Isolement primaire microglies de cultures mixtes de cellules gliales de tissus de cerveau de rat nouveau-né

Résumé

Isoler les microglies primaire à partir de l'hétérogénéité cellulaire du cerveau est essentielle pour enquêter sur leur rôle dans les deux conditions physiologiques et pathologiques. Ce protocole décrit une isolation mécanique et technique mixte de culture cellulaire qui fournit un rendement élevé et de haute pureté, viables primaires pour les cellules microgliales In vitro Étude et les applications en aval.

Résumé

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity ^1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection ³. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop ^4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.

Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.

The principle and protocol of this methodology have been described in the literature ^7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described ^9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia ¹². However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture ^9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.

It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Protocole

1. Dissection des tissus de cerveau de rat nouveau-né

1. Refroidissement Leibovitz L-15 milieux conditionnés (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) à 4 ° C. Milieux de culture chaudes (DMEM + 10% de FBS + 1% de pénicilline / streptomycine) à 37 ° C. Préparer 4 60x15 mm boîtes de Pétri avec 4-5 ml de L-15 climatisées médias sur la glace. Stériliser tous les instruments chirurgicaux avec de l'éthanol 100%.
2. Rincer les chiots nouveau-nés P2 rap avec de l'éthanol 70%. (Ratons nouveau-nés âgés de P1 à P5 peut être utilisé dans ce protocole.)
3. Rapidement décapiter un raton avec des ciseaux bien aiguisés stériles et déposer la tête immédiatement dans l'éthanol à 70%. Répétez l'opération pour un total de 5 ratons ensuite transférer la tête dans une solution saline.
4. Retirez les cerveaux entiers de la tête et les placer dans une boîte de Pétri avec 4 - 5 ml solution L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + 1% Pen / Strep) sur la glace.
5. Répéter les procédures 1.2 - 1.4 pour les chiots qui restent dans la litière.
6. Retirez les méninges du cerveau et de transférer le destissu cérébral IRED (c.-à-cortex, le cervelet, le cerveau entier, etc) dans un nouveau plat de Pétri avec 4-5 ml de solution de L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% de BSA + Pen 1% / Strep) sur la glace.

2. Préparation de la population de cellules gliales mixte

1. Sans endommager le tissu cérébral avec des ciseaux ou une lame, transférer le tissu avec une pipette de 10 ml à 50 ml une stérile tube conique.
2. Centrifuger conique à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C.
3. Aspirer le surnageant. Ajouter 4-5 ml de frais L-15 médias (Leibowitz L-15 + 0,1% + 1% BSA Pen / Strep).
4. Introduire à la pipette des tissus de haut en bas 10 fois avec une pipette stérile de 10 ml.
5. Placer un tamis cellulaire (100 pores um) sur un nouveau tube de 50 ml conique. Tissus pipette de haut en bas une fois avec une solution stérile de pipette 5 ml et que la pipette au ras de la crépine cellule, distribuer le matériau à travers la crépine cellule dans le tube conique.
6. Rincer la crépine cellule avec 4-5 ml de frais L-15 médias (Leibowitz L-15 + 0,1% BSUn stylo + 1% / Strep).
7. Centrifuger conique avec des cellules tendues à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C.

3. Placage et d'entretien des cultures mixtes de cellules gliales

1. Pour chaque cerveau de rat nouveau-nés traités, préparer 1 T-75 stériles flacon en ajoutant 12 ml de milieux de culture (DMEM + 10% de FBS + 1% de pénicilline / streptomycine) dans chaque flacon.
2. Aspirer le surnageant des cellules granulées et ajouter 5-6 ml de milieux de culture pour le culot cellulaire. Introduire à la pipette de haut en bas 10 fois avec une pipette de 10 ml.
3. Transférer un volume égal de suspension cellulaire dans chaque fiole T-75.
4. Incuber fioles dans un 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C pour un total de 1-3 semaines.
5. Flacons devrait d'abord être incubées pendant 5 jours, et le cinquième jour, remplacer les milieux de culture dans chaque flacon avec 12 ml de milieu frais et retourner à l'incubateur. Puis, tous les 3 jours, remplacer les milieux conditionnés dans chaque flacon avec 12 ml de milieu frais pour atteindre la confluence. Ce doit être le fairene très attentivement sans toucher le fond des flacons où les cellules se fixent.

4. Isolement et Revêtement de l'enseignement primaire microglies

1. Après mixtes cultures gliales sont complètement confluentes, retirez flacons de l'incubateur et les caches flacon avec du parafilm pour éviter les échanges gazeux avec l'air ambiant.
2. Agiter flacons à 100 RPS (Companion Lab SI-600, JEIO Tech) pendant 1 heure à 37 ° C.
3. Recueillir les médias de tous les flacons avec une pipette de 10 ml, sans perturber la couche d'astrocytes à la surface ballon. Placez le support dans des tubes de 50 ml coniques. Ajouter des milieux frais aux flacons et bouteilles de retour à l'incubateur.
4. Centrifuger les tubes coniques à 2500 RCF pendant 5 min à 4 ° C.
5. Aspirer surnageant de tous les tubes coniques. Les culots cellulaires sont élevés cellules de la microglie de pureté. Pellets Remettre en suspension dans 1 ml de placage microglie médias (DMEM + FES 10% + 1% de pénicilline / streptomycine).
6. Comptez la densité cellulaire dans les médias remises en suspension à l'aideun hémocytomètre.
7. Ajouter un volume approprié de géloses microglies pour atteindre un 2 x 10E5 cellules par ml de densité. Plate comme il convient pour l'analyse expérimentale.
8. Autoriser les microglies pour attacher la nuit.

5. Les résultats représentatifs

Le protocole décrit ci-dessus les résultats dans les cultures primaires de haute pureté microglie. Comme déterminé par immunohistochimie pour un marqueur cellulaire de macrophages / microglies spécifique (Iba1), plaqués cultures microglies sont> à 90% (figure 2). En outre, la coloration des marqueurs de cellules astrocytes, oligodendrocytes et des neurones spécifiques démontre une contamination minimale (figure 2). Après avoir établi mixtes cultures de cellules gliales, la microglie peut être isolé en secouant jusqu'à 4 fois successives. L'isolement initial microglie donnera environ 2,2 x 106 cellules / ml ou environ 9 millions de cellules par 10 flacons et le rendement attendu diminue à chaque sha successifske. La microglie isolés par cette méthode ont été utilisées avec succès pour étudier la capacité de phagocytose, la fonction, comme la production d'oxyde nitrique, et la toxicité neuronale (Figure 3) ^13-14.

Figure 1. Vue d'ensemble du protocole de préparation de cultures mixtes de cellules gliales et l'isolement de la microglie primaire.

Figure 2. Isolement de la microglie de haute pureté tel que vérifié par une analyse immunohistochimique utilisant la microglie (Iba-1, rouge), des astrocytes (GFAP, vert), neurone (NeuN, rouge) et des oligodendrocytes (CC1, rouge) des marqueurs spécifiques. La coloration de l'ADN des cellules en culture par DAPI (en bleu) est également indiquée.

Figure 3. Microglie isolés dans la descri méthodelit ont été utilisées dans un certain nombre de tests, y compris, mais sans s'y limiter, les dosages, les dosages de la fonction de phagocytose et des études de neurotoxicité. Dans ces études, nous avons constaté que la microglie (Iba-1 positive, vert), lorsqu'ils sont exposés à contrôler (A) ou LPS (B) des médias traités, augmenter leur phagocytose de billes de latex marquées par fluorescence (rouge), qui peuvent être quantifiées ( C). En outre, le LPS (1ng/ml) le traitement peut augmenter la production d'oxyde nitrique dans la microglie (D). Enfin, via à la fois transwell insert-séparés ou directs microglie-neurones cultures, nous avons constaté que les microglies incubées avec LPS peuvent induire la mort des cellules neuronales, telle que mesurée par la lactate déshydrogénase (LDH) de libération (E, F).

Discussion

Alors que ce protocole est régulièrement utilisé pour produire la microglie pur et sain pour les expériences de recherche, un examen attentif des aspects techniques au cours de parties critiques de la procédure permettra de minimiser la variabilité dans la microglie isolée. Tout d'abord, lors de la dissection du tissu cérébral de rats nouveau-nés petits, travaillant en temps opportun est nécessaire pour minimiser les dommages hypoxiques et ischémiques du tissu. Cependant, il est également important d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Le numéro de catalogue	Commentaires
60 mm x 15 mm boîtes de Pétri	Fisher marque	0875713A
De Sharp ciseaux de dissection	Outils belle science	14094-11
Dumont # 7b pince standard des conseils, des courbes, 11cm	Outils belle science	11270-20
Dumont # 5 pince standard des conseils, des droites, 11 cm	Outils belle science	11251-10
Tubes de 50 ml à centrifuger coniques	VWR	89039-656
5 pipettes sérologiques ml	Grenier Bio One	606180
10 pipettes sérologiques ml	Grenier Bio One	607180
100 um crépine stérile cellule de nylon	Faucon	35-2360
75 cm 2 flacons de culture tissulaire	Corning	430641
Dulbecco milieu essentiel minimal (DMEM)	Gibco (Invitrogen)	31053-028
Leibovitz milieu L-15	Gibco (Invitrogen)	11415064
Sérum de veau fœtal	Gibco (Invitrogen)	16000-036
Fœtale sérum équin	Pêcheur	SH3007402
La pénicilline-streptomycine	Gibco (Invitrogen)	15140163
L'éthanol à 100%	La Société Warner Graham	64-17-5
Phosphate solution saline tamponnée, 10X, pH 7,4	Qualité biologique, inc.	119-069-131	1X dans l'eau distillée stérile
Sacs de Biohazard	VWR	14220-028
Hémocytomètre	Hausser scientifique	1492
Des plaques 6 puits culture cellulaire avec une surface CellBIND	Corning	3335