עבודתנו מתמקדת בפיתוח ושימוש במתודולוגיה של מולקולה בודדת לחקר דינמיקה במערכות ביולוגיות מורכבות. בפרט, אנו מעוניינים ללמוד כיצד מתנהגים פולימראזות DNA כאשר נתקלים במחסומים, במקרה זה, G-quadruplexes. פיתחנו שיטת מולקולה בודדת המבוססת על הדמיה פלואורסצנטית המאפשרת לנו לראות את ההתנהגות של פולימראזות DNA בודדות כאשר אנו נתקלים ב-G-quadruplex.
בבדיקה שלנו, זיהינו מסלול חילופין שלא אופיין בעבר לדלתא של DNA פולימראז עם פגיעה ב-G-quadruplexes, שבו הפולימראז ייפול ואחד חדש ייקשר מחדש. עם פיתוח הפרוטוקול שלנו, סוף סוף ענינו על השאלה: כיצד מתנהגים פולימראזות DNA שונות כאשר הן נתקלות ב-G-quadruplex, כפי שאנו יכולים לראות בזמן אמת כיצד הקינטיקה והמכניקה משתנות עם הזמן? כדי להתחיל, הסר החלקת כיסוי פונקציונלית מוואקום והנח אותה על מתלה מיקרו צינור מלא חלקית במים כדי ליצור סביבה לחה.
פיפטה 100 מיקרוליטר של מאגר חוסם לתוך צינור, ואז הוסף תמיסת NeutrAvidin של 25 מיקרוליטר וערבב היטב. מורחים את התמיסה על פני החלקת הכיסוי ומניחים לה לדגור למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בקופסה הלחה. לאחר מכן, שטפו את החלקת הכיסוי במים, ואז יבשו אותה באמצעות גז חנקן.
הנח בלוק פולידימתילסילוקסן בהתאמה אישית על החלקת הכיסוי בתוך מחזיק תא זרימה. הכנס צינורות פוליאתילן לחורים בתא הזרימה. כעת, מחממים מינון של מיליליטר אחד של מאגר חסימת טווין, 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה ומאגר שכפול ל-40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לשחרר גזים מהתמיסות.
יש לפרק את התמיסות בתא ואקום למשך 15 דקות נוספות בטמפרטורה של 800 מיליבר מתחת ללחץ האטמוספרי. מרחו טיפת שמן על המטרה. קח תא זרימה בנוי והנח אותו על במת המיקרוסקופ.
לאחר מכן, הרם את המטרה כדי לעמוד בתלוש הכיסוי. הכנס את צינור הכניסה למאגר חסימת Tween נטול הגז וחבר את השקע למשאבת המזרק. לאחר מכן, משוך לאחור את המזרק כדי למשוך את מאגר חסימת הטווין דרך הצינור לתוך התעלה.
הזרם 200 מיקרוליטר של מאגר שטיפה נטול גז לתוך התעלה בקצב של 100 מיקרוליטר לדקה כדי לשטוף את מאגר החסימה של טווין. כעת, יש לדלל את תמיסות תבנית ה-DNA ל-0.5 פיקומולר ב-500 מיקרוליטר של מאגר שכפול. תן ל -150 מיקרוליטר מהתמיסה לזרום לתעלה בקצב של 10 מיקרוליטר לדקה.
האירו את הדגימה באמצעות לייזר של 647 ננומטר בכ-900 מילי-וואט לסנטימטר רבוע במישור הדגימה כדי להמחיש תבניות DNA בודדות. ברגע שצפיפות מספקת של כתמים נראית לעין, זרמו בתמיסה טרייה של מאגר שכפול כדי לשטוף עודפי DNA. עבור לשדה ראייה חדש וצלם תמונה של ה-DNA כדי לקבוע את מידת הקו-לוקליזציה בין הפולימראז המסומן למצע ה-DNA.
לאחר השלמתו, הגדל את עוצמת הלייזר כדי להלבין את הכתמים הנותרים. לאחר מכן, הכינו תמיסת פולימראז המכילה דיתיותרייטול, dNTPs ובדיקה פלואורסצנטית במאגר השכפול. זרימה של 100 מיקרוליטר מתמיסת הפולימראז בקצב של חמישה מיקרוליטר לדקה לתעלה.
לאחר שהדגימה נמצאת במיקוד וזווית הקרינה הכוללת של ההשתקפות הפנימית הותאמה, הגדר את עוצמת הלייזר של 647 ננומטר לכ-900 מילי-וואט לסנטימטר רבוע במישור הדגימה. התחל לדמות את שדה הראייה למשך הזמן הרצוי. רצף ה-G-quadruplex חסם את סינתזת הדלתא של פולימראז כפי שמצוין על ידי נוכחות של פס 60 נוקלאוטידים בג'ל הדף, בעוד שמצע הבקרה ללא ה-G-quadruplex ייצר פס של 100 נוקלאוטידים.
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת אישרה כי לדלתא פולימראז היה זמן שהייה קצר יותר של שש פלוס מינוס שתי שניות על מצע ה-G-quadruplex, בהשוואה למצע הבקרה, שהיה לו זמן שהייה של 11 פלוס מינוס שלוש שניות. מספר אירועי הקישור של דלתא פולימראז היה גבוה משמעותית על מצע ה-G-quadruplex בהשוואה לביקורת, מה שמרמז על מחזורי קשירה וביטול קשירה מרובים עקב חסימת הסינתזה.
