecute las calibraciones del sistema necesarias para preparar el sistema para su uso. NOTA: Los componentes SPECT y CT del escáner necesitan calibración. Calibrar los componentes ct utilizando un acondicionamiento de origen y una calibración de luz/oscura (D/L) una vez al día, una calibración de desplazamiento central (COS) cada 2 semanas y evaluar el hardware de rayos X cada mes. Los componentes SPECT deben calibrarse una vez al año.<ol>
<li>Para evaluar el hardware de rayos X, active la casilla Evaluar hardware de rayos X durante las calibraciones de TC(Menú suplementario de calibración CT).</li>
		<li>Para realizar el acondicionamiento de origen, marque la casilla Realizar acondicionamiento de origen durante las calibraciones ct(Menú suplementario de calibración CT).</li>
		<li>Para realizar una calibración D/L, marque la casilla D/L junto al protocolo de adquisición de TC utilizado durante los experimentos durante las calibraciones por TC. Desmarque todos los demás protocolos(menú de calibración CT suplementaria).</li>
		<li>Para realizar una calibración cos, reemplace la cama por la herramienta de anillo de calibración, ajuste la configuración del tipo de cama para que coincida con la configuración del control de movimiento y marque la casilla COS junto al protocolo de adquisición de TC utilizado durante los experimentos durante las calibraciones por TC. Desmarque todos los demás protocolos(menú suplementario de calibración CT, anillo de calibración suplementario).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intubación e instilación del ratón
<ol><li>Pesar los ratones para ser escaneados. Si escanea varios ratones, tener cuidado de marcar a los ratones con fines de identificación utilizando métodos como punzonado en los oídos o marcado de la cola.</li>
	<li>Anestesiar un ratón usando 1.5% isoflurano con un flujo de gas de 2 L/min O2 en una cámara de gas durante ~5 minutos para producir anestesia de profundidad suficiente, hasta que la respiración se ralentiza a ~55-65 respiraciones por minuto 16 (Figura 1A).</li>
	<li>Retire el ratón de la cámara y suspenda por los incisivos delanteros en un soporte de intubación en una inclinación de 45o. Equipe el soporte de intubación con un cono nasal para asegurarse de que el ratón se anestesia durante la intubación (Figura 1B).</li>
	<li>Conecte un extremo de un cable de fibra óptica de 50 μm a una fuente de luz e enhebrar una cánula de calibre 20 sobre él utilizando el cable para actuar como guía (Figura 1C).</li>
	<li>Abra la boca del ratón y tire de la lengua hacia adelante usando fórceps contundentes. Ilumine el cable guía y utilícenlo para visualizar las cuerdas vocales (Figura 1D).</li>
	<li>Pase el cable guía a través de las cuerdas vocales para que el cable esté justo más allá de las cuerdas vocales y descansando en la tráquea superior. Deslice la cánula de 1 pulgada hacia adelante a lo largo del alambre para intubar el ratón, pasando la cánula lo suficientemente profundo como para que el cubo de la misma esté contra los incisivos del animal (Figura 1E). Retire el cable dejando la cánula en su lugar.</li>
	<li>Pruebe la intubación conectando brevemente la cánula con un dedo y comprobando si hay cambios en la respiración. La respiración interrumpida o la respiración tensa mientras se conecta y se acelera la respiración al liberarse son signos de intubación traqueal adecuada. Si no hay ningún cambio en los patrones respiratorios al conectar la cánula, es probable que este último esté en el esófago.</li>
	<li>Preparar 0,2 mCi de coloide de 99mde tecnecio-azufre(99mTc-Sc) en un volumen de 10 μL, y pipeta en la cánula. Permita que el ratón lo inhale espontáneamente en los pulmones durante 1-2 min(Figura 1F). Retire la cánula antes de transferir el ratón a la palet del escáner. NOTA: El radionúclido fue preparado y filtrado por cardinal Health.</li>
</ol>3. Imágenes SPECT/CT
<ol><li>Transfiera el ratón a un palé de 25 mm con un cono nasal y asegure con cinta adhesiva, teniendo cuidado de no pegar el pecho y el abdomen demasiado fuerte para evitar afectar la respiración. Se encargue de quitar las etiquetas de los oídos metálicos conectadas al ratón.</li>
	<li>Prepare un fantasma radiactivo que consista en 0,05 mCi en 200 μL y coloque esta cantidad en un tubo PCR de 0,2 ml. Coloque el tubo pegando al palet debajo del abdomen inferior del ratón, evitando la superposición con los pulmones. NOTA: El fantasma se utiliza con el fin de co-registrar imágenes CT y SPECT, así como un control negativo para el espacio libre.</li>
	<li>Inserte el ratón en el sistema SPECT/CT, seleccione el flujo de trabajo de imágenes y ejecute Configuración.</li>
	<li>Configure el posicionamiento de los detectores en el ratón y ejecute el flujo de trabajo de imágenes.</li>
	<li>Prepare una jaula para ratones que hayan recibido radiactividad después del procedimiento, con acceso sin restricciones a alimentos y agua, y etiquetado claro usando una pegatina de seguridad contra la radiación.</li>
	<li>Una vez completado el flujo de trabajo, retire el ratón del palet de imágenes y déjelo recuperar en la jaula preparada durante una duración de 6 horas entre escaneos (fin de la exploración 1 al comienzo del escaneo 2) con acceso ad libitum a alimentos y agua. 6 h fue elegido ya que corresponde al período de tiempo en el que se está produciendo un despeje lineal dependiendo de la función cilio con muy poca distancia alveolar.</li>
	<li>Después de 6 horas, vuelva a anestesiar el ratón y escanear, junto con el fantasma, utilizando el mismo flujo de trabajo para medir la cantidad de isótopo borrado de las vías respiratorias. NOTA: Es fundamental permitir que el ratón se recupere como anestesia ininterrumpida con isoflurano durante 6 horas dará lugar a un efecto cilia-depresivo significativo, lo que resulta en aclaramientos mucociliarios cercanos a cero.</li>
</ol>4. Análisis
<ol><li>Después de la creación de imágenes, realice el postprocesamiento para reconstruir imágenes completas de pila 3D.<ol>
<li>Histograma de las imágenes SPECT utilizando los ajustes estándar de fábrica para 99mTc, y luego reconstruir utilizando un algoritmo MAP3D y una reconstrucción de la función de dispersión de puntos (PSF). NOTA: La reconstrucción se realizó utilizando 8 iteraciones y 6 subconjuntos. Una reconstrucción efectiva necesita una relación de subconjuntos a proyecciones a la 1:10 o dividirse uniformemente en el número de proyecciones, por lo que se utilizaron 6 subconjuntos debido a la adquisición utilizando 60 proyecciones.</li>
		<li>Reconstruye las imágenes de TC usando el algoritmo Feldkamp y un filtro Shepp-Logan. NOTA: La reconstrucción se realizó utilizando 4 iteraciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procese las imágenes CT y SPECT en FIJI ImageJ21 utilizando la herramienta de reslice para generar imágenes de vista coronal a partir de las imágenes axiales predeterminadas. A continuación, realice una proyección de suma de pila z en la imagen SPECT para agregar los datos de recuento de cada sector y generar una sola imagen para facilitar el análisis.</li>
	<li>Redimensione y co-registre las imágenes CT y SPECT utilizando el tubo fantasma Eppendorf como referencia (Figura 2A,B). Realice un seguimiento y utilice mediciones consistentes de cambio de tamaño en todas las muestras.</li>
	<li>Binarize la imagen CT utilizando el umbral automático, seguido de invertir la pila y realizar una proyección de suma de pila z para generar un contorno de los pulmones para su análisis (Figura 2C).</li>
	<li>Gire las imágenes CT y SPECT y combine la imagen utilizando las herramientas de canal. Calcule MCC dibujando un ROI alrededor del pulmón derecho y midiendo (Figura 2D). NOTA: Esta medición será de los recuentos totales en el pulmón derecho para los puntos de tiempo de 0 y 6 horas, con las imágenes de 6 horas corregidas para la descomposición radiactiva utilizando la fórmula: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc tiene una constante de decaimiento de 3.21e−5 por segundo con una vida media de ~6 horas. Estos valores se pueden utilizar para calcular un porcentaje de espacio libre. NOTA: Pulmón derecho se elige para el dibujo de ROI y la medición cuenta como el aclaramiento mucociliario transportará el radioisótopo fuera de los pulmones a la faringe desde donde se tragará y terminará en el estómago. Con bastante frecuencia, los recuentos se pueden ver en el estómago que pueden superponerse con el pulmón izquierdo y por lo tanto producir recuentos erróneos. Esta confusión sólo se puede evitar midiendo los recuentos en el pulmón derecho.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Afzelius, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-related+diseases.">Cilia-related diseases.</a> Journal of Pathology. 204 (4), 470-477 (2004).</li><li>Mitchell, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+eukaryotic+cilia+and+flagella+as+motile+and+sensory+organelles.">The evolution of eukaryotic cilia and flagella as motile and sensory organelles.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 607, 130-140 (2007).</li><li>Carvalho-Santos, Z., Azimzadeh, J., Pereira-Leal, J. B., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution:+Tracing+the+origins+of+centrioles,+cilia,+and+flagella.">Evolution: Tracing the origins of centrioles, cilia, and flagella.</a> Journal of Cell Biology. 194 (2), 165-175 (2011).</li><li>Randell, S. H., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=University+of+North+Carolina+Virtual+Lung,+G.+Effective+mucus+clearance+is+essential+for+respiratory+health.">University of North Carolina Virtual Lung, G. Effective mucus clearance is essential for respiratory health.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 35 (1), 20-28 (2006).</li><li>Wanner, A., Salathe, M., O'Riordan, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+ciliary+phenotype+in+primary+ciliary+dyskinesia+by+micro-optical+coherence+tomography.">Assessment of ciliary phenotype in primary ciliary dyskinesia by micro-optical coherence tomography.</a> JCI Insight. 2 (5), 91702 (2017).</li><li>Nakhleh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+respiratory+ciliary+dysfunction+in+congenital+heart+disease+patients+with+heterotaxy.">High prevalence of respiratory ciliary dysfunction in congenital heart disease patients with heterotaxy.</a> Circulation. 125 (18), 2232-2242 (2012).</li><li>Whaley, S. L., Renken, S., Muggenburg, B. A., Wolff, R. 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Ninguno relacionado con este trabajo.

El papel de los cilios respiratorios móviles tanto en la enfermedad como en el desarrollo sigue evolucionando y siendo mejor apreciado. El latido sincrónico y meaclronal de múltiples cilios motiles en la superficie apical de las células que recubren el árbol traqueobronquial genera flujo de cefalad produciendo aclaramiento mucociliario o MCC. MCC se ve comprometida en ciliopatías como pcd22,enfermedades adquiridas como la EPOC18,y su importancia está siendo reconocida en los CHD, no tradicionalmente considerados ciliopatías. Datos recientes han mostrado disfunción ciciliaria respiratoria tanto en CHD con heterotaxi23 y sin heterotaxi7. Se demostró que dicha disfunción motil cilia se tradujo en mayores síntomas respiratorios9, así como una mayor morbilidad postoperatoria8. La mayoría, si no todas, de estas enfermedades, tienen modelos de ratón disponibles y nuestro protocolo para medir MCC en ratones es una herramienta valiosa que se puede utilizar para probar terapias potenciales.
Los modelos animales proporcionan utilidad para entender las enfermedades y el desarrollo de terapias. Las imágenes animales in vivo proporcionan más utilidad con la capacidad de adquirir múltiples puntos de datos de los mismos animales, sin necesidad de sacrificar a los animales, permitiendo a los investigadores seguir el curso longitudinal de la enfermedad, así como la duración del estudio de los efectos del tratamiento. El modelo de ratón de MCC ha sido desarrollado a lo largo de décadas por múltiples investigadores, inicialmente se está realizando en perros beagle utilizando centtigrafía plana, una técnica de imágenes nucleares bidimensionales24. La técnica fue adaptada para su uso en ratones una década más tarde, seguida de la adaptación a la imagen SPECT una década después de que25,26. El desarrollo de esta técnica en modelos de ratón fue un desarrollo importante en la relevancia de esta técnica, debido a la disponibilidad de múltiples modelos de ratón de enfermedades humanas como la PCD en la que la función ciliaria se altera significativamente. MCC ha sido evaluado en modelos de ratón de denervación pulmonar e inmunosupresión, y tiene el potencial de ser utilizado en conjunto con otros modelos19,26. Se han realizado estudios de medición de MCC en pacientes humanos con enfermedades de las vías respiratorias como CF, asma, PCD y ciliopatías asociadas con la CHD, y han dado resultados de que la técnica puede ayudar tanto a estudios de fisiología pulmonar como a eficacia terapéutica13.
Una parte importante de este protocolo es la configuración de adquisiciones con los parámetros de imagen correctos para adquirir imágenes precisas para la cuantificación. Una serie de factores son clave al diseñar la configuración de adquisición de SPECT, incluidos los que se utilizan colimadores, el número de proyecciones que se van a adquirir por revolución y el tamaño del paso de rotación. La selección del colimador es un factor importante en la sensibilidad y resolución de la adquisición, y es posible que los ajustes de adquisición deban adaptarse al colimador que se utiliza27. Alternativamente, cuando se utilizan animales más grandes como ratas, los colimadores tendrían que ser ajustados. Varios colimadores de agujeros, por ejemplo, son más sensibles, pero se debe tener cuidado al seleccionar un tamaño de paso para evitar la superposición de proyecciones y causar multiplexación no deseada, lo que puede aumentar aún más la sensibilidad de la adquisición a expensas de alguna ambigüedad de imagen que puede causar artefactos de reconstrucción25. La configuración de reconstrucción también es clave para generar imágenes cuantificables. MAP3D es un algoritmo de reconstrucción iterativa comúnmente utilizado, y PSF es un modelo de reconstrucción común. Ambos son confiables para reconstruir imágenes, pero se debe tener cuidado al establecer el número de iteraciones y subconjuntos. Un mayor número de iteraciones aumentará el tiempo computacional requerido para la reconstrucción, y aumentará la calidad de la reconstrucción con rendimientos cada vez menores al aumentar aún más.
Con el fin de cuantificar imágenes en ImageJ, la herramienta de medición ideal para utilizar es RawIntDen, que genera el valor de suma de píxeles en una selección. Al cuantificar los datos SPECT en ROIs pulmonares de diferentes tamaños, el uso de RawIntDen proporciona una medida absoluta de los recuentos y evita ajustar la medición al área del ROI, como lo haría la medición media21.
Esta técnica tiene una serie de fuentes de error asociadas de las que el investigador debe ser consciente al aplicar esta técnica. Un confundador notable es el uso de agentes anestésicos. Isoflurane es un anestésico inhalado de acción rápida del que los ratones se recuperan rápidamente después de completar una adquisición. Sin embargo, se debe tener cuidado de proporcionar a los ratones tiempo suficiente para recuperarse en sus jaulas, y no mantenerse anestesiados más tiempo del necesario. En nuestra experiencia personal (datos inéditos) los ratones que se mantuvieron anestesiados continuamente usando isofluranos inhalados entre el punto de tiempo de 0 y 6 horas mostraron un aclaramiento insignificante. Del mismo modo, también es necesaria una dosis controlada de anestésico para garantizar una rápida recuperación. Al asegurar al animal al palet para obtener imágenes, el tubo fantasma utilizado para el coregistro debe mantenerse bajo en el estómago para evitar que los artefactos se superpongan con los pulmones. Del mismo modo, para garantizar una imagen CT de calidad, tener cuidado de eliminar cualquier etiqueta de metal del ratón para evitar artefactos de dispersión de rayos X.
El protocolo MCC actual se puede aplicar a innumerables modelos animales. Esta técnica tiene un efecto insignificante en la salud del animal escaneado, es bien tolerada por ratones, y debido a esto se puede utilizar con modelos de enfermedad sin poner en riesgo la salud de ratones ya delicados. La fuerza de esta metodología proviene de que se trata de una técnica in vivo, que permite la adquisición de mediciones consistentes y repetibles de la función de las vías respiratorias sin el sacrificio de animales para excitar las tráqueas para la video-microscopía, que los modelos ex vivo requieren26. La consistencia de esta técnica en la producción de mediciones repetibles a través de múltiples escaneos de los mismos animales, permite que el mismo animal sea tratado con diferentes agentes o terapias potenciales, y comparaciones estadísticas realizadas entre el mismo animal para reducir la variabilidad biológica inherente a cualquier modelo animal, reduciendo así el tamaño de la muestra necesaria para mostrar diferencias estadísticamente significativas.
La evaluación de la función de las vías respiratorias utilizando la técnica MCC se puede ajustar a una variedad de modelos animales y aplicarse a muchos modelos diferentes de salud de las vías respiratorias, así como probar nuevas terapias. Las vías respiratorias de los modelos de ratón de PCD se pueden evaluar utilizando esta técnica, así como modelos de EPOC. Nuestro método también se puede utilizar para estudiar efectos diferenciales de varios anestésicos en MCC que están en uso clínico común. Por último, los efectos de los agentes terapéuticos en las vías respiratorias también se pueden evaluar utilizando este modelo. Como se indicó anteriormente pero lleva a la repetición, ya que es una medición in vivo que permite repetir las evaluaciones de MCC en el transcurso de una enfermedad, así como los beneficios de prueba de intervenciones terapéuticas a lo largo del tiempo. Además, los ratones son los animales de laboratorio más comunes utilizados para imitar/estudiar enfermedades humanas, con, en algunos casos, múltiples modelos transgénicos de ratón de enfermedades humanas disponibles para elegir.

Los cilia son orgánulos celulares a base de microtúbulos conservados a través de la historia evolutiva, desde algas hasta humanos. Emanan de las superficies celulares y tienen una serie de funciones1,que van desde el reconocimiento de señales sensoriales ambientales locales hasta la motilidad, funciones que se pueden rastrear desde los seres humanos hasta los primeros organismos eucariotas unicelulares2,3. Cilia puede ser no motil y servir como antena especializada de una célula para procesar señales ambientales; o motil y múltiple, batiendo en ondas metachronales sincronizadas para generar flujo fluido, como en el revestimiento de las trompas de Falopio y las vías respiratorias superior e inferior, a excepción de los bronquioles terminales que conducen al alvéolo1,2.
La extensa superficie epitelial de las vías respiratorias está expuesta a un aluvión constante de contaminación en forma de una variedad de contaminantes y patógenos inhalados potencialmente peligrosos, lo que requiere una defensa. Un mecanismo de defensa clave es el aparato mucociliario del árbol traqueobronquial, donde un flujo continuo de moco secreto es transportado mecánicamente fuera de las vías respiratorias por el latido de múltiples cilios motiles que recubren las superficies apicales de las células epiteliales traqueo-bronquiales. Estos funcionan para atrapar contaminantes inhalados, y a través de su latido continuo y sincronal, transportarlos cefalad4,5.
Se ha demostrado que Cilia tiene papeles clave como en el desarrollo de patrones izquierda-derecha en el desarrollo de embriones, donde los cilios móviles en el nodo embrionario rompen la simetría6. Las mutaciones en genes relacionados con cilio se han relacionado con enfermedades como las cardiopatías congénitas (CHD) debido a la estructura asimétrica del corazón6. Estudios recientes han reportado una alta incidencia de disfunción ciciliaria en las vías respiratorias de pacientes con CHD, así como una mayor prevalencia de complicaciones respiratorias postoperatorias y síntomas crónicos de las vías respiratorias en las vías respiratorias superior e inferior7,8,9,10. Se ha demostrado que los pacientes con CHD y disfunción ciciliaria, con o sin heterotaxi, tienen un mayor riesgo de complicaciones respiratorias y resultados respiratorios negativos después de la operación5,8,10. Más allá de sus funciones en la señalización y el desarrollo, la importancia de los ciliopatías de las vías respiratorias ha demostrado la ciliopatías, de las cuales un ejemplo principal es la discinesia ciciliaria primaria (PCD). La PCD es un trastorno congénito resultante de una serie de mutaciones que afectan a los cilios respiratorios móviles, lo que conduce a infecciones pulmonares recurrentes, bronquiectasis y potencialmente la necesidad de trasplante de pulmón11. Además, a pesar de que los cilios son normales en fibrosis quística (CF), trastorno congénito más común en la población caucásica, mcc se deteriora debido a moco grueso y viscoso resultante de mutaciones en el gen CFTR12. Hay múltiples modelos de ratón de PCD y CF, así como un número cada vez mayor de modelos de CHD. En última instancia, los cilios son estructuras versátiles con muchas funciones clave, y un método para evaluar la función de los cilios respiratorios móviles in vivo puede ser valioso para el estudio preclínicos, y la evaluación de los efectos de mutaciones, así como los fármacos sobre el aclaramiento mucociliario (MCC)13. El método también sería valioso para evaluar los efectos de nuevos fármacos, terapia génica o intervenciones en MCC en estos modelos de ratón.
Hay muchos modelos diferentes que se han utilizado para evaluar MCC. Un método notable consiste en el uso de tinte azul de metileno que ha sido inculcado en el bronco, con aclaramiento medido por la medición fibrapóptica del movimiento del tinte14. Este método está limitado por la capacidad de observar el movimiento del tinte, que es más rutinario en los seres humanos que en los modelos de ratón preclínicos. Otro método notable es la imagen de rayos X de contraste de fase sincrotrón (PCXI), que se puede utilizar para rastrear partículas individuales en una vía respiratoria. Este método es relativamente nuevo y no es ampliamente accesible15. Existen numerosos métodos ex vivo para evaluar las vías respiratorias mediante la extirpación de una tráquea para la video-microscopía, sin embargo estos modelos proporcionan poca utilidad en pacientes humanos16. Las técnicas de alta resolución para imágenes ciliadas, como la tomografía por coherencia óptica, están limitadas de la misma manera17.
En este artículo, presentamos un método reproducible para medir mcc in vivo que se ha utilizado para medir los aclaramientos pulmonares en innumerables modelos animales, así como estudiar MCC en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y evaluar los efectos de los fármacos inmunosupresores18,19. Este método rastrea el aclaramiento del coloide radiofármaco de 99mtecnecio-azufre(99mTc-Sc), un radiopaso particulado insoluble, después de la instilación en los pulmones. A continuación, se puede realizar un seguimiento del radionúclido utilizando una sola tomografía computarizada por emisión de fotón (SPECT)18,20. Hemos perfeccionado aún más esta técnica para medir MCC mediante el uso de la doble modalidad SPECT y tomografía computarizada (TC) con la co-localización de los recuentos de radioisótopos a los pulmones y midiendo la disminución en estos recuentos durante 6 horas. Las imágenes de doble modalidad, con el coregistro de imágenes CT y SPECT, permiten una localización precisa de los recuentos de radiación a nuestra región de interés, los pulmones. Aunque describimos en detalle el método para la medición de MCC en ratones, el protocolo se puede ajustar para estudiar MCC en ratas. Los colimadores tendrían que ajustarse, así como la dosis de radiación. En nuestra opinión, los escáneres MCC del ratón son más difíciles técnicamente debido al pequeño tamaño animal, pero más útil que las ratas debido al gran número de modelos de ratón establecidos de una serie de trastornos humanos. Además, debido a su menor costo y costo de mantenimiento en colonias de animales, un tamaño de muestra más grande es más factible en ratones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>500 &#181;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>02-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Vaporizer</td>
			<td>Vetland Medical</td>
			<td>A13480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durmont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>99150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1534477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>118-2097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Intubation Stand</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>ETI-MSE-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel Anesthesia Stand</td>
			<td>Summit Anesthesia Solutions</td>
			<td>22860</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

Los cilios de motil respiratorio, orgánulos especializados de la célula, recubren la superficie apical de las células epiteliales que recubren las vías respiratorias. Al batir de manera metachronal y sincronal, estos orgánulos múltiples, motiles y basados en actinas generan un flujo de líquido cefalorraya que despeja las vías respiratorias de contaminantes y patógenos inhalados. Con el aumento de la contaminación ambiental, los nuevos patógenos virales y las bacterias multirresistente emergentes, el aclaramiento mucociliario generado por cilios (MCC) es esencial para mantener la salud pulmonar. Mcc también está deprimido en múltiples trastornos congénitas como disquinesia ciciliaria primaria, fibrosis quística, así como trastornos adquiridos como enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Todos estos trastornos han establecido, en algún caso múltiples, modelos de ratón. En esta publicación, detallamos un método utilizando una pequeña cantidad de radiactividad e imágenes SPECT/CT de doble modalidad para medir con precisión y reproducibilidad mcc en ratones in vivo. El método permite la recuperación de ratones después de la toma de imágenes, hacer posibles mediciones en serie y probar posibles terapias longitudinalmente a lo largo del tiempo. Los datos en ratones de tipo salvaje demuestran la reproducibilidad de la medición de MCC siempre y cuando se preste una atención adecuada al detalle, y el protocolo se cumpla estrictamente.

Usando este protocolo, anestesiamos ratones en una cámara isoflurano(Figura 1A). Después de alcanzar un nivel adecuado de anestesia, los ratones fueron colocados en soportes verticales(Figura 1B)y las cuerdas vocales fueron visualizadas usando un alambre guía iluminado (Figura 1C-1D). Los ratones fueron intubados e inculcados con 0,2 mCi 99mTc-Sc en volúmenes de 10 μL a través de una cánula y ratones autorizados a inhalar espontáneamente en los pulmones (Figura 1E-1F). Después de la adquisición y el procesamiento de imágenes, las imágenes CT y SPECT se colocaron(Figura 2A)utilizando el tubo fantasma como punto de referencia (Figura 2B). Las máscaras de los pulmones se generaron a partir de la imagen de TC(Figura 2C)y se utilizaron para dibujar ROIs alrededor del pulmón derecho para su análisis en 0 (Figura 2D) y 6 horas (Figura 2E-2F). Para probar la reproducibilidad del protocolo, un total de 8 ratones fueron escaneados dos veces en diferentes días con condiciones experimentales idénticas, con análisis utilizando una prueba t emparejada que no muestra ninguna diferencia significativa entre los escaneos repetidos (p-value=0.9904) (Figura 3A). Otros 2 ratones fueron escaneados tres veces en diferentes días con condiciones experimentales idénticas, con análisis utilizando ANOVA unidireccional que muestra coincidencia significativa entre los escaneos repetidos (valor p de 0,0041) (Figura 3B). Se escanearon un total de 8 ratones y se mostraron dos imágenes representativas(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Figura 1: Intubación del ratón e instilación de isótopos. Imágenes de los pasos necesarios para intubar e inculcar isótopos en las vías respiratorias. A) El ratón está anestesiado en una cámara. B) El ratón anestesiado se coloca en un soporte vertical, suspendido por los incisivos delanteros. C) Se prepara un cable de fibra óptica iluminado de 0,5 mm que sirve como cable guía ejecutándolo a través de una cánula de 20 G. D) La boca del ratón se abre con fórceps e iluminada utilizando el cable guía iluminado para visualizar las cuerdas vocales. E) La cánula se empuja a través de las cuerdas vocales y se elimina el cable guía. F) Isótopo soluble se inculca en la cánula utilizando una pipeta y el ratón permite inhalar espontáneamente el isótopo en los pulmones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Figura 2: Imágenes SPECT/CT de una exploración MCC. A) Una imagen SPECT que ha sido co-localizada con una imagen de TC. B) Una imagen de TC con un tubo fantasma visible que se utilizó para la coincolo localización. C) Una máscara de las vías respiratorias derivada de binarizar la imagen ct y realizar una proyección de suma de pila z. D) La máscara ct co-localizada con la imagen SPECT. Se ha dibujado un ROI para su análisis alrededor del pulmón derecho. E) Una máscara de las vías respiratorias a las 6 horas. F) Una imagen co-localizada ct y SPECT de las vías respiratorias a las 6 horas con un ROI para su análisis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Figura 3: Mediciones de espacio libre de los mismos ratones a través de múltiples escaneos. A) Se midieron dos aclaramientos de repetición individuales para 8 ratones sin cambios en las condiciones experimentales. Una prueba de t emparejada mostró que no había ninguna diferencia significativa entre los escaneos repetidos con un valor p de 0,9904. B) Se midieron tres aclaramientos de repetición individuales para dos ratones sin cambios en las condiciones experimentales. Un ANOVA unidireccional mostró que había coincidencia significativa entre los escaneos repetidos con un valor p de 0,0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes espect/CT co-localizadas de las vías respiratorias de 0 y 6 horas en 2 ratones con ROIs dibujadas a las 0 y 6 horas esbozando el pulmón derecho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1: Un vídeo de las cuerdas vocales iluminadas por un cable de fibra óptica con el efecto de la respiración visualizada. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Archivos suplementarios. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar estos archivos.</a>

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In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

En esta publicación, describimos protocolos para evaluar el aclaramiento mucociliario de las vías respiratorias (MCC) en ratones in vivo utilizando imágenes de radionúclidos de doble modalidad. Este protocolo está diseñado para un único protocolo de adquisición de tomografía computarizada por emisión de fotones (SPECT) y tomografía computarizada (TC) utilizando colimadores de cuerpo entero del ratón (MWB) en un sistema SPECT/CT dual.

Evaluación in vivo del aclaramiento mucociliario en ratones

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

4.2K vistas.  University of Pittsburgh School of Medicine. En esta publicación, describimos protocolos para evaluar el aclaramiento mucociliario de las vías respiratorias (MCC) en ratones in vivo utilizando imágenes de radionúclidos de doble modalidad. Este protocolo está diseñado para un único protocolo de adquisición de tomografía computarizada por emisión de fotones (SPECT) y tomografía computarizada (TC) utilizando colimadores de cuerpo entero del ratón (MWB) en un sistema SPECT/CT dual.

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In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

En Vivo 2-Photon imágenes de calcio en la capa 2 / 3 de los ratones

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Investigación

Biología

Evaluation of the Spatial Distribution of &gamma;H2AX following Ionizing Radiation

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone H2AX1,2. This phosphorylation of H2AX is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)3. The phosphorylated form of H2AX, referred to as &gamma;H2AX, spreads to adjacent regions of chromatin from the site of the DSB, forming discrete foci, which are easily visualized by immunofluorecence microscopy3. Analysis and quantitation of &gamma;H2AX foci has been widely used to evaluate DSB formation and repair, particularly in response to ionizing radiation and for evaluating the efficacy of various radiation modifying compounds and cytotoxic compounds4.
Given the exquisite specificity and sensitivity of this de novo marker of DSBs, it has provided new insights into the processes of DNA damage and repair in the context of chromatin. For example, in radiation biology the central paradigm is that the nuclear DNA is the critical target with respect to radiation sensitivity. Indeed, the general consensus in the field has largely been to view chromatin as a homogeneous template for DNA damage and repair. However, with the use of &gamma;H2AX as molecular marker of DSBs, a disparity in &gamma;-irradiation-induced &gamma;H2AX foci formation in euchromatin and heterochromatin has been observed5-7. Recently, we used a panel of antibodies to either mono-, di- or tri- methylated histone H3 at lysine 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) which are epigenetic imprints of constitutive heterochromatin and transcriptional silencing and lysine 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3), which are tightly correlated actively transcribing euchromatic regions, to investigate the spatial distribution of &gamma;H2AX following ionizing radiation8. In accordance with the prevailing ideas regarding chromatin biology, our findings indicated a close correlation between &gamma;H2AX formation and active transcription9. Here we demonstrate our immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in non-adherent cells, with a particular focus on co-localization with other epigenetic markers, image analysis and 3D-modeling.

Evaluation of the Spatial Distribution of &#947;H2AX following Ionizing Radiation

Microscopic analysis of &gamma;H2AX foci, which form following the phosphorylation of H2AX at Ser-139 in response to DNA double-strand breaks, has become an invaluable tool in radiation biology. Here we used an antibody to mono-methylated histone H3 at lysine 4 as an epigenetic marker of actively transcribing euchromatin, to evaluate the spatial distribution of radiation-induced &gamma;H2AX formation within the nucleus.

Evaluación de la distribución espacial de la radiación ionizante γH2AX siguientes

An early molecular response to DNA double-strand breaks (DSBs) is phosphorylation of the Ser-139 residue within the terminal SQEY motif of the histone ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the production of new mouse models of disease and investigations into the hormonal regulation of tissue degeneration (or regeneration) following pathological challenge. The murine reproductive (or estrous) cycle is divided into 4 stages: proestrus, estrus, metestrus, and diestrus. Defined fluctuations in circulating levels of the ovarian steroids 17-&beta;-estradiol and progesterone, the gonadotropins luteinizing and follicle stimulating hormones, and the luteotropic hormone prolactin signal transition through these reproductive stages. Changes in cell typology within the murine vaginal canal reflect these underlying endocrine events. Daily assessment of the relative ratio of nucleated epithelial cells, cornified squamous epithelial cells, and leukocytes present in vaginal smears can be used to identify murine estrous stages. The degree of invasiveness, however, employed in collecting these samples can alter reproductive status and elicit an inflammatory response that can confound cytological assessment of smears. Here, we describe a simple, non-invasive protocol that can be used to determine the stage of the estrous cycle of a female mouse without altering her reproductive cycle. We detail how to differentiate between the four stages of the estrous cycle by collection and analysis of predominant cell typology in vaginal smears and we show how these changes can be interpreted with respect to endocrine status.

Here, we describe how to identify the stage of the murine reproductive (proestrus, estrus, metestrus, or diestrus) by simple, non-invasive collection and cytological assessment of vaginal smear samples. We further describe how vaginal cytology reflects circulating hormonal levels underlying transition through the murine reproductive cycle.

Realizar el lavado de la vagina, tinción de cristal violeta y Evaluación citológica vaginal para ratón Celo identificación Staging Ciclo

A rapid means of assessing reproductive status in rodents is useful not only in the study of reproductive dysfunction but is also required for the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Changes in limb muscle contractile and passive mechanical properties are important biomarkers for muscle diseases. This manuscript describes physiological assays to measure these properties in the murine extensor digitorum longus and tibialis anterior muscles.

Evaluación de la función muscular del músculo extensor largo digitorum<em&gt; Ex vivo</em&gt; Y tibial anterior del músculo<em&gt; In situ</em&gt; En ratones

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

La medición de la rigidez de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ratón aortas Usando microscopía de fuerza atómica

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...