Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Résumé

Nous décrivons une méthode de super-résolution d'imagerie pour sonder l'organisation structurelle de la FtsZ torique bactérienne, un appareil essentiel pour la division cellulaire. Cette méthode est basée sur des analyses quantitatives de photoactivées localisation de microscopie (PALM) images et peut être appliquée à d'autres protéines du cytosquelette bactérien.

Résumé

La division cellulaire bactérienne nécessite l'assemblage coordonné de plus de dix protéines essentielles à midcell ^1,2. Au cœur de ce processus est la formation d'une superstructure en forme d'anneau (O-ring) par la protéine FtsZ au plan de ^3,4 division. Le Z-ring se compose de plusieurs protofilaments FtsZ simple brin, et de comprendre l'agencement des protofilaments à l'intérieur de l'O-ring donnera un aperçu du mécanisme de Z-anneau de montage et de sa fonction en tant que générateur de ^5,6 vigueur. Cette information est resté inaccessible en raison des limites actuelles de la microscopie par fluorescence et par microscopie électronique conventionnelle. Microscopie à fluorescence conventionnelle est incapable de fournir une image à haute résolution de l'O-ring en raison de la limite de diffraction de la lumière (~ 200 nm). Electron cryotomographic imagerie a détecté dispersés dans les petites protofilaments FtsZ C. cellules crescentus ^7, mais est difficile à appliquer à des cellules plus grandes telles queE. coli ou B. subtilis. Nous décrivons ici l'application d'une méthode de super-résolution microscopie à fluorescence, microscopie Localisation photoactivé (PALM), pour caractériser quantitativement l'organisation structurelle de l'E. coli O-ring ^8.

PALM offre à la fois l'imagerie à haute résolution spatiale (~ 35 nm) et un étiquetage spécifique pour permettre une identification sans ambiguïté des protéines cibles. Nous avons étiqueté FtsZ avec la protéine fluorescente mEos2 photoactivable, qui passe du vert fluorescence (excitation = 488 nm) au rouge fluorescence (excitation = 561 nm) lors de l'activation à 405 nm ^9. Au cours d'une expérience PALM, simples FtsZ-mEos2 molécules sont activées stochastiquement et les positions correspondantes barycentre des molécules individuelles sont déterminées avec une précision <20 nm. Une image de super-résolution de l'O-ring est ensuite reconstruite par superposition des positions des centroïdes de tous détectés FtsZ-mEos2 molécules. <p class = "jove_content"> En utilisant cette méthode, nous avons constaté que l'O-ring a une largeur fixe de ~ 100 nm et est constitué d'un faisceau lâche de protofilaments FtsZ qui se chevauchent les uns avec les autres en trois dimensions. Ces données fournissent un tremplin pour d'autres études sur les changements du cycle cellulaire dépendant de la ¹⁰ Z-ring et peut être appliquée à d'autres protéines d'intérêt.

Protocole

1. Préparation des échantillons

1. Inoculer milieu LB avec une seule colonie de la souche JB281 [BW25113 / pJB042 (P _Lac: FtsZ-mEos2)]. Cultivez la nuit dans un shaker à 37 ° C.
2. Diluer la culture 1:1000 dans M9 ⁺ minimes médias [sels M9, glucose 0,4%, 2 mM MgSO _4, 0,1 mM CaCl _2, acides aminés et vitamines MEM] et passer à la phase mi-log _(DO600 = 0.2 à 0.3) en présence de chloramphénicol (150 ug / ml) à température ambiante (RT).
3. Provoquer la culture avec 20 uM d'IPTG pendant 2 heures (voir note n ° 1).
4. Culture culot dans microcentrifugeuse (8.000 rpm, 1 min) et remettre en suspension dans un volume égal d'M9 ^+; répétition. Après la remise en suspension seconde, poursuite de la croissance à la température ambiante pendant 2 heures.
5. Fixer culture induite avec du paraformaldéhyde 4% dans du PBS (pH = 7,4) à température ambiante pendant 40 min. Culture Pellet et remettre en suspension dans un volume égal de PBS; répétition. Si l'imagerie de cellules vivantes, sautez la fixation, la culture culot et remettre en suspension dans un volume égalde M9 ^- [sels M9, glucose 0,4%, 2 mM MgSO _4, 0,1 mM CaCl _2, Acides aminés MEM]; récidivistes.
6. Diluer perles d'or 1:10 avec la culture remis en suspension. Appliquer l'échantillon dans la chambre d'imagerie préparé (voir étape 2.4).

[1] Remarque: Le protocole d'induction ci-dessus (étapes 1.1 à 1.3) a été optimisé pour le système d'expression de la souche JB281. Conditions d'induction détaillées peuvent varier pour d'autres systèmes d'expression ou protéines d'intérêt.

2. Assemblée de la Chambre d'imagerie

1. Préparer une solution à 3% (p / v) d'agarose à M9 ^-. Faire fondre l'agarose à 70 ° C dans un bloc chauffant paillasse pendant 40 mn. Magasin d'agarose fondu à 50 ° C pendant 5 heures.
2. Placer une lame de nettoyage microaqueduct dans la moitié supérieure de la chambre d'imagerie avec les électrodes se faisant face vers le bas. Aligner le joint d'étanchéité inférieur sur le coulisseau microaqueduct de manière à recouvrir les canaux de perfusion.
3. Appliquer ~ 50 pl de la fondue agarose vers le centre de la vitrediapositive. Immédiatement haut de la gouttelette gel d'agarose avec un chiffon propre, sec lamelle. Laisser le gel se solidifier à la température ambiante pendant 30 min.
   1. Pour nettoyer des lamelles: organiser des lamelles dans un support en céramique et une sonication pendant 20 min à rotation bains d'acétone, d'éthanol et 1 M de KOH dans des bocaux en verre. Répétez cycle de trois fois, pour un total de 9 sonications, suivie d'une sonication unique dH ₂ O. Rangez les lamelles nettoyées en eau douce dH ₂ O. Avant l'utilisation, souffler lamelles sèches avec de l'air filtré.
4. Retirez délicatement la lamelle, laissant coussin de gel sur la diapositive microaqueduct. Ajouter immédiatement 1 ul d'échantillon de culture cellulaire (voir l'étape 1.6) vers le haut de la poche de gel. Attendre ~ 2 min, ce qui permet à la solution soit absorbée par le tampon de gel. Haut coussin de gel avec une vierge, lamelle sec. Assemblez la chambre d'imagerie tout en suivant les instructions du fabricant.

3. Image Acquisition

1. Allumez le microscope, la caméra et le laser. Ouvrez MetaMorph douceware (Molecular Devices).
2. Placer appropriées d'excitation / émission de filtres dans le trajet de formation d'image (figure 1).
3. Définir des puissances laser et les paramètres d'acquisition en conséquence.
   1. 488-nm laser = 15 mW (voir note n ° 2)
   2. 561-nm laser = 75 mW
   3. 405-nm laser = 2 mW ± filtre à densité neutre (Voir note n ° 3)
4. Verrouiller chambre d'imagerie dans l'étage via l'adaptateur étage complémentaire.
5. Désigner une région d'imagerie appropriée (100x100 pixel) qui est homogène éclairé par les trois lasers.
6. Identifier une zone d'échantillonnage qui contient des cellules et des marqueurs de confiance (billes d'or) à proximité mais ne se chevauchent pas.
7. Focus sur la surface des cellules les plus proches de la lamelle. Acquérir une image à fond clair avec 50 ms de temps d'intégration et de déplacer le focus 0,5 um dans l'échantillon (Figure 3AI).
8. Acquérir ensemble l'image de fluorescence verte avec l'excitation de la 488-n m laser en utilisant un temps de 50 ms intégration (Figure 3Aii).
9. Acquérir le streaming vidéo dans le canal rouge avec un éclairage continu à partir de 405-nm et 561 nm lasers. Pour les cellules fixes, un taux de 50 ms cadre est utilisé pour un total de 20.000 cadres (total ~ min 17) avec la puissance du laser 405-nm rampe d'environ 10% tous les 1000 images (voir note n ° 4). Pour les cellules vivantes, un taux de trame de 10 ms est utilisée pour un total de 3.000 cadres (~ 30 s au total) avec une puissance laser 405 nm constante.
10. Déplacer le foyer arrière de la surface inférieure des cellules et d'acquérir une autre image de champ clair que dans l'étape 3,7.

[2] Remarque: l'intensité intégrée de la fluorescence verte d'une cellule est directement proportionnelle au nombre total de FtsZ-mEos2 molécules exprimées dans la cellule. La puissance d'excitation 488-nm et les paramètres d'ensemble d'acquisition de fluorescence doit être maintenue constante pour toutes les cellules de telle sorte que le rapport FtsZ-mEos2 niveaux d'expression dans des cellules différentes peuvent être comparés.

ontenu "> [3]. Remarque: Les cellules fixées sont imagés avec la densité neutre (ND) (figure 1, de composants optiques n ° 5) en place dans le but d'atteindre un taux d'activation lente, de sorte que chaque molécule individuelle peut être identifié avec précision le filtre ND est retiré lorsque l'imagerie des cellules vivantes pour augmenter la vitesse d'activation, tout en maintenant une faible probabilité de deux molécules étant activés simultanément dans une zone limitée par la diffraction. La vitesse plus rapide appliquée à imagerie des cellules vivantes est nécessaire de diminuer le temps d'acquisition total, ainsi «geler» l'O-ring en temps et en limitant l'effet de photovieillissement de la cellule.

[4] Remarque: Les numéros de trames acquises ont été optimisés pour notre système et dépendent de la structure cellulaire particulier, l'étiquetage densité, taux d'activation et si l'évacuation de l'ensemble du pool de fluorophores est important pour l'analyse. Dans les cellules vivantes, il est important d'obtenir un nombre suffisant de localisations dans une période aussi courte de time que possible pour éviter le flou de l'image dû au bougé de la structure cellulaire.

4. Construction image PALM

1. Déterminer la position de centre de gravité de chaque spot détecté.
   1. Chargez la pile d'images dans Matlab (The MathWorks, Inc.)
   2. Découper l'empilement d'image à une région autour d'une cellule qui ne comprend pas tous les cordons repères.
   3. Sélectionnez un seuil d'intensité pour la détection endroit qui est au-dessus du niveau de fond, mais en dessous de la moyenne intensité de la tache. Nous tenons compte de la variation du niveau de fond tout au long d'une expérience en calculant la moyenne de fonctionnement de l'intensité maximale en utilisant un cadre de fenêtre 150. Le seuil d'intensité pour chaque trame est ensuite interpolée à partir des valeurs moyennes de fonctionnement.
   4. Soustraire le seuil respectif de chaque trame. Endroits potentiels sont identifiés comme trois pixels adjacents avec des intensités dessus du seuil.
   5. Adapter l'intensité de fluorescence de chaque point potentiel à un Gaussia bidimensionneln fonction [Equation 1] en utilisant un algorithme des moindres carrés non linéaire (figure 2). La précision de localisation de chaque point est calculée en utilisant le nombre total de photons détectés [équation 2]. N'importe quel endroit mal-ajustement avec une précision de localisation supérieure à 20 nm (cellules fixes) ou 45 nm (cellules vivantes) est éliminée (voir note n ° 5). N'importe quel endroit avec une intensité supérieure à deux volets de l'intensité moyenne, probablement à cause de chevauchement des émetteurs, est également rejeté.
   6. Pour les cellules fixes, retirer des observations répétées de la même molécule en faisant abstraction de toute tache dont le centre de gravité se trouve dans la position 45 nm de toute autre tache qui l'a précédé de 6 trames ou moins. Pour les cellules vivantes, tous les points sont conservés.
2. Calibrer la dérive échantillon en utilisant le mouvement de repère de calage.
   1. Cultures sur une zone de pixels 10x10 autour d'un marqueur de repère.
   2. Soustraire le seuil respectif déterminé en 4.1.3 de chaque trame.
   3. Monter le profil d'intensité dans chaquebâti par l'intermédiaire des moindres carrés algorithme d'ajustement en supposant une forme gaussienne bidimensionnelle.
   4. Calculer le déplacement entre les positions des centroïdes par rapport à l'image 1.
3. Corriger la position du centre de gravité de chaque molécule unique identifié en 4.1 avec la dérive appropriée de l'échantillon calculée en 4.2. Comparer les images en fond clair acquises en 3,7 et 3,10. Si les cellules sont observées à se déplacer par rapport aux balises de repère, les données sont jetés.
4. Superposer toutes les positions corrigées centroïde sur une seule image composée de pixels 15x15 nm. Tracer chaque molécule unique comme une unité de surface, à deux dimensions profil gaussien centré à la position de centre de gravité, avec un écart-type égal à la précision de localisation [Equation 2]. Il en résulte une carte de densité de probabilité, où l'intensité d'un pixel est proportionnelle à la probabilité de trouver une molécule dans ce pixel (Figure 3Aiv).
5. En comparant les images PALM aux images ensemble.
   1. Replot le centropositions id comme en 4.4, mais sur un plan de 150x150 pixels nm et un écart type égal à 250 nm. Cela génère une image qui imite PALM une image de diffraction limitée, qui peut être utilisé pour comparer l'image de diffraction limitée ensemble, acquis en 3,8 (Figure 3Aiii).
   2. Pour confirmer que les molécules détectées sont représentatifs de l'ensemble de la population, comparer l'image d'ensemble reconstruite (Figure 3Aiii, étape 4.5.1) avec l'image de fluorescence ensemble expérimental (Figure 3Aii, étape 3.8) pour confirmer que les deux images montrent des structures de forme similaire , l'orientation et l'intensité relative.

[5] Remarque: La précision de localisation minimum requis a été déterminé de manière empirique pour chaque méthode d'imagerie en traçant les précisions de toutes les molécules d'un échantillon donné et en choisissant un seuil approprié.

5. Analyse d'images PALM

1. Mesure de Z-Ring Width et diamètre.
   1. Faire pivoter l'image de manière à PALM verticalement orienter l'axe longitudinal de la cellule (figure 4A).
   2. Cultures sur la région cellulaire contenant le O-ring.
   3. Calculer l'intensité cumulée par projection d'une courbe d'intensité le long de l'axe de temps de la cellule.
   4. Adapter le profil d'intensité à une distribution gaussienne. La largeur de l'anneau est défini comme le maximum moitié pleine largeur (FWHM) de la distribution gaussienne ajustée (Figure 4B).
   5. Projeter le profil de l'intensité cumulée 5.1.2 long de l'axe court de la cellule. Le diamètre de l'anneau est définie comme la longueur du profil d'intensité (figure 4C).
2. Tracé Densité FtsZ (voir note 6).
   1. Replot les positions centroïdes que dans (4,4), mais sans que le profil gaussien de telle sorte que chaque molécule unique est attribué une valeur de 1 et affecté à un seul pixel correspondant à sa position de centre de gravité. De cette façon, l'intensité de chaquepixel représente le nombre total de molécules détectées dans ce pixel. L'image PALM densité peut également être visualisée comme un tracé de contour (figure 5E).
3. Détermination de la résolution spatiale.
   1. Théoriquement, réalisables résolution spatiale: créer un PSF représentant pour la totalité de l'échantillon en utilisant la précision de localisation moyenne déterminée de toutes les molécules détectées et calculer la FWHM (équation 3).
   2. Expérimentalement atteint une résolution spatiale: calculer le déplacement moyen entre les observations répétées de la même molécule.

[6] Note: Nous avons utilisé une réflexion interne totale PALM (TIR-PALM, figure 1 et 5) pour restreindre l'activation et d'excitation à une couche mince (~ 200 nm) au-dessus de l'interface cellule / verre. de sorte que seules les molécules FtsZ associés à la membrane le plus proche de la lamelle sera détecté.

Résultats

Illustré à la figure 3Aiv est un bidimensionnelle, de super-résolution de rendu de l'anneau Z-générée à partir de la méthode d'imagerie PALM décrit ci-dessus. Ci-dessous, nous résumons les informations qualitatives et quantitatives qui peut être obtenu de leur part.

Qualitativement, nous avons observé que l'O-ring est une structure irrégulière qui adopte plusieurs configurations (bande unique ou d'un arc hélicoïdal) qui ne sont pas distinguée...

Discussion

Images PALM contiennent des informations sur compte molécules et fonctions au sein d'une cellule, ce qui permet une analyse détaillée de la répartition et l'agencement des molécules de protéines cibles qui est difficile à obtenir par d'autres moyens. Ci-dessous, nous présentons les précautions qui doivent être prises pour en extraire des informations quantitatives précises tout en maintenant la pertinence biologique des images PALM. Nous explorons également les informations qui peuvent être obte...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom de réactif / Matériel	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
50 x MEM acides aminés	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamines	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46 à 102-RF
Paraformaldéhyde 16%	Electron Sciences Micrsocopy	15710-S
GTG Agarose SeaPlaque	Lonzo	50111
50 perles d'or nm	Microsphères-Nanosphères	790113-010
FCS2 imagerie Chambre	Bioptechs
Adaptateur étape	ASI	I-3017
Microscope inversé	Olympe	IX71
NA 1,45, 60x Objectif	Olympe
IXON EMCCD caméra	Andor Technology	DU897E
488-nm laser saphir	Cohérent
561-nm laser saphir	Cohérent
Laser CUBE 405-nm	Cohérent