Isolement des ribosomes Traduire Contenant Peptidyl-ARNt pour des analyses fonctionnelles et structurelles

Résumé

Un obstacle majeur à des analyses biochimiques des ribosomes contenant naissante peptidyl-ARNt a été la présence de ribosomes d'autres dans les mêmes échantillons, les ribosomes pas impliqué dans la traduction de la séquence d'ARNm spécifiques en cours d'analyse. Nous avons développé une méthodologie simple pour purifier, en exclusivité, les ribosomes contenant la naissante peptidyl-ARNt d'intérêt.

Résumé

Récemment, des études structurales et biochimiques ont détaillé plusieurs des événements moléculaires qui se produisent dans le ribosome pendant l'inhibition de la synthèse protéique par les antibiotiques et lors de la synthèse polypeptidique naissante. Certains de ces antibiotiques et réglementaires polypeptides naissants principalement sous la forme du peptidyl-ARNt, inhibent la formation soit liaison peptidique ou ^1-7 terminaison de la traduction. Ces événements peuvent inhibitrices arrêter le mouvement du ribosome, un phénomène appelé «l'arrestation de translation". Traduction d'arrestation soit induite par un antibiotique ou un polypeptide naissant a été montré pour réguler l'expression de gènes impliqués dans diverses fonctions cellulaires telles que la croissance cellulaire, la résistance aux antibiotiques, la translocation des protéines et ^8-13 métabolisme cellulaire. La connaissance de la façon dont les antibiotiques et réglementaires polypeptides naissants altérer la fonction des ribosomes est essentiel si nous voulons comprendre le rôle complet du ribosome dans la traduction, dans chaque organisme.

Ici, nous décrivons une méthodologie simple qui peut être utilisé pour purifier, exclusivement, pour l'analyse, ces ribosomes traduisant un ARN messager spécifique et contenant une peptidyl-ARNt spécifiques ^14. Cette procédure est basée sur l'isolement sélectif des ribosomes traduisant lié à un ARNm marqué à la biotine. Ces complexes de translation sont séparés de ribosomes d'autres dans le même mélange, en utilisant des billes paramagnétiques de streptavidine (SMB) et un champ magnétique (CM). ARNm marqué à la biotine sont synthétisés par des analyses de transcription du ruissellement à l'aide de fragments de matrices d'ADN généré par PCR qui contiennent des promoteurs T7 transcriptionnelle. T7 RNA polymérase incorpore biotine-16-UMP de biotine-UTP, dans nos conditions dizaine biotine-16-UMP molécules sont incorporées dans un ARNm NT 600 avec une teneur de 25% UMP. Ces marqué à la biotine ARNm sont ensuite isolés et utilisés dans des essais de traduction in vitro réalisée avec 2 facteur de libération (RF2) appauvri extraits acellulaires obtenus à partir de souches d'Escherichia coli de type sauvage ou contenant des ribosomes mutant. Les ribosomes traduisant l'marqué à la biotine sont des séquences d'ARNm a décroché à la région codon d'arrêt, en raison de l'absence de la protéine RF2, qui accomplit normalement terminaison de la traduction. Bloqués contenant les ribosomes nouvellement synthétisées peptidyl-ARNt sont isolés et retirés de la réactions de traduction en utilisant SMB et un MF. Ces perles ne se lient à la biotine contenant des messages.

Les isolés, des complexes de translation, peut être utilisé pour analyser les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de type sauvage ou mutante composants du ribosome, ou peptidyl-ARNt séquences, ainsi que la détermination de l'interaction du ribosome avec des antibiotiques ou d'autres facteurs moléculaires ^1,14-16. Pour examiner la fonction de ces complexes isolés ribosome, peptidyl-transférase dosages peuvent être effectués en présence de l'antibiotique puromycine ^1. Pour étudier les changements structurels dans les complexes de translation, des procédures bien établies peuvent être utilisées, telles que i) à la réticulation des acides aminés spécifiques ¹⁴ et / ou ii) la protection des dosages d'alkylation ^1,14,17.

Protocole

1. Cellule Préparation Extrait gratuit.

1. Deux grammes d'un Escherichia coli sèche culot bactérien obtenu à partir de la mi-log cultures en phase sont lavés, deux fois, avec un demi litre de tampon A contenant 10 mM Tris-acétate, pH 8,0, acétate de magnésium 14 mM, 60 mM d'acétate de potassium et 50 mg / phenylmethanesulphonylfluoride ml (PMSF) par centrifugation à 5000 xg pendant 5 min à 4 ° C. Après le lavage, le culot bactérien est resuspendu dans 40 ml de tampon A.
2. Les cellules bactériennes sont perturbés en utilisant une presse française, en appliquant une pression 6000 psi. Cette pression correspond à 600 unités à l'aide d'un piston d'un pouce. La suspension est perturbé recueilli dans un tube de verre propre (50 ml).
3. La suspension est traitée perturbé avec 1 mM dithiotréitol (TNT) et est centrifugé à 30000 xg pendant 30 min. La procédure de centrifugation est répétée, en utilisant le surnageant résultant. Le surnageant final est dispensée (1 ml) dans des microtubes. Enfin, les aliquotes sont congelés en utilisant une glace sèche-éthanol ou de l'azote liquide, et sont stockés à -60 ° C ou -80 ° C.

2. Préparation des extraits cellulaires gratuit appauvri des RF2.

1. 4,5 ml de billes de protéine A sépharose 4B boue sont mélangés avec 5 ml d'un anti-sérum anti-RF2 utilisant une roue tournant à température ambiante, pendant une heure. Le mélange est centrifugé à 2500 xg pour séparer les perles de l'antisérum. Après élimination du surnageant, ces billes contenant des anticorps anti-RF2 (anti-RF2 perles) sont lavés tard par resuspension dans 1 ml de tampon B contenant 35 mM Tris-acétate pH 7,8, 10 mM d'acétate de magnésium, l'acétate d'ammonium 30 mM, 60 mM de glutamate de potassium et de 5 ug / mL d'inhibiteur de la protéinase leupeptine. Les perles anti-RF2 sont ensuite séparés de tampon B par centrifugation en utilisant les mêmes conditions indiquées ci-dessus. La procédure de lavage est répété deux fois.
2. Un ml de l'extrait acellulaire est mélangé avec 150 pi d'anti-RF2 perles en utilisant une roue en rotation, à 4 ° C, pendant deux heures. Le mélange est centrifugé à 10000 xg pour séparer l'extrait acellulaire à partir des perles. Le surnageant est enlevé et traité de nouveau avec une autre uL 150 de l'anti-RF2 perles. Cette procédure est répétée une fois de plus avec la solution d'extrait acellulaire résultant. La solution extrait final sans cellule est dispensé (100 pi) dans des microtubes. Les aliquotes sont congelés en utilisant une glace sèche-éthanol ou de l'azote liquide, et sont stockés à -60 ° C ou -80 ° C.

3. Préparation d'une matrice d'ADN.

1. Préparer un 1 mL réaction PCR en mélangeant 600 femtomoles du modèle plasmide contenant les séquences à traduire (Fig 1), avec 0,4 nanomoles de chacun des oligodésoxynucléotides indiqué dans la figure 1, 0,2 micromoles de chaque dNTP et 50 U de Taq- polymérase de l'ADN dans le tampon fourni par Stratagene Co. Effectuer la réaction d'amplification dans les conditions suivantes: 94 ° C pendant 2 min, (94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 1 min; pour 30 cycles) et 72 ° C pendant 12 min.
2. Purifier le PCR-produits en précipitant l'ADN en ajoutant 1 / 10 volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2, et 2 volumes d'éthanol glacé. Répétez la procédure de précipitation une fois de plus. Resuspendre l'ADN dans 100 ul de diéthyl-pyrocarbonate (DEPC) eau traitée.
   Typiquement, cette procédure donne 100 ug d'un produit 600 pb d'ADN.
3. Vérifier l'intégrité des produits de PCR par électrophorèse sur gels d'agarose.

4. Préparation de l'ARNm marqué à la biotine.

1. Préparer un uL 100 réaction de transcription in vitro dans l'eau traitée au DEPC en mélangeant 5 ug du fragment d'ADN généré par PCR avec 0,5 micromoles de l'ATP, CTP, GTP, 0,3 micromoles de l'UTP, 50 nanomoles de biotine-16-UTP, et 10 pl de mélange de l'enzyme T7 dans le tampon fourni par Promega Co. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 3 heures.
   Pour quantifier la quantité d'ARNm obtenue, la matrice d'ADN devraient être éliminées en ajoutant sans RNase DNase. Incuber la réaction à 37 ° C pendant 10 min.
2. Purifier les produits ARNm en précipitant l'ARN en ajoutant 1 / 10 volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2, et 2 volumes d'éthanol froid. Répétez la procédure de précipitation une fois de plus. Resuspendre l'ARNm dans 100 ul d'eau traitée au DEPC.
   Habituellement, cette procédure entre rendements 1-2 mg d'une biotine 600 NT étiqueté produit ARNm.
3. Vérifier l'intégrité des produits de la biotine ARNm marqué par électrophorèse sur gels d'agarose.

5. Isolement des ribosomes Traduire Contenant une peptidyl-ARNt.

1. Préparer 500 ul d'un mélange de réaction in vitro de traduction dans l'eau traitée au DEPC en mélangeant 10 à 15 mg de biotine marqué avec 75 nanomoles ARNm de chacune des dix-neuf acides aminés, tous sauf l'acide aminé qui sera remplacé par un acide aminé radioactif , 50 uCi d'un acide aminé radioactif (37MBq), et 20-5 0 ul de RF2 appauvri extrait acellulaire, dans un mélange réactionnel contenant 40 mM tampon Tris-acétate, pH 8,0, 10 mM d'acétate de magnésium, 175 mM d'acétate de potassium, acétate d'ammonium 10 mM, 2 mM de DTT, 2 mM ATP, 0,5 mM GTP, 30 mM phosphoénolpyruvate (PEP), 0,3 pyruvate kinase U / ml (PK), le polyéthylène glycol 8000 3,5%, 1 mM spermidine, 20 ug / ml d'acide folinique, et 250 pg / ml d'ARNt de E. coli. Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 10 minutes.
   L'ordre d'addition des composants de la réaction est très important. L'extrait exempt de cellules doit être mélangé d'abord avec la solution tampon contenant les acides aminés et le mélange final incubé pendant 5 min à température ambiante pour permettre l'activation des ribosomes. Plus tard, l'ARNm marqué à la biotine sont ajoutées. Pour les analyses structurelles utilisant les procédures de modification chimique, l'ajout d'un acide aminé radioactif n'est pas nécessaire.
2. Ajouter au mélange réactionnel de traduction - 3 mL de billes paramagnétiques de streptavidine (SMB) en suspension dans le tampon C contenant 35 mM Tris-acétate, pH 8,0, 10 mM d'acétate de magnésium, 175 mM d'acétate de potassium, acétate d'ammonium 10 mM et DTT 1 mM. Incuber la nouvelle suspension à température ambiante pendant 10 min.
3. Séparez les PME à partir du mélange en appliquant un champ magnétique (CM) en utilisant stands séparation magnétique.
4. Reprendre le SMB dans le tampon C et séparer les perles à nouveau en utilisant la MF. Répétez cette procédure de lavage deux fois. Resuspendre les perles dans 500 uL de tampon C, stocker la suspension sur la glace, et suivez la procédure suivante immédiatement.

6. Analyse des ribosomes isolé contenant le peptidyl-ARNt.

Pour peptidyl-ARNt

1. Mélanger 10 uL de la SMB (en suspension dans le tampon C) avec 10 ul d'un tampon de chargement contenant 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% (v / v) de glycérol, le sulfate de sodium à 4% de dodécyle, 2 mM de DTT et 0,2 mg / ml de bleu de bromophénol. Résoudre les composants attachés aux billes en exécutant les échantillons dans 10% des gels de polyacrylamide Tris-tricine.
2. Sécher les gels d'utiliser un aspirateur de gel-cheveux.
3. Vérifier l'intégrité et la purification du peptidyl-ARNt en exposant le gel séché à un film radiographique.

Pour l'ARN ribosomal

4. Ajouter 190 uL de 2 mM d'éthylènediaminetétraacétate (EDTA) solution préparée avec de l'eau traitée par DEPC, et 200 ul de phénol équilibré avec de l'eau, à 10 ul d'une suspension de billes. Mélanger la suspension par vortex vigoureux et séparer la phase minérale de la phase organique par centrifugation à 10000 xg pendant 3 min à température ambiante. Recueillir la couche d'eau supérieure dans un microtube de nouvelles.
5. Précipiter l'ARN à partir de la couche d'eau en ajoutant 1 / 10 volume d'acétate de sodium 3 M, pH 5,2, 1 pl de 20 mg / mL de la solution de glycogène, et 2 volumes d'éthanol glacé. Resuspendre l'ARN dans 10 ul de DEPC eau traitée.
6. Vérifier l'intégrité de l'ARN ribosomal par électrophorèse sur gels d'agarose.
   Habituellement, 50 pl de suspension de billes de rendements 1 pg d'ARN ribosomal.

7. Les résultats représentatifs:

La figure 2 présente les résultats d'une série d'analyses de l'évaluation de la qualité et la fonctionnalité des ribosomes traduisant isolé en utilisant la procédure décrite. L'observation d'une bande unique résolus dans des gels de polyacrylamide indique la présence de polypeptides liés à l'ARNm marqué à la biotine attachée à la SMB (figure 2A). La purification de l'ARN ribosomal utilisant cette procédure établit la présence de ribosomes liés à ces ARNm marqué à la biotine, ainsi (figure 2B). Ajout de la puromycine, un antibiotique qui induit l'activité peptidyl-transférase du ribosome, se traduit par le clivage de la naissante peptidyl-ARNt ^1. Ceci est observé comme un changement dans le modèle de migration du polypeptide isolé dans des gels de polyacrylamide (figure 2C). Ensemble, ces données indiquent que les ARNm marqué à la biotine attachée à la SMB contiennent des ribosomes fonctionnels avec peptidyl-ARNt.

L'isolement des ribosomes traduisant contenant spécifiques peptidyl-ARNt permet l'étude des effets de la peptidyl-ARNt, les antibiotiques et autres molécules, sur la fonction du ribosome (figure 3A), et sur la structure du ribosome (figure 3B). Dans les exemples présentés ici le sparsomycin antibiotiques et l'acide aminé tryptophane (Trp) inhibent le clivage hydrolytique de la naissante CCNT-ARNt peptidyl-ARNt induite par RF2 dans les ribosomes isolés (figure 3A). L'interaction de sparsomycin ou Trp avec le ribosome induit aussi des changements structurels dans certains nucléotides qui constituent l'ARNr 23S du ribosome traduisant (figure 3B). En résumé, le matériel biologique obtenu en utilisant la procédure décrite ici sont utiles dans l'obtention de compréhension supplémentaire des contacts structuraux impliqués dans l'inhibition de la fonction du ribosome lors de son interaction avec divers facteurs moléculaires.

ove_content ">
Figure 1. Procédure utilisée pour produire et purifier les ribosomes traduisant contenant peptidyl-ARNt. Fragments d'ADN ca. 650 pb de longueur, contenant le gène CCNT et sa région adjacente, montré dans la figure, sont utilisés comme modèles dans la préparation des ARNm contenant la biotine, [(bio) UMP] ARNm. Ces fragments d'ADN sont produites par des procédures de PCR en utilisant les oligodéoxynucléotides indiqué en haut de la figure. Les lettres soulignées marquer l'emplacement du promoteur T7 encodés dans l'amorce nucléotidique. Les caractères gras indiquent la séquence de Shine-Dalgarno qui est utilisé dans la traduction de l'ARNm séquences CCNT. Le promoteur T7 dans le fragment d'ADN est reconnue par l'ARN polymérase T7 qui est utilisé pour transcrire (flèche) de la séquence et la CCNT aval séquence non codante. La transcription est terminée lorsque l'ARN polymerase atteigne l'extrémité 3 'du fragment d'ADN, après les séquences de terminaison rpoBC (rpoBC "t"). La structure en tige-boucle du terminateur rpoBC protège l'ARNm de la 3'-5 'activité présente exoribonucléase dans les extraits cellulaires sans utilisé dans les réactions de traduction in vitro. Les isolés [(bio) UMP] ARNm sont utilisés pour générer impasse, les ribosomes traduisant, par des essais de traduction in vitro. La séquence de la CCNT [(bio) UMP] ARNm est traduit par un ribosome qui cale lors du dernier acide aminé est incorporé, en raison de l'absence du facteur de presse (RF2) du mélange réactionnel. Le ribosome [(bio) UMP] complexes ARNm sont isolés du mélange réactionnel total à l'aide de streptavidine magnétique perles (SMB) qui lient les nucléotides marqués à la biotine incorporée dans l'ARNm. Les PME liés au ribosome-[(bio) UMP] complexes ARNm sont extraits du mélange réactionnel total en utilisant un champ magnétique (CM).

Figure 2. Analyses structurales et fonctionnelles des complexes isolés. A) Dans les réactions de traduction in vitro ont été effectués avec [(bio) UMP] ARNm dans laquelle le codon d'initiation du gène de la CCNT a été remplacé par un codon stop. Les produits finaux ont été isolés en utilisant des billes de streptavidine, comme cela est indiqué dans la figure 1. Produits de réaction et des molécules isolées ont ensuite été analysés par électrophorèse sur gels de polyacrylamide. La CCNT-ARNt et des bandes CCNT peptides sont marqués. B) L'ARN total a été isolé à partir des complexes au point mort en utilisant des procédures d'extraction phénol. Chaque ARN isolé a été résolu par électrophorèse en gels d'agarose. ARN ribosomal (ARNr) sont indiqués. C) des complexes isolés contenant CCNT-ARNt ont été incubées avec (+) ou sans (-) 0,02 mM puromycine (Puro) à température ambiante pendant 10 min. Le peptide CCNT étaient étiquetés en cours de traduction en utilisant [35S]-méthionine (A) ou de [3H]-proline (B).

Figure 3. Analyses structurales et fonctionnelles des ribosomes contenant CCNT-ARNt qui sont liés à l'sparsomycin antibiotiques, ou l'acide aminé tryptophane. A) des complexes isolés contenant CCNT-ARNt ont été incubées avec (+) ou sans (-) sparsomycin (Spar) ou tryptophane (Trp) à température ambiante pendant 5 min. Plus tard, les mélanges ont été mélangés avec RF2 et incubées à 37 ° C pendant 20 min. B) Analyse des changements dans la méthylation de l'ARNr 23S induite par molécules de liaison au sein du ribosome. Complexes isolés ont été pré-incubées avec (+) ou sans (-) 2 mM Trp ou Spar pendant 5 min à 37 ° C. Puis, un agent d'alkylation, le sulfate de diméthyle a été ajouté et le mélange incubé à température ambiante pendant 20 minutes supplémentaires. L'ARN total a été extrait et des dosages d'extension d'amorces ont été effectuées avec un [32P] marquée oligodésoxynucléotide complémentaires aux nucléotides de l'ARNr 23S qui sont espacées de 100 nucléotides en aval du nucléotide modifié. Les produits finaux des essais de vulgarisation ont été résolus par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les nucléotides ARNr 23S affectée par la présence de Trp ou Spar sont indiqués.

Discussion

Cette procédure d'isolement décrites dans ce rapport est hautement reproductible. Malheureusement, la présence de courts peptidyl-ARNt produite à partir des séquences mêmes ne peuvent pas être traduits facilement évités; tels peptidyl-ARNt peut correspondre à 15-20% du total des matières isolées (figure 2C). Ces contaminants peuvent augmenter la concentration lors des concentrations plus élevées d'ARNm marqué à la biotine ont été utilisées ou lorsque les extraits acellulaires utilisés sont vieux ou ont été ré-utilisé plusieurs fois. Par conséquent, il est très important de contrôler la qualité et la concentration des composants de la traduction in vitro dans les réactions. Alternativement, une grande efficacité commerciale reconstitué extraits acellulaires sont disponibles qui peuvent être utilisés aux mêmes fins (système PUR) ^18.

En utilisant cette méthode, la biotine-16-UMP est incorporé au hasard le long de l'ARNm cible. Il ya une possibilité que certains ORF contenant tracts uridine peuvent avoir intégré cette nucléotide modifié dans leurs séquences, affectant leur traduction. Variable concentrations relatives des biotin-16-UTP/UTP doivent être testées lors de la synthèse de l'ARNm en vue d'obtenir la traduction la plus efficace. D'autres méthodes de marquage à la biotine peut être utilisé, en ciblant l'extrémité 5 ', l'extrémité la plus stable de l'ARNm. (I) La biotine peut être attaché à l'extrémité 5 'de l'ARNm en utilisant 3'-NH2ATP (3'-amino, 3'-désoxyadénosine triphosphate) et l'ARN ligase T4 ^19. (Ii) 5'-end marqué à la biotine oligonucléotide peut être attaché à l'extrémité 5 'de l'ARNm en utilisant l'ARN ligase T4 ainsi ^20. (Iii) l'extrémité 3 'marqué à la biotine oligodésoxynucléotides qui correspondent à la séquence complémentaire à l'extrémité 5' de l'ARNm peut aussi être utilisé pour isoler les complexes de traduction. Ces oligodésoxynucléotides biotine pourrait être attachée à la SMB avant l'isolement. Plus tard, le SMB attaché à la marqué à la biotine oligodésoxynucléotides pourrait être mélangé avec le mélange de réaction de traduction pour permettre une interaction avec leurs séquences d'ARNm complémentaires. Après isolement, l'hybride ARN-ADN région - et la région d'hybridation entre les oligodésoxynucléotide marqué à la biotine et la séquence d'ARNm - pourrait être dégradée en utilisant la RNAse H, qui sépare les complexes calé à partir des billes de streptavidine. Cette méthode peut permettre à des complexes d'être employée dans de futures analyses structurelles utilisant les méthodes de résolution plus élevée.

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris base		Sigma	252859
Magnesium acetate		Fluka	63049
Potassium glutamate		Sigma	G1501
Ammonium acetate		Fluka	09688
PMSF		Sigma	P7626
Protein A sepharose 4B slurry beads		Sigma	P9424
Leupeptin inhibitor		Sigma	L9783
Taq-DNA polymerase		Stratagene	201223
T7 Maxiprep kit		Promega	P1300
SMB		Promega	Z5482
Biotin-16-UTP		Roche	1388908
ATP		Sigma	A7699
GTP		Sigma	G8877
PEP		Sigma	P7002
PK		Sigma	P7768
Polyethylenglycol 8000		Fluka	81268
Folinic acid		Fluka	47612
Spermidine		Fluka	85558
tRNA from E. coli		Sigma	R1753
DEPC		Sigma	D5758
Tricine		Sigma	T5816
L-amino acids		Sigma	LAA21
DTT		Fluka	43815
magnetic separation stands		Promega	Z5342