Il nostro lavoro si concentra sullo sviluppo e l'uso di metodologie a singola molecola per studiare la dinamica in sistemi biologici complessi. In particolare, siamo interessati a capire come si comportano le DNA polimerasi quando incontrano ostacoli, in questo caso, i G-quadruplex. Abbiamo sviluppato un metodo a singola molecola basato sulla visualizzazione della fluorescenza che ci consente di vedere il comportamento delle singole DNA polimerasi dopo l'incontro con un G-quadruplex.
Con il nostro saggio, abbiamo identificato una via di scambio precedentemente non caratterizzata per la DNA polimerasi delta dopo aver colpito G-quadruplex, in cui la polimerasi cadrà e una nuova si rilegherà. Con il nostro protocollo sviluppato, abbiamo finalmente risposto alla domanda: Come si comportano le diverse DNA polimerasi quando incontrano un G-quadruplex, poiché possiamo vedere in tempo reale come la cinetica e la meccanica cambiano nel tempo? Per iniziare, rimuovere un vetrino coprioggetto funzionante da un aspirapolvere e posizionarlo su una griglia per microprovette parzialmente riempita d'acqua per creare un ambiente umido.
Pipettare 100 microlitri di un tampone bloccante in una provetta, quindi aggiungere 25 microlitri di soluzione di NeutrAvidin e mescolare bene. Stendere la soluzione sulla superficie del vetrino coprioggetti e lasciarlo incubare per 15 minuti a temperatura ambiente nella scatola umida. Quindi, lavare il vetrino coprioggetti con acqua, quindi asciugarlo con azoto gassoso.
Posizionare un blocco di polidimetilsilossano su misura sul vetrino coprioggetto all'interno di un supporto per cella a flusso. Inserire i tubi in polietilene nei fori della cella di flusso. Ora, scaldare un millilitro di aliquote di tampone bloccante Tween, 500 microlitri di tampone di lavaggio e tampone di replicazione a 40 gradi Celsius per 15 minuti per liberare i gas dalle soluzioni.
Degassare le soluzioni in una camera a vuoto per altri 15 minuti a 800 millibar al di sotto della pressione atmosferica. Applicare una goccia di olio sull'obiettivo. Prendi una cella a flusso costruita e posizionala sul tavolino del microscopio.
Quindi, sollevare l'obiettivo per soddisfare il vetrino coprioggetto. Inserire il tubo di ingresso nel tampone di blocco Tween degassato e collegare l'uscita alla pompa a siringa. Quindi, tirare indietro la siringa per aspirare il tampone di blocco Tween attraverso il tubo nel canale.
Versare 200 microlitri di tampone di lavaggio degasato nel canale a una velocità di 100 microlitri al minuto per eliminare il tampone di blocco Tween. Ora, diluire le soluzioni del DNA stampo a 0,5 picomolari in 500 microlitri di tampone di replicazione. Lasciare fluire 150 microlitri di soluzione nel canale a una velocità di 10 microlitri al minuto.
Illuminare il campione utilizzando un laser a 647 nanometri a circa 900 milliwatt per centimetro quadrato sul piano del campione per visualizzare i singoli modelli di DNA. Una volta che è visibile una densità sufficiente di macchie, far fluire una nuova soluzione di tampone di replicazione per eliminare il DNA in eccesso. Passa a un nuovo campo visivo e cattura un'immagine del DNA per determinare il grado di colocalizzazione tra la polimerasi marcata e il substrato del DNA.
Una volta completato, aumentare la potenza del laser per sbiancare le macchie rimanenti. Successivamente, preparare una soluzione di polimerasi contenente ditiotreitolo, dNTP e una sonda fluorescente nel tampone di replicazione. Fluire nel canale 100 microlitri della soluzione di polimerasi a una velocità di cinque microlitri al minuto.
Una volta che il campione è a fuoco e l'angolo di fluorescenza della riflessione interna totale è stato regolato, impostare la potenza del laser a 647 nanometri a circa 900 milliwatt per centimetro quadrato sul piano del campione. Iniziare l'imaging del campo visivo per il periodo di tempo desiderato. La sequenza G-quadruplex ha bloccato la sintesi della polimerasi delta come indicato dalla presenza di una banda di 60 nucleotidi nel gel di pagina, mentre il substrato di controllo senza il G-quadruplex ha prodotto una banda di 100 nucleotidi.
La microscopia a fluorescenza a singola molecola ha confermato che la polimerasi delta aveva un tempo di permanenza più breve di sei più o meno due secondi sul substrato G-quadruplex, rispetto al substrato di controllo, che aveva un tempo di permanenza di 11 più o meno tre secondi. Il numero di eventi di legame della polimerasi delta era significativamente più alto sul substrato G-quadruplex rispetto al controllo, suggerendo cicli multipli di legame e dislegame a causa del blocco della sintesi.
