Name: in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice
Uploaded: 2020-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
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M.Z. y K.S.F. y este trabajo fue apoyado por una subvención otorgada bajo el Pitt Innovation Challenge (PInCh), a través del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la Universidad de Pittsburgh, y la subvención NHLBI R01 HL153407, otorgada a M.Z.

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh aprobó todos los protocolos de animales especificados en esta publicación antes de llevar a cabo cualquiera de estos experimentos con animales.
NOTA: Este protocolo detalla cómo realizar estudios in vivo de aclaramiento mucociliario utilizando imágenes de radionúclidos con un escáner SPECT/CT de doble modalidad. Las técnicas demostradas son la realización de calibraciones del sistema, ratones anestesiantes, intubación traqueal de ratones, inculcar el isótopo en los pulmones, imágenes de doble modalidad, coregistro de estas imágenes y análisis.
1. Configuración del sistema SPECT/CT
<ol><li>Diseñe un flujo de trabajo adecuado y configure antes de ejecutar experimentos con animales vivos.<ol>
<li>Utilice una adquisición spect que consta de 60 proyecciones con un tamaño de paso de 6o entre proyecciones con un radio de rotación de 40 cm. La adquisición de TC consta de 220 proyecciones con un ángulo de 1,6o entre proyecciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asegúrese de que el sistema tenga los colimadores MWB correctos para ratones e imágenes SPECT en su lugar. Si los colimadores inapropiados están instalados, utilice el asistente de colimador para instalar los correctos.</li>
	<li>Ejecute las calibraciones del sistema necesarias para preparar el sistema para su uso. NOTA: Los componentes SPECT y CT del escáner necesitan calibración. Calibrar los componentes ct utilizando un acondicionamiento de origen y una calibración de luz/oscura (D/L) una vez al día, una calibración de desplazamiento central (COS) cada 2 semanas y evaluar el hardware de rayos X cada mes. Los componentes SPECT deben calibrarse una vez al año.<ol>
<li>Para evaluar el hardware de rayos X, active la casilla Evaluar hardware de rayos X durante las calibraciones de TC(Menú suplementario de calibración CT).</li>
		<li>Para realizar el acondicionamiento de origen, marque la casilla Realizar acondicionamiento de origen durante las calibraciones ct(Menú suplementario de calibración CT).</li>
		<li>Para realizar una calibración D/L, marque la casilla D/L junto al protocolo de adquisición de TC utilizado durante los experimentos durante las calibraciones por TC. Desmarque todos los demás protocolos(menú de calibración CT suplementaria).</li>
		<li>Para realizar una calibración cos, reemplace la cama por la herramienta de anillo de calibración, ajuste la configuración del tipo de cama para que coincida con la configuración del control de movimiento y marque la casilla COS junto al protocolo de adquisición de TC utilizado durante los experimentos durante las calibraciones por TC. Desmarque todos los demás protocolos(menú suplementario de calibración CT, anillo de calibración suplementario).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Intubación e instilación del ratón
<ol><li>Pesar los ratones para ser escaneados. Si escanea varios ratones, tener cuidado de marcar a los ratones con fines de identificación utilizando métodos como punzonado en los oídos o marcado de la cola.</li>
	<li>Anestesiar un ratón usando 1.5% isoflurano con un flujo de gas de 2 L/min O2 en una cámara de gas durante ~5 minutos para producir anestesia de profundidad suficiente, hasta que la respiración se ralentiza a ~55-65 respiraciones por minuto 16 (Figura 1A).</li>
	<li>Retire el ratón de la cámara y suspenda por los incisivos delanteros en un soporte de intubación en una inclinación de 45o. Equipe el soporte de intubación con un cono nasal para asegurarse de que el ratón se anestesia durante la intubación (Figura 1B).</li>
	<li>Conecte un extremo de un cable de fibra óptica de 50 μm a una fuente de luz e enhebrar una cánula de calibre 20 sobre él utilizando el cable para actuar como guía (Figura 1C).</li>
	<li>Abra la boca del ratón y tire de la lengua hacia adelante usando fórceps contundentes. Ilumine el cable guía y utilícenlo para visualizar las cuerdas vocales (Figura 1D).</li>
	<li>Pase el cable guía a través de las cuerdas vocales para que el cable esté justo más allá de las cuerdas vocales y descansando en la tráquea superior. Deslice la cánula de 1 pulgada hacia adelante a lo largo del alambre para intubar el ratón, pasando la cánula lo suficientemente profundo como para que el cubo de la misma esté contra los incisivos del animal (Figura 1E). Retire el cable dejando la cánula en su lugar.</li>
	<li>Pruebe la intubación conectando brevemente la cánula con un dedo y comprobando si hay cambios en la respiración. La respiración interrumpida o la respiración tensa mientras se conecta y se acelera la respiración al liberarse son signos de intubación traqueal adecuada. Si no hay ningún cambio en los patrones respiratorios al conectar la cánula, es probable que este último esté en el esófago.</li>
	<li>Preparar 0,2 mCi de coloide de 99mde tecnecio-azufre(99mTc-Sc) en un volumen de 10 μL, y pipeta en la cánula. Permita que el ratón lo inhale espontáneamente en los pulmones durante 1-2 min(Figura 1F). Retire la cánula antes de transferir el ratón a la palet del escáner. NOTA: El radionúclido fue preparado y filtrado por cardinal Health.</li>
</ol>3. Imágenes SPECT/CT
<ol><li>Transfiera el ratón a un palé de 25 mm con un cono nasal y asegure con cinta adhesiva, teniendo cuidado de no pegar el pecho y el abdomen demasiado fuerte para evitar afectar la respiración. Se encargue de quitar las etiquetas de los oídos metálicos conectadas al ratón.</li>
	<li>Prepare un fantasma radiactivo que consista en 0,05 mCi en 200 μL y coloque esta cantidad en un tubo PCR de 0,2 ml. Coloque el tubo pegando al palet debajo del abdomen inferior del ratón, evitando la superposición con los pulmones. NOTA: El fantasma se utiliza con el fin de co-registrar imágenes CT y SPECT, así como un control negativo para el espacio libre.</li>
	<li>Inserte el ratón en el sistema SPECT/CT, seleccione el flujo de trabajo de imágenes y ejecute Configuración.</li>
	<li>Configure el posicionamiento de los detectores en el ratón y ejecute el flujo de trabajo de imágenes.</li>
	<li>Prepare una jaula para ratones que hayan recibido radiactividad después del procedimiento, con acceso sin restricciones a alimentos y agua, y etiquetado claro usando una pegatina de seguridad contra la radiación.</li>
	<li>Una vez completado el flujo de trabajo, retire el ratón del palet de imágenes y déjelo recuperar en la jaula preparada durante una duración de 6 horas entre escaneos (fin de la exploración 1 al comienzo del escaneo 2) con acceso ad libitum a alimentos y agua. 6 h fue elegido ya que corresponde al período de tiempo en el que se está produciendo un despeje lineal dependiendo de la función cilio con muy poca distancia alveolar.</li>
	<li>Después de 6 horas, vuelva a anestesiar el ratón y escanear, junto con el fantasma, utilizando el mismo flujo de trabajo para medir la cantidad de isótopo borrado de las vías respiratorias. NOTA: Es fundamental permitir que el ratón se recupere como anestesia ininterrumpida con isoflurano durante 6 horas dará lugar a un efecto cilia-depresivo significativo, lo que resulta en aclaramientos mucociliarios cercanos a cero.</li>
</ol>4. Análisis
<ol><li>Después de la creación de imágenes, realice el postprocesamiento para reconstruir imágenes completas de pila 3D.<ol>
<li>Histograma de las imágenes SPECT utilizando los ajustes estándar de fábrica para 99mTc, y luego reconstruir utilizando un algoritmo MAP3D y una reconstrucción de la función de dispersión de puntos (PSF). NOTA: La reconstrucción se realizó utilizando 8 iteraciones y 6 subconjuntos. Una reconstrucción efectiva necesita una relación de subconjuntos a proyecciones a la 1:10 o dividirse uniformemente en el número de proyecciones, por lo que se utilizaron 6 subconjuntos debido a la adquisición utilizando 60 proyecciones.</li>
		<li>Reconstruye las imágenes de TC usando el algoritmo Feldkamp y un filtro Shepp-Logan. NOTA: La reconstrucción se realizó utilizando 4 iteraciones.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procese las imágenes CT y SPECT en FIJI ImageJ21 utilizando la herramienta de reslice para generar imágenes de vista coronal a partir de las imágenes axiales predeterminadas. A continuación, realice una proyección de suma de pila z en la imagen SPECT para agregar los datos de recuento de cada sector y generar una sola imagen para facilitar el análisis.</li>
	<li>Redimensione y co-registre las imágenes CT y SPECT utilizando el tubo fantasma Eppendorf como referencia (Figura 2A,B). Realice un seguimiento y utilice mediciones consistentes de cambio de tamaño en todas las muestras.</li>
	<li>Binarize la imagen CT utilizando el umbral automático, seguido de invertir la pila y realizar una proyección de suma de pila z para generar un contorno de los pulmones para su análisis (Figura 2C).</li>
	<li>Gire las imágenes CT y SPECT y combine la imagen utilizando las herramientas de canal. Calcule MCC dibujando un ROI alrededor del pulmón derecho y midiendo (Figura 2D). NOTA: Esta medición será de los recuentos totales en el pulmón derecho para los puntos de tiempo de 0 y 6 horas, con las imágenes de 6 horas corregidas para la descomposición radiactiva utilizando la fórmula: N(t) = N0e−t. 99m Tc-Sc tiene una constante de decaimiento de 3.21e−5 por segundo con una vida media de ~6 horas. Estos valores se pueden utilizar para calcular un porcentaje de espacio libre. NOTA: Pulmón derecho se elige para el dibujo de ROI y la medición cuenta como el aclaramiento mucociliario transportará el radioisótopo fuera de los pulmones a la faringe desde donde se tragará y terminará en el estómago. Con bastante frecuencia, los recuentos se pueden ver en el estómago que pueden superponerse con el pulmón izquierdo y por lo tanto producir recuentos erróneos. Esta confusión sólo se puede evitar midiendo los recuentos en el pulmón derecho.</li>
</ol>

<ol>
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Ninguno relacionado con este trabajo.

El papel de los cilios respiratorios móviles tanto en la enfermedad como en el desarrollo sigue evolucionando y siendo mejor apreciado. El latido sincrónico y meaclronal de múltiples cilios motiles en la superficie apical de las células que recubren el árbol traqueobronquial genera flujo de cefalad produciendo aclaramiento mucociliario o MCC. MCC se ve comprometida en ciliopatías como pcd22,enfermedades adquiridas como la EPOC18,y su importancia está siendo reconocida en los CHD, no tradicionalmente considerados ciliopatías. Datos recientes han mostrado disfunción ciciliaria respiratoria tanto en CHD con heterotaxi23 y sin heterotaxi7. Se demostró que dicha disfunción motil cilia se tradujo en mayores síntomas respiratorios9, así como una mayor morbilidad postoperatoria8. La mayoría, si no todas, de estas enfermedades, tienen modelos de ratón disponibles y nuestro protocolo para medir MCC en ratones es una herramienta valiosa que se puede utilizar para probar terapias potenciales.
Los modelos animales proporcionan utilidad para entender las enfermedades y el desarrollo de terapias. Las imágenes animales in vivo proporcionan más utilidad con la capacidad de adquirir múltiples puntos de datos de los mismos animales, sin necesidad de sacrificar a los animales, permitiendo a los investigadores seguir el curso longitudinal de la enfermedad, así como la duración del estudio de los efectos del tratamiento. El modelo de ratón de MCC ha sido desarrollado a lo largo de décadas por múltiples investigadores, inicialmente se está realizando en perros beagle utilizando centtigrafía plana, una técnica de imágenes nucleares bidimensionales24. La técnica fue adaptada para su uso en ratones una década más tarde, seguida de la adaptación a la imagen SPECT una década después de que25,26. El desarrollo de esta técnica en modelos de ratón fue un desarrollo importante en la relevancia de esta técnica, debido a la disponibilidad de múltiples modelos de ratón de enfermedades humanas como la PCD en la que la función ciliaria se altera significativamente. MCC ha sido evaluado en modelos de ratón de denervación pulmonar e inmunosupresión, y tiene el potencial de ser utilizado en conjunto con otros modelos19,26. Se han realizado estudios de medición de MCC en pacientes humanos con enfermedades de las vías respiratorias como CF, asma, PCD y ciliopatías asociadas con la CHD, y han dado resultados de que la técnica puede ayudar tanto a estudios de fisiología pulmonar como a eficacia terapéutica13.
Una parte importante de este protocolo es la configuración de adquisiciones con los parámetros de imagen correctos para adquirir imágenes precisas para la cuantificación. Una serie de factores son clave al diseñar la configuración de adquisición de SPECT, incluidos los que se utilizan colimadores, el número de proyecciones que se van a adquirir por revolución y el tamaño del paso de rotación. La selección del colimador es un factor importante en la sensibilidad y resolución de la adquisición, y es posible que los ajustes de adquisición deban adaptarse al colimador que se utiliza27. Alternativamente, cuando se utilizan animales más grandes como ratas, los colimadores tendrían que ser ajustados. Varios colimadores de agujeros, por ejemplo, son más sensibles, pero se debe tener cuidado al seleccionar un tamaño de paso para evitar la superposición de proyecciones y causar multiplexación no deseada, lo que puede aumentar aún más la sensibilidad de la adquisición a expensas de alguna ambigüedad de imagen que puede causar artefactos de reconstrucción25. La configuración de reconstrucción también es clave para generar imágenes cuantificables. MAP3D es un algoritmo de reconstrucción iterativa comúnmente utilizado, y PSF es un modelo de reconstrucción común. Ambos son confiables para reconstruir imágenes, pero se debe tener cuidado al establecer el número de iteraciones y subconjuntos. Un mayor número de iteraciones aumentará el tiempo computacional requerido para la reconstrucción, y aumentará la calidad de la reconstrucción con rendimientos cada vez menores al aumentar aún más.
Con el fin de cuantificar imágenes en ImageJ, la herramienta de medición ideal para utilizar es RawIntDen, que genera el valor de suma de píxeles en una selección. Al cuantificar los datos SPECT en ROIs pulmonares de diferentes tamaños, el uso de RawIntDen proporciona una medida absoluta de los recuentos y evita ajustar la medición al área del ROI, como lo haría la medición media21.
Esta técnica tiene una serie de fuentes de error asociadas de las que el investigador debe ser consciente al aplicar esta técnica. Un confundador notable es el uso de agentes anestésicos. Isoflurane es un anestésico inhalado de acción rápida del que los ratones se recuperan rápidamente después de completar una adquisición. Sin embargo, se debe tener cuidado de proporcionar a los ratones tiempo suficiente para recuperarse en sus jaulas, y no mantenerse anestesiados más tiempo del necesario. En nuestra experiencia personal (datos inéditos) los ratones que se mantuvieron anestesiados continuamente usando isofluranos inhalados entre el punto de tiempo de 0 y 6 horas mostraron un aclaramiento insignificante. Del mismo modo, también es necesaria una dosis controlada de anestésico para garantizar una rápida recuperación. Al asegurar al animal al palet para obtener imágenes, el tubo fantasma utilizado para el coregistro debe mantenerse bajo en el estómago para evitar que los artefactos se superpongan con los pulmones. Del mismo modo, para garantizar una imagen CT de calidad, tener cuidado de eliminar cualquier etiqueta de metal del ratón para evitar artefactos de dispersión de rayos X.
El protocolo MCC actual se puede aplicar a innumerables modelos animales. Esta técnica tiene un efecto insignificante en la salud del animal escaneado, es bien tolerada por ratones, y debido a esto se puede utilizar con modelos de enfermedad sin poner en riesgo la salud de ratones ya delicados. La fuerza de esta metodología proviene de que se trata de una técnica in vivo, que permite la adquisición de mediciones consistentes y repetibles de la función de las vías respiratorias sin el sacrificio de animales para excitar las tráqueas para la video-microscopía, que los modelos ex vivo requieren26. La consistencia de esta técnica en la producción de mediciones repetibles a través de múltiples escaneos de los mismos animales, permite que el mismo animal sea tratado con diferentes agentes o terapias potenciales, y comparaciones estadísticas realizadas entre el mismo animal para reducir la variabilidad biológica inherente a cualquier modelo animal, reduciendo así el tamaño de la muestra necesaria para mostrar diferencias estadísticamente significativas.
La evaluación de la función de las vías respiratorias utilizando la técnica MCC se puede ajustar a una variedad de modelos animales y aplicarse a muchos modelos diferentes de salud de las vías respiratorias, así como probar nuevas terapias. Las vías respiratorias de los modelos de ratón de PCD se pueden evaluar utilizando esta técnica, así como modelos de EPOC. Nuestro método también se puede utilizar para estudiar efectos diferenciales de varios anestésicos en MCC que están en uso clínico común. Por último, los efectos de los agentes terapéuticos en las vías respiratorias también se pueden evaluar utilizando este modelo. Como se indicó anteriormente pero lleva a la repetición, ya que es una medición in vivo que permite repetir las evaluaciones de MCC en el transcurso de una enfermedad, así como los beneficios de prueba de intervenciones terapéuticas a lo largo del tiempo. Además, los ratones son los animales de laboratorio más comunes utilizados para imitar/estudiar enfermedades humanas, con, en algunos casos, múltiples modelos transgénicos de ratón de enfermedades humanas disponibles para elegir.

Los cilia son orgánulos celulares a base de microtúbulos conservados a través de la historia evolutiva, desde algas hasta humanos. Emanan de las superficies celulares y tienen una serie de funciones1,que van desde el reconocimiento de señales sensoriales ambientales locales hasta la motilidad, funciones que se pueden rastrear desde los seres humanos hasta los primeros organismos eucariotas unicelulares2,3. Cilia puede ser no motil y servir como antena especializada de una célula para procesar señales ambientales; o motil y múltiple, batiendo en ondas metachronales sincronizadas para generar flujo fluido, como en el revestimiento de las trompas de Falopio y las vías respiratorias superior e inferior, a excepción de los bronquioles terminales que conducen al alvéolo1,2.
La extensa superficie epitelial de las vías respiratorias está expuesta a un aluvión constante de contaminación en forma de una variedad de contaminantes y patógenos inhalados potencialmente peligrosos, lo que requiere una defensa. Un mecanismo de defensa clave es el aparato mucociliario del árbol traqueobronquial, donde un flujo continuo de moco secreto es transportado mecánicamente fuera de las vías respiratorias por el latido de múltiples cilios motiles que recubren las superficies apicales de las células epiteliales traqueo-bronquiales. Estos funcionan para atrapar contaminantes inhalados, y a través de su latido continuo y sincronal, transportarlos cefalad4,5.
Se ha demostrado que Cilia tiene papeles clave como en el desarrollo de patrones izquierda-derecha en el desarrollo de embriones, donde los cilios móviles en el nodo embrionario rompen la simetría6. Las mutaciones en genes relacionados con cilio se han relacionado con enfermedades como las cardiopatías congénitas (CHD) debido a la estructura asimétrica del corazón6. Estudios recientes han reportado una alta incidencia de disfunción ciciliaria en las vías respiratorias de pacientes con CHD, así como una mayor prevalencia de complicaciones respiratorias postoperatorias y síntomas crónicos de las vías respiratorias en las vías respiratorias superior e inferior7,8,9,10. Se ha demostrado que los pacientes con CHD y disfunción ciciliaria, con o sin heterotaxi, tienen un mayor riesgo de complicaciones respiratorias y resultados respiratorios negativos después de la operación5,8,10. Más allá de sus funciones en la señalización y el desarrollo, la importancia de los ciliopatías de las vías respiratorias ha demostrado la ciliopatías, de las cuales un ejemplo principal es la discinesia ciciliaria primaria (PCD). La PCD es un trastorno congénito resultante de una serie de mutaciones que afectan a los cilios respiratorios móviles, lo que conduce a infecciones pulmonares recurrentes, bronquiectasis y potencialmente la necesidad de trasplante de pulmón11. Además, a pesar de que los cilios son normales en fibrosis quística (CF), trastorno congénito más común en la población caucásica, mcc se deteriora debido a moco grueso y viscoso resultante de mutaciones en el gen CFTR12. Hay múltiples modelos de ratón de PCD y CF, así como un número cada vez mayor de modelos de CHD. En última instancia, los cilios son estructuras versátiles con muchas funciones clave, y un método para evaluar la función de los cilios respiratorios móviles in vivo puede ser valioso para el estudio preclínicos, y la evaluación de los efectos de mutaciones, así como los fármacos sobre el aclaramiento mucociliario (MCC)13. El método también sería valioso para evaluar los efectos de nuevos fármacos, terapia génica o intervenciones en MCC en estos modelos de ratón.
Hay muchos modelos diferentes que se han utilizado para evaluar MCC. Un método notable consiste en el uso de tinte azul de metileno que ha sido inculcado en el bronco, con aclaramiento medido por la medición fibrapóptica del movimiento del tinte14. Este método está limitado por la capacidad de observar el movimiento del tinte, que es más rutinario en los seres humanos que en los modelos de ratón preclínicos. Otro método notable es la imagen de rayos X de contraste de fase sincrotrón (PCXI), que se puede utilizar para rastrear partículas individuales en una vía respiratoria. Este método es relativamente nuevo y no es ampliamente accesible15. Existen numerosos métodos ex vivo para evaluar las vías respiratorias mediante la extirpación de una tráquea para la video-microscopía, sin embargo estos modelos proporcionan poca utilidad en pacientes humanos16. Las técnicas de alta resolución para imágenes ciliadas, como la tomografía por coherencia óptica, están limitadas de la misma manera17.
En este artículo, presentamos un método reproducible para medir mcc in vivo que se ha utilizado para medir los aclaramientos pulmonares en innumerables modelos animales, así como estudiar MCC en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y evaluar los efectos de los fármacos inmunosupresores18,19. Este método rastrea el aclaramiento del coloide radiofármaco de 99mtecnecio-azufre(99mTc-Sc), un radiopaso particulado insoluble, después de la instilación en los pulmones. A continuación, se puede realizar un seguimiento del radionúclido utilizando una sola tomografía computarizada por emisión de fotón (SPECT)18,20. Hemos perfeccionado aún más esta técnica para medir MCC mediante el uso de la doble modalidad SPECT y tomografía computarizada (TC) con la co-localización de los recuentos de radioisótopos a los pulmones y midiendo la disminución en estos recuentos durante 6 horas. Las imágenes de doble modalidad, con el coregistro de imágenes CT y SPECT, permiten una localización precisa de los recuentos de radiación a nuestra región de interés, los pulmones. Aunque describimos en detalle el método para la medición de MCC en ratones, el protocolo se puede ajustar para estudiar MCC en ratas. Los colimadores tendrían que ajustarse, así como la dosis de radiación. En nuestra opinión, los escáneres MCC del ratón son más difíciles técnicamente debido al pequeño tamaño animal, pero más útil que las ratas debido al gran número de modelos de ratón establecidos de una serie de trastornos humanos. Además, debido a su menor costo y costo de mantenimiento en colonias de animales, un tamaño de muestra más grande es más factible en ratones.

<table><tbody><tr><td>500 &amp;micro;m Unjacketed Fiber Optic Wire</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Vaporizer</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65/1.52p Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety Catheters 20G 1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Stand</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon dual-modality SPECT/CT</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Channel Anesthesia Stand</td><td>Summit Anesthesia Solutions</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo evaluation of mucociliary clearance in mice

Los cilios de motil respiratorio, orgánulos especializados de la célula, recubren la superficie apical de las células epiteliales que recubren las vías respiratorias. Al batir de manera metachronal y sincronal, estos orgánulos múltiples, motiles y basados en actinas generan un flujo de líquido cefalorraya que despeja las vías respiratorias de contaminantes y patógenos inhalados. Con el aumento de la contaminación ambiental, los nuevos patógenos virales y las bacterias multirresistente emergentes, el aclaramiento mucociliario generado por cilios (MCC) es esencial para mantener la salud pulmonar. Mcc también está deprimido en múltiples trastornos congénitas como disquinesia ciciliaria primaria, fibrosis quística, así como trastornos adquiridos como enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Todos estos trastornos han establecido, en algún caso múltiples, modelos de ratón. En esta publicación, detallamos un método utilizando una pequeña cantidad de radiactividad e imágenes SPECT/CT de doble modalidad para medir con precisión y reproducibilidad mcc en ratones in vivo. El método permite la recuperación de ratones después de la toma de imágenes, hacer posibles mediciones en serie y probar posibles terapias longitudinalmente a lo largo del tiempo. Los datos en ratones de tipo salvaje demuestran la reproducibilidad de la medición de MCC siempre y cuando se preste una atención adecuada al detalle, y el protocolo se cumpla estrictamente.

Usando este protocolo, anestesiamos ratones en una cámara isoflurano(Figura 1A). Después de alcanzar un nivel adecuado de anestesia, los ratones fueron colocados en soportes verticales(Figura 1B)y las cuerdas vocales fueron visualizadas usando un alambre guía iluminado (Figura 1C-1D). Los ratones fueron intubados e inculcados con 0,2 mCi 99mTc-Sc en volúmenes de 10 μL a través de una cánula y ratones autorizados a inhalar espontáneamente en los pulmones (Figura 1E-1F). Después de la adquisición y el procesamiento de imágenes, las imágenes CT y SPECT se colocaron(Figura 2A)utilizando el tubo fantasma como punto de referencia (Figura 2B). Las máscaras de los pulmones se generaron a partir de la imagen de TC(Figura 2C)y se utilizaron para dibujar ROIs alrededor del pulmón derecho para su análisis en 0 (Figura 2D) y 6 horas (Figura 2E-2F). Para probar la reproducibilidad del protocolo, un total de 8 ratones fueron escaneados dos veces en diferentes días con condiciones experimentales idénticas, con análisis utilizando una prueba t emparejada que no muestra ninguna diferencia significativa entre los escaneos repetidos (p-value=0.9904) (Figura 3A). Otros 2 ratones fueron escaneados tres veces en diferentes días con condiciones experimentales idénticas, con análisis utilizando ANOVA unidireccional que muestra coincidencia significativa entre los escaneos repetidos (valor p de 0,0041) (Figura 3B). Se escanearon un total de 8 ratones y se mostraron dos imágenes representativas(Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> Figura 1: Intubación del ratón e instilación de isótopos. Imágenes de los pasos necesarios para intubar e inculcar isótopos en las vías respiratorias. A) El ratón está anestesiado en una cámara. B) El ratón anestesiado se coloca en un soporte vertical, suspendido por los incisivos delanteros. C) Se prepara un cable de fibra óptica iluminado de 0,5 mm que sirve como cable guía ejecutándolo a través de una cánula de 20 G. D) La boca del ratón se abre con fórceps e iluminada utilizando el cable guía iluminado para visualizar las cuerdas vocales. E) La cánula se empuja a través de las cuerdas vocales y se elimina el cable guía. F) Isótopo soluble se inculca en la cánula utilizando una pipeta y el ratón permite inhalar espontáneamente el isótopo en los pulmones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> Figura 2: Imágenes SPECT/CT de una exploración MCC. A) Una imagen SPECT que ha sido co-localizada con una imagen de TC. B) Una imagen de TC con un tubo fantasma visible que se utilizó para la coincolo localización. C) Una máscara de las vías respiratorias derivada de binarizar la imagen ct y realizar una proyección de suma de pila z. D) La máscara ct co-localizada con la imagen SPECT. Se ha dibujado un ROI para su análisis alrededor del pulmón derecho. E) Una máscara de las vías respiratorias a las 6 horas. F) Una imagen co-localizada ct y SPECT de las vías respiratorias a las 6 horas con un ROI para su análisis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> Figura 3: Mediciones de espacio libre de los mismos ratones a través de múltiples escaneos. A) Se midieron dos aclaramientos de repetición individuales para 8 ratones sin cambios en las condiciones experimentales. Una prueba de t emparejada mostró que no había ninguna diferencia significativa entre los escaneos repetidos con un valor p de 0,9904. B) Se midieron tres aclaramientos de repetición individuales para dos ratones sin cambios en las condiciones experimentales. Un ANOVA unidireccional mostró que había coincidencia significativa entre los escaneos repetidos con un valor p de 0,0041. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> Figura 4: Imágenes espect/CT co-localizadas de las vías respiratorias de 0 y 6 horas en 2 ratones con ROIs dibujadas a las 0 y 6 horas esbozando el pulmón derecho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria 1: Un vídeo de las cuerdas vocales iluminadas por un cable de fibra óptica con el efecto de la respiración visualizada. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Archivos suplementarios. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar estos archivos.</a>

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In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

En esta publicación, describimos protocolos para evaluar el aclaramiento mucociliario de las vías respiratorias (MCC) en ratones in vivo utilizando imágenes de radionúclidos de doble modalidad. Este protocolo está diseñado para un único protocolo de adquisición de tomografía computarizada por emisión de fotones (SPECT) y tomografía computarizada (TC) utilizando colimadores de cuerpo entero del ratón (MWB) en un sistema SPECT/CT dual.

Evaluación in vivo del aclaramiento mucociliario en ratones

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

4.3K vistas.  University of Pittsburgh School of Medicine. En esta publicación, describimos protocolos para evaluar el aclaramiento mucociliario de las vías respiratorias (MCC) en ratones in vivo utilizando imágenes de radionúclidos de doble modalidad. Este protocolo está diseñado para un único protocolo de adquisición de tomografía computarizada por emisión de fotones (SPECT) y tomografía computarizada (TC) utilizando colimadores de cuerpo entero del ratón (MWB) en un sistema SPECT/CT dual.

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Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, with the prevalence increasing.2 As with other diseases, animal models of allergic airway disease greatly facilitate understanding of the underlying pathophysiology, help identify potential therapeutic targets, and allow preclinical testing of possible new therapies. Models of allergic airway disease have been developed in several animal species, but murine models are particularly attractive due to the low cost, ready availability, and well-characterized immune systems of these animals.3 Availability of a variety of transgenic strains further increases the attractiveness of these models.4 Here we describe two murine models of allergic airway disease, both employing ovalbumin as the antigen. Following initial sensitization by intraperitoneal injection, one model delivers the antigen challenge by nebulization, the other by intratracheal delivery. These two models offer complementary advantages, with each mimicking the major features of human asthma.5
The major features of acute asthma include an exaggerated airway response to stimuli such as methacholine (airway hyperresponsiveness; AHR) and eosinophil-rich airway inflammation. These are also prominent effects of allergen challenge in our murine models,5,6 and we describe techniques for measuring them and thus evaluating the effects of experimental manipulation. Specifically, we describe both invasive7 and non-invasive8 techniques for measuring airway hyperresponsiveness as well as methods for assessing infiltration of inflammatory cells into the airways and the lung. Airway inflammatory cells are collected by bronchoalveolar lavage while lung histopathology is used to assess markers of inflammation throughout the organ. These techniques provide powerful tools for studying asthma in ways that would not be possible in humans.

Experimental mouse models of allergic asthma offer new possibilities for studying disease pathogenesis and developing new therapeutics. These models are well suited to measuring factors governing the allergic immune response, airway inflammation, and pulmonary pathophysiology.

Modelo murino de asma inducida por alergenos

Asthma is a major cause of morbidity and mortality, affecting some 300 million people throughout the world.1 More than 8% of the US population has asthma, ...

Investigación

Inmunología e Infección

Endotracheal Intubation in Mice via Direct Laryngoscopy Using an Otoscope

Mice, both wildtype and transgenic, are the principal mammalian model in biomedical research currently. Intubation and mechanical ventilation are necessary for whole animal experiments that require surgery under deep anesthesia or measurements of lung function. Tracheostomy has been the standard for intubating the airway in these mice to allow mechanical ventilation. Orotracheal intubation has been reported but has not been successfully used in many studies because of the substantial technical difficulty or a requirement for highly specialized and expensive equipment. Here we report a technique of direct laryngoscopy using an otoscope fitted with a 2.0 mm speculum and using a 20 G&#160;intravenous catheter as an endotracheal tube. We have used this technique extensively and reliably to intubate and conduct accurate assessments of lung function in mice. This technique has proven safe, with essentially no animal loss in experienced hands. Moreover, this technique can be used for repeated studies of mice in chronic models.

Endotracheal Intubation in Mice via Direct Laryngoscopy Using an Otoscope

We have developed a simple, reliable, and relatively inexpensive method for endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope with a 2.0 mm speculum. This technique is atraumatic and can be used for repeated measurements in chronic experiments. We find it superior to tracheostomy or previously reported nonsurgical techniques.

Intubación endotraqueal en ratones<em&gt; Vía</em&gt; La laringoscopia directa utilizando un otoscopio

Mice, both wildtype and transgenic, are the principal mammalian model in biomedical research currently. Intubation and mechanical ventilation are ...

Medicina

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

La utilización de la orofaringe Intratraqueal PAMP Administración y lavado broncoalveolar para evaluar el anfitrión respuesta inmune en ratones

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

A reversible, método no invasivo para las mediciones de resistencia de las vías y Toma de Muestras Líquido del Lavado broncoalveolar en ratones

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Biología

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique

The forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational tool permitting the experimental assessment of lung function in mice in a comprehensive, detailed, precise and reproducible manner. It provides measurements of respiratory system mechanics through the analysis of pressure and volume signals acquired in reaction to predefined, small amplitude, oscillatory airflow waveforms, which are typically applied at the subject's airway opening. The present protocol details the steps required to adequately execute forced oscillation measurements in mice using a computer-controlled piston ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). The description is divided into four parts: preparatory steps, mechanical ventilation, lung function measurements, and data analysis. It also includes details of how to assess airway responsiveness to inhaled methacholine in anesthetized mice, a common application of this technique which also extends to other outcomes and various lung pathologies. Measurements obtained in na&iuml;ve mice as well as from an oxidative-stress driven model of airway damage are presented to illustrate how this tool can contribute to a better characterization and understanding of studied physiological changes or disease models as well as to applications in new research areas.

The present protocol provides a detailed step-by-step description of the procedures required to execute measurements of respiratory system mechanics as well as the assessment of airway responsiveness to inhaled methacholine in mice using the forced oscillation technique (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada).

Evaluación de la mecánica del sistema respiratorio en ratones utilizando la técnica de oscilación forzada

The  forced oscillation technique (FOT) is a powerful, integrative and translational  tool permitting the experimental assessment of lung function in mice ...

Assessment of Respiratory Function in Conscious Mice by Double-chamber Plethysmography

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to non-invasively assess some features of the respiratory function in humans as well as in laboratory animals. The present article focuses on the application of the double-chamber plethysmography (DCP) in small animals. It provides background information on the methodology as well as a detailed step-by-step procedure to successfully assess respiratory function in conscious, spontaneously breathing animals in a non-invasive manner. The DCP can be used to monitor the respiratory function of multiple animals in parallel, as well as to identify changes induced by aerosolized substances over a chosen time period and in a repeated manner. Experiments on control and allergic mice are used herein to demonstrate the utility of the technique, explain the associated outcome parameters, as well as to discuss the related advantages and shortcomings. Overall, the DCP provides valid and theoretically sound readouts that can be trusted to evaluate the respiratory function of conscious small animals both at baseline and after challenges with aerosolized substances.

The objective of the present article is to provide a detailed description of the recommended procedures to evaluate respiratory function in conscious mice by double-chamber plethysmography.

Evaluación de la función respiratoria en ratones conscientes por Pletismografía de doble cámara

Air volume changes created by a conscious subject breathing spontaneously within a body box are at the basis of plethysmography, a technique used to ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

Método ex vivo de Imágenes de Alta Resolución de Motilidad Cilia en roedores las vías respiratorias epitelio

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful in cases of attenuated, oligo- or mono-symptomatic forms of CF usually diagnosed later in life, and of CF-related disorders such as congenital bilateral absence of vas deferens, idiopathic chronic pancreatitis, allergic bronchopulmonary aspergillosis, and bronchiectasis. In both clinical and preclinical settings, the test has been used as a biomarker to quantify responses to targeted therapeutic strategies for CF. Adapting the test to a mouse is challenging and can entail an associated mortality. This paper describes the adequate depth of anesthesia required to maintain a nasal catheter in situ for continuous perfusion. It lists measures to avoid broncho-aspiration of solutions perfused in the nose. It also describes the animal care at the end of the test, including administration of a combination of antidotes of the anesthetic drugs, leading to rapidly reversing the anesthesia with full recovery of the animals. Representative data obtained from a CF and a wild-type mouse show that the test discriminates between CF and non-CF. Altogether, the protocol described here allows reliable measurements of the functional status of trans-epithelial chloride and sodium transporters in spontaneously breathing mice, as well as multiple tests in the same animal while reducing test-related mortality.

Here, we present a protocol to measure nasal potential difference in mice. The test quantifies the function of transmembrane ion transporters such as the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and the epithelial sodium channel. It is valuable to evaluate the efficacy of novel therapies for cystic fibrosis.

Diferencia de potencial nasal para cuantificar el transporte de iones Trans epitelial en ratones

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

Evaluación in vivo del aclaramiento mucociliario en ratones

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