Nuestro trabajo se centra en el desarrollo y uso de la metodología de moléculas individuales para estudiar la dinámica en sistemas biológicos complejos. En particular, estamos interesados en aprender cómo se comportan las ADN polimerasas al encontrar obstáculos, en este caso, G-cuádruples. Hemos desarrollado un método de una sola molécula basado en la visualización de fluorescencia que nos permite ver el comportamiento de las ADN polimerasas individuales al encontrar un G-cuádruple.
Con nuestro ensayo, hemos identificado una vía de intercambio previamente no caracterizada para la ADN polimerasa delta al golpear G-cuádruples, en la que la polimerasa se caerá y una nueva se volverá a unir. Con nuestro protocolo desarrollado, finalmente hemos respondido a la pregunta de: ¿Cómo se comportan las diferentes ADN polimerasas cuando se encuentran con un G-cuádruple, ya que podemos ver en tiempo real cómo cambia la cinética y la mecánica con el tiempo? Para comenzar, retire un cubreobjetos funcionalizado de una aspiradora y colóquelo en un estante de microtubos parcialmente lleno de agua para crear un ambiente húmedo.
Pipetear 100 microlitros de un tampón de bloqueo en un tubo, luego agregar 25 microlitros de solución de NeutrAvidin y mezclar bien. Extienda la solución sobre la superficie del cubreobjetos y déjela incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente en la caja húmeda. A continuación, lave el cubreobjetos con agua y luego séquelo con gas nitrógeno.
Coloque un bloque de polidimetilsiloxano hecho a medida en el cubreobjetos dentro de un soporte de celda de flujo. Inserte tubos de polietileno en los orificios de la celda de flujo. Ahora, caliente alícuotas de un mililitro de tampón de bloqueo Tween, 500 microlitros de tampón de lavado y tampón de replicación a 40 grados Celsius durante 15 minutos para liberar gases de las soluciones.
Desgasifique las soluciones en una cámara de vacío durante 15 minutos adicionales a 800 milibares por debajo de la presión atmosférica. Aplica una gota de aceite sobre el objetivo. Tome una celda de flujo construida y colóquela en la platina del microscopio.
A continuación, eleve el objetivo para encontrarse con el cubreobjetos. Inserte el tubo de entrada en el tampón de bloqueo Tween desgasificado y conecte la salida a la bomba de jeringa. A continuación, tire de la jeringa para extraer el tampón de bloqueo Tween a través del tubo hasta el canal.
Fluya 200 microlitros de tampón de lavado desgasificado en el canal a una velocidad de 100 microlitros por minuto para eliminar el tampón de bloqueo Tween. Ahora, diluya las soluciones de plantilla de ADN a 0,5 picomolar en 500 microlitros de tampón de replicación. Deje que 150 microlitros de la solución fluyan hacia el canal a una velocidad de 10 microlitros por minuto.
Ilumine la muestra con un láser de 647 nanómetros a aproximadamente 900 milivatios por centímetro cuadrado en el plano de la muestra para visualizar plantillas de ADN individuales. Una vez que se vea una densidad suficiente de manchas, fluya en una solución nueva de tampón de replicación para lavar el exceso de ADN. Muévase a un nuevo campo de visión y capture una imagen del ADN para determinar el grado de colocalización entre la polimerasa marcada y el sustrato de ADN.
Una vez completado, aumente la potencia del láser para fotoblanquear las manchas restantes. A continuación, prepare una solución de polimerasa que contenga ditiotreitol, dNTP y una sonda fluorescente en el tampón de replicación. Fluya en 100 microlitros de la solución de polimerasa a una velocidad de cinco microlitros por minuto en el canal.
Una vez que la muestra esté enfocada y se haya ajustado el ángulo total de fluorescencia de reflexión interna, ajuste la potencia del láser de 647 nanómetros a aproximadamente 900 milivatios por centímetro cuadrado en el plano de la muestra. Comience a obtener imágenes del campo de visión durante el período de tiempo deseado. La secuencia G-cuádruple bloqueó la síntesis de la polimerasa delta como lo indica la presencia de una banda de 60 nucleótidos en el gel de página, mientras que el sustrato de control sin el G-cuádruple produjo una banda de 100 nucleótidos.
La microscopía de fluorescencia de una sola molécula confirmó que la polimerasa delta tenía un tiempo de permanencia más corto de seis más o menos dos segundos en el sustrato G-cuádruple, en comparación con el sustrato de control, que tenía un tiempo de permanencia de 11 más o menos tres segundos. El número de eventos de unión a la polimerasa delta fue significativamente mayor en el sustrato G-cuádruple en comparación con el control, lo que sugiere múltiples ciclos de unión y desunión debido al bloqueo de la síntesis.
