Nuestra investigación se centra en la utilización de las propiedades únicas de los hidrogeles granulares para investigar el movimiento celular y las funciones para la regeneración de tejidos. Es importante modelar la respuesta celular al microambiente para comprender las implicaciones del impacto traslacional. A medida que aumenta el uso de andamios de puertos 3D, también lo hace la necesidad de ensayos completos de migración 3D que reproduzcan mejor el comportamiento de las células en un entorno de cicatrización de heridas.
Hemos desarrollado dos líneas que son tridimensionales, desde el desarrollo del andamio hasta la obtención de imágenes y el análisis, para investigar el movimiento y la migración celular in vitro. Con estos dos nuevos ensayos, hemos adquirido la capacidad de rastrear las células que responden en dos etapas distintas de la cicatrización de heridas: la infiltración inicial del andamio del tejido a granel y el movimiento de las células una vez rodeadas por un andamio complejo. Para empezar, coloque 120.000 células de fibroblastos dérmicos humanos por centímetro cuadrado en al menos seis pocillos de una placa de 96 pocillos.
Después de la incubación durante la noche, retire los medios de los pocillos celulares con un aspirador o una pipeta. Agregue el tinte en 20 microlitros de cada condición de gel a los pocillos usando una pipeta de desplazamiento positivo. Usando un accesorio de centrífuga de rotor giratorio de placa configurado a 25 grados centígrados, gire la placa a 100 g durante 15 segundos con aceleración y desaceleración configuradas en 8 para aplanar el gel.
Voltee la placa 180 grados y vuelva a girar para asegurar una distribución uniforme del gel en el fondo del pozo. Para la fotoreticulación aséptica del gel, aplique luz focalizada a 365 nanómetros durante 30 segundos para recocer el andamio. Después de formar todos los andamios, agregue 200 microlitros de medio a cada pocillo e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
Utilice un microscopio confocal para obtener imágenes de las células y capturar su comportamiento de migración. Para el análisis de imágenes, abra el software de conversión de imágenes Imaris para conversiones por lotes. Arrastre y suelte las imágenes de microscopía en el software de conversión y seleccione una carpeta dentro del ámbito del software para importar los archivos.
Seleccione cada archivo individualmente para establecer el tamaño del vóxel. Presione Iniciar todo para comenzar la conversión. A continuación, en el software Imaris Arena, seleccione una imagen de la arena para comenzar a procesarla.
Haga clic en la pestaña Image Pros en la barra de herramientas principal. Ahora, haz clic en el menú desplegable del Canal 1 y selecciona Resta de fondo. Pulse OK para volver a la vista 3D.
En la barra de herramientas pequeña, haga clic en el icono con formas azules redondeadas con la etiqueta Agregar nuevas superficies para crear una pestaña de objetos editables denominada Superficies 1. Genere manualmente los parámetros de todas las réplicas con el botón de flecha azul. Establezca el detalle de la superficie en 0,7 micrómetros y seleccione Resta de fondo, Contraste local.
Introduzca la longitud media de la celda en el diámetro de la esfera más grande, que cabe en el cuadro del objeto. Para el umbral, determine el histograma de intensidad para segmentar solo las celdas más brillantes. Habilite Dividir objetos táctiles, Región creciente y defina el diámetro de los puntos de inicialización para que coincida con el diámetro utilizado anteriormente.
Para guardar los parámetros de creación para el análisis por lotes, haga clic en el icono de la varita con la etiqueta Creación. Haga clic en almacenar parámetros para lote, asigne un nombre al archivo y haga clic en Aceptar. Para reunir todas las alturas de celda, haga clic en la pestaña Detallado. Seleccione valores específicos y, a continuación, Posición Z en los menús desplegables.
Haga clic en el icono Guardar para exportar todas las posiciones y clasificaciones Z a un archivo XLS. Para comenzar, vierta PBS en una placa de Petri debajo de la cubierta laminar y pipetee gotas de 20 microlitros de la solución de medios celulares en la tapa invertida de la placa de Petri. Vuelva a colocar la tapa en el plato e incube la placa para obtener esferoides 3D cultivados con gotas colgantes.
Para configurar el PLOSMA, utilice una pipeta de desplazamiento positivo para añadir asépticamente 15 microlitros del gel a los pocillos de una placa transparente de 96 pocillos. Con un accesorio de centrífuga de rotor giratorio de placas, gire la placa a 1.000 g durante 10 segundos para aplanar el gel. Voltee el plato 180 grados y vuelva a girar para asegurar una distribución uniforme del gel.
A continuación, aplique luz focalizada a 365 nanómetros durante 30 segundos para recocer el andamio y fotoreticularmente el gel desde la parte superior. Mueva asépticamente la placa de Petri de gotas colgantes en la campana de cultivo de tejidos e invierta la tapa. Con una pipeta de 20 microlitros, aspire lentamente una gota hasta que el esferoide entre en la punta de la pipeta y expulse la gota sobre el andamio en el centro del pocillo.
Incube la placa del pocillo a 37 grados centígrados durante dos horas para permitir que los esferoides se adhieran al andamio. Después de la incubación, pipetee 15 microlitros adicionales de gel encima de cada esferoide. Centrifugar la placa a 300 g durante 15 segundos en cada dirección para garantizar una distribución uniforme del gel.
Recocido: la capa superior de gel para usar luz ultravioleta, como se demostró anteriormente. Coloque la placa bajo un microscopio confocal y obtenga imágenes de los esferoides después de seleccionar los planos Z más bajos y más altos. Después de importar las imágenes al software Imaris Arena, haz clic en el menú desplegable del Canal 1 y selecciona Sustracción de fondo.
Presione OK en la parte inferior del panel. En la vista 3D, pulse Ajustar automáticamente todos los canales en la ventana emergente Ajuste de pantalla y realice las correcciones necesarias. En la barra de herramientas más pequeña, haga clic en el icono Agregar nuevo marco de referencia para crear una pestaña con la etiqueta Marco de referencia 1.
Mueva el origen al centro del esferoide en los tres planos. En la misma barra de herramientas, haga clic en el icono con esferas naranjas para agregar nuevos puntos, creando una pestaña llamada Puntos 1, y presione el botón de flecha azul para continuar. Para el umbral, ajuste el histograma de intensidad para segmentar solo las partes más brillantes.
Utilice la segmentación para navegar por la pila de imágenes y obtener precisión. Presione la flecha azul Siguiente tres veces. Desmarque Renderizar en segmentación o haga clic en el icono cuadrado amarillo en el panel de configuración.
Haga clic en la pestaña Estadísticas. En los menús desplegables, seleccione valores específicos y distancia desde el marco de referencia de origen. Haga clic en el icono Guardar.
Para guardar todos los cambios y análisis, haga clic en el icono Guardar de la barra de herramientas principal. Este método se utilizó para evaluar la infiltración celular en una interfaz tisular. La posición mediana en el eje Z de las células migratorias aumentó significativamente de cero a 24 horas, lo que indica un notable movimiento vertical de las células.
El cambio de pliegue en la migración celular a lo largo del eje Z se duplicó después de 24 horas. Las células sembradas mediante el método PLOSMA demostraron una propagación y migración significativas desde el núcleo esferoide después de 24 horas. Las representaciones tridimensionales mostraron una amplia dispersión de células en el andamio PLOSMA después de 24 horas, con proyecciones visibles que se extendían hacia afuera.
Las imágenes 3D procesadas utilizando la función Spots revelaron posiciones de células dispersas en el andamio, lo que indica una migración generalizada. Las células viajaron una distancia promedio de más de 200 micrómetros con resultados consistentes en todas las muestras. El cambio de plegamiento de la altura Z de las células en el andamio PLOSMA fue de aproximadamente 4, lo que indica un movimiento ascendente sustancial.
