Purification et visualisation de la grippe A complexes ribonucléoprotéiques virale

Résumé

Le génome du virus de la grippe A se compose de huit complexes séparés d'ARN et de protéines, appelées complexes ribonucléoprotéiques virale (vRNPs). Ce document décrit la purification sur gradient de glycérol et de visualisation microscopie électronique en transmission de la grippe A vRNPs.

Résumé

La grippe A génome viral est constitué de huit sens négatif, simple brin des molécules d'ARN, emballés individuellement avec des copies multiples de la grippe A nucléoprotéine (NP) en particules virales ribonulceoprotein (vRNPs). Le vRNPs la grippe sont enfermés dans l'enveloppe virale. Lors de l'entrée des cellules, cependant, ces complexes sont vRNP libéré dans le cytoplasme, où ils accéder à la machinerie de transport hôte nucléaire. Afin d'étudier l'import nucléaire de la grippe et le vRNPs la réplication du génome de la grippe, il est utile de travailler avec vRNPs isolés de telle sorte que les autres composantes du virus ne pas interférer avec ces processus. Ici, nous décrivons une procédure de purifier ces vRNPs du virus influenza A. La procédure débute par la perturbation de la grippe A virion avec des détergents afin de libérer les complexes vRNP du virion enveloppé. Le vRNPs sont ensuite séparées des autres composants de la grippe A virion sur un gradient discontinu de glycérol 33-70% par sédimentation de vitesse. Les fractions obtenues à partir du gradient de glycérol sont ensuite analysées via SDS-PAGE après coloration au bleu de Coomassie. Les fractions de pic contenant du NP sont ensuite rassemblées et concentrées par centrifugation. Après la concentration, l'intégrité de la vRNPs est vérifiée par la visualisation de la vRNPs par microscopie électronique à transmission après coloration négative. La purification sur gradient de glycérol est une modification de celle du Kemler

Protocole

Partie 1: La perturbation de la grippe A Virion

1. Ajouter 750 pi de tampon de MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5) dans un tube à centrifuger Beckman polycarbonate (11 mm x 34 mm), conçu pour s'intégrer dans un rotor TLA-120.2 pour une utilisation dans un Optima Beckman Max-E ultracentrifugation.
2. Ajouter 500 ul de la grippe A (H3N2 X-31 A/AICHI/68 souche; 2 mg / ml) dans ce tube. Mélanger le virus avec le tampon de MNT par pipetage de haut en bas plusieurs fois.
3. Centrifuger pendant 10 minutes à 109 000 xg, 4 ° C, dans un Beckman Optima Max-E centrifugeuse à l'aide d'un rotor TLA-120.2.
4. Enlever le surnageant et resuspendre le culot dans 500 ul de tampon perturbations (100 mM de KCl, 5 mM MgCl _2, 5% (p / v) de glycérol, 50 mM octylglucoside, 10 mg / ml lysolécithine, 1,5 mM de dithiothréitol, 100 mM MES, pH 5,5).
5. Vortex vigoureusement, puis agiter à 31 ° C pendant 20 minutes dans une thermomixer Eppendorf.

Partie 2: Dégradé glycérol Velocity culot de centrifugation

1. Préparer un gradient de glycérol en plaçant les montants suivants de la glycérine dans un tube à centrifuger Beckman UltraClear (13 mm x 51 mm): 1 ml à 70% (v / v) de glycérol, 0,75 ml de glycérol 50%, 0,375 ml de glycérol 40%, et 1,8 ml de glycérol 33%. Des solutions de glycérol sont fabriqués en mélangeant glycérine pure avec un tampon de NM (150 mM NaCl, 50 mM MES, pH 5,5). Également préparer un tube d'équilibrage contenant à la fois le glycérol et tampon.
2. Vortex, le perturbé l'échantillon viral à nouveau, et le charger sur le gradient de glycérol.
3. Centrifuger le gradient de 3,75 heures à 217 000 xg, 4 ° C, dans un Beckman MLS-50-balancer Rotor.
4. Après la centrifugation est terminée, collecter manuellement 250 aliquotes du gradient à partir du haut du tube. Gardez fractions sur la glace ou à 4 ° C.

Partie 3: Analyse des fractions du gradient de glycérol par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS

1. Retirer 20 ul de chaque fraction dans un nouveau tube.
2. Ajouter 5 ul de tampon d'échantillon 5x SDS-PAGE.
3. Chauffer à 95 ° C pendant 5 minutes.
4. Isoler les échantillons brièvement et les charger sur un gel de polyacrylamide 10%, et inclure des marqueurs de poids moléculaire dans un des puits.
5. Exécuter les échantillons sur le gel jusqu'à ce que le colorant de chargement bleu de bromophénol atteigne près du fond du gel.
6. Tache le gel au bleu de Coomassie.

Partie 4: concentration des fractions vRNP

1. Choisissez les fractions de glycérol contenant principalement des NP, les combiner, et les distribuer dans des tubes de centrifugeuse Beckman deux polycarbonate (11 mm x 34 mm).
2. Remplir chaque tube avec diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-traité l'eau ultra-pure, et une pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger.
3. Centrifuger pendant 4,5 heures à 157 000 xg, 4 ° C, dans un Beckman TLA-120.2 du rotor.
4. Enlever le surnageant et resuspendre le culot dans 50 ul d'eau traitée au DEPC.
5. Si désiré, le ₂₈₀ A du vRNPs concentrée peut être mesurée. Comme NP est le composant présent dans la majeure fractions regroupées, une estimation de la molarité de NP peut être calculée à l'aide de son coefficient d'extinction de 55 350 M ^-1 cm ^-1 (tel que déterminé par le biais ProtParam ^3).
6. Aliquoter l'vRNPs purifiée, et les stocker à -80 ° C pour une utilisation ultérieure.

Partie 5: coloration négative de vRNPs

1. Diluez 1 pl de purifier vRNP en 9 pl d'fraîchement faite et filtrés-deux tampons MNT (20 mM MES, 150 mM NaCl, 30 mM Tris, pH 7,5). D'autres tampons sont également OK pour diluer le vRNPs et pour laver la grille échantillon (étape 5.5), mais ne pas utiliser du PBS, si l'acétate d'uranyle est utilisé pour la coloration négative.
2. Décharge luminescente un spécimen (TEM de cuivre) de grille préalablement revêtu d'une pellicule de carbone et de parlodion pendant 30 secondes.
3. Tenez la grille spécimens fraîchement déchargé brillent avec des pincettes, et d'appliquer une baisse de 5 pl d'vRNP diluée sur la grille spécimen.
4. Laisser la goutte d'échantillon sur la grille pendant 8 minutes.
5. En attendant, placer une petite bande de Parafilm sur le banc, et se dispenser 2 gouttes contenant 10 ul de tampon à chaque MNT (pour laver la grille), et une baisse de 80 pl de la solution de coloration fraîchement préparée (1 molybdate d'ammonium ou 1% acétate d'uranyle%) sur le Parafilm.
6. Après les 8 minutes d'adsorption, la mèche une partie de la solution échantillon de la grille de spécimen avec un morceau de papier filtre (coupés en triangles). Ne laissez pas la grille de spécimen à sec.
7. Laver la grille spécimen dans 2 gouttes contenant 10 ul de tampon à chaque MNT pour un temps total de 1 minute. Cela se fait en abaissant attentivement la grille d'échantillon sur la chute, puis évacuant une partie de la solution échantillon de la grille de spécimen avec un morceau de papier filtre (sans laisser la grille échantillon sec).
8. Immédiatement après l'évacuation hors de la dernière goutte de tampon de la grille spécimen, completLy plonger la grille échantillon dans la gouttelette tache et attendre 1 minute.
9. Complètement hors mèche de la solution aux taches de la grille de spécimen avec un morceau de papier filtre.
10. Autoriser la grille spécimen sécher à l'air pendant plusieurs minutes avant l'observation au microscope électronique à transmission.

Partie 6: Résultats du représentant:

Figure 1

Comme la grippe A NP (~ 56 kDa) est la principale protéine dans les complexes de ribonucléoprotéines virales, la bande NP est généralement la plus forte bande dans les fractions contenant le vRNPs (figure 1). En plus de NP, chaque vRNP la grippe contient également une copie d'une polymérase ARN trimérique (poids moléculaire kDa 82, 86 et 86,5) complexes. Ceux-ci peuvent ou peuvent ne pas être visible par coloration au bleu de Coomassie parce que leur abondance est faible comparée à celle de NP. Les polymérases, cependant, peuvent être détectés si, au lieu d'un bleu Commassie tache, une coloration à l'argent du gel est effectué. La protéine de la matrice de la grippe M1 (~ 28 kDa) devrait être minimalement présents dans les fractions où les fractions NP pic de protéine sont présents.

Figure 2

VRNPs négativement colorées comme visualisées sous un microscope électronique à transmission devrait donner vRNPs qui ressemblent à des particules en forme de tige, de longueur variable qui sont environ 30 nm à 120 nm de longueur (Figure 2a). Le NP oligomérique est organisé comme une chaîne de molécules de NP qui est encore plié dans une structure hélicoïdale à double répétition, des boucles ainsi de suite deux extrémités de ces particules en forme de tige peut parfois être vu (Figure 2b).

Discussion

La purification de vRNPs est basé sur la procédure décrite par Kemler et al. (1994). ¹ Nous et les autres ont également utilisé ce protocole pour isoler vRNPs d'étudier leur import nucléaire. ^2,4,5

Nous recommandons l'utilisation de la RNase conseils et des tubes lors de la manipulation vRNPs parce que le génome viral est constitué d'ARN, et se dégrade donc facilement dans la présence d'ARN. En outre, tous les tampons devraient être ...

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
H3N2 X-31 A/AICHI/68 influenza A		Charles River Laboratories	490715
Tris		Sigma	T1503
MES		Sigma	M-8250
Glycerol		Fisher	G33-1
Octylglucoside		Sigma	O-8001
Lysolecithin		Sigma	L-4129
Dithiothreitol		Sigma	D-9779
Coomassie brilliant blue G-250		Kodak	1367796
diethyl pyrocarbonate (DEPC)-treated water		Invitrogen	750024
Uranyl Acetate		Ted Pella	19481
Ammonium Molybdate		Fisher	A-674
Optima MAX-E Ultracentrifuge		Beckman Coulter	434491
MLS-50 Rotor Package, Swinging Bucket		Beckman Coulter	367280
TLA-120.2 Rotor Assembly, Fixed-Angle, Titanium		Beckman Coulter	362046
Eppendorf Thermomixer		Brinkman	022670000