Super-Resolution Imaging бактериального Машины отдела

Резюме

Мы описываем супер-разрешение изображения методом для исследования структурной организации бактериальных FtsZ-кольцо, существенную устройство для деления клеток. Этот метод основан на количественном анализе фотоактивированного локализации микроскопии (PALM) изображений и может быть применен в других бактериальных белков цитоскелета.

Аннотация

Бактериальные деления клеток требует скоординированных сборки из более чем десяти основных белков в midcell ^1,2. Центральное место в этом процессе является формирование кольцевых супраструктуры (Z-кольцо) белком FtsZ в плане разделения ^3,4. Z-кольцо состоит из нескольких одноцепочечной протофиламентов FtsZ, и понимание расположения протофиламентов внутри Z-кольцо обеспечит понимание механизма Z-кольцо в сборе и его функции как сила, генератор ^5,6. Эта информация осталась неуловимой из-за существующих ограничений в обычной флуоресцентной микроскопии и электронной микроскопии. Обычные флуоресцентной микроскопии не в состоянии обеспечить высокое разрешение изображения Z-кольцо из-за дифракционного предела света (~ 200 нм). Электрон cryotomographic изображений обнаружено разбросаны FtsZ протофиламентов в небольших C. crescentus клеток ^7, но трудно применять на больших клетках, таких какE.coli или B. Сенная. Здесь мы описываем применение супер-разрешение флуоресцентного метода микроскопии, фотоактивированного микроскопии локализации (PALM), количественно характеризующие структурную организацию E. палочки Z-кольцо ^8.

PALM изображений предлагает как высоким пространственным разрешением (~ 35 нм) и конкретные маркировки чтобы однозначной идентификации белков-мишеней. Мы назвали FtsZ с фотоактивируемых флуоресцентного белка mEos2, который переключается с зеленой флуоресценции (возбуждение = 488 нм) до красной флуоресценции (возбуждение = 561 нм) при активации при 405 нм ^9. Во время эксперимента PALM, одна FtsZ-mEos2 молекул стохастически активируется и соответствующая тяжести положения отдельных молекул определяется с <20 нм точность. Супер-разрешение изображения Z-кольцо, затем реконструирован путем наложения тяжести позиций всех обнаруженных FtsZ-mEos2 молекул. <р = класса "jove_content"> Используя этот метод, мы обнаружили, что Z-кольцо имеет фиксированную ширину ~ 100 нм и состоит из свободных расслоение протофиламентов FtsZ, которые перекрывают друг с другом в трех измерениях. Эти данные служат трамплином для дальнейших исследований клеточного цикла зависимости изменения Z-кольцо ¹⁰ и может быть применен к другим белкам интерес.

протокол

1. Подготовка проб

1. Инокулировать LB среды с одной колонии штамма JB281 [BW25113 / pJB042 (P _Lac: FtsZ-mEos2)]. Вырасти на ночь в шейкере при 37 ° C.
2. Развести культуры 1:1000 в M9 ⁺ минимальных средах [M9 соли, 0,4% глюкозы, 2 мМ MgSO _4, 0,1 мМ CaCl _2, MEM аминокислот и витаминов] и расти до середины логарифмической фазы (OD ₆₀₀ = 0,2-0,3) в присутствии хлорамфеникола (150 мкг / мл) при комнатной температуре (RT).
3. Вызвать культуры с 20 мкМ IPTG в течение 2 часов (см. Примечание № 1).
4. Пелле культуры в микроцентрифуге (8.000 мин, 1 мин) и ресуспендируют в равном объеме M9 ^+; повторить. После второго ресуспендирования, продолжит рост при комнатной температуре в течение 2 часов.
5. Исправить индуцированной культуре с 4% параформальдегидом в PBS (рН = 7,4) при комнатной температуре в течение 40 мин. Пелле культуры и ресуспендируют в равном объеме PBS; повторить. Если изображение живых клеток, пропустить фиксации, гранулы культуры, и ресуспендируют с равным объемомМ9 ^- [M9 соли, 0,4% глюкозы, 2 мМ MgSO _4, 0,1 мМ CaCl _2, аминокислот MEM]; повторить.
6. Развести золотым бисером 1:10 с ресуспендированных культуры. Нанесите образец подготовленной камере изображений (см. п. 2.4).

[1] Примечание: Данный протокол индукции (шаги 1.1-1.3) была оптимизирована для выражения системы штамм JB281. Подробные условия индукции могут отличаться для других систем экспрессии белков или интереса.

2. Собрание палаты изображений

1. Сделайте 3% (вес / объем) раствор агарозы в M9 ^-. Растопить агарозы при 70 ° C в настольный тепла блок для 40 мин. Магазин растаял агарозы при 50 ° C в течение 5 часов.
2. Поместите чистый слайд microaqueduct в верхней половине изображения камеры с электродами вниз. Совместите нижнюю прокладку на microaqueduct слайд так, чтобы покрыть перфузии каналов.
3. Применить ~ 50 мкл расплавленной агарозы в центре стекласлайда. Сразу верхней капли геля агарозы с чистой, сухой покровное. Разрешить гель для затвердевают при комнатной температуре в течение 30 мин.
   1. Для очистки покровные: организовать покровные в керамической держатель и разрушать ультразвуком в течение 20 мин во вращающемся ванны ацетона, этанола и 1M KOH в стеклянных банках. Повторите цикл три раза, в общей сложности 9 sonications, а затем одним ультразвуком в дН ₂ O. Хранить очищенные покровные в свежем дН ₂ O. Перед использованием сушить покровные с фильтром воздуха.
4. Осторожно снимите покровное, оставляя гель накладка на microaqueduct слайд. Сразу добавить 1 мкл клеточной культуре образца (см. п. 1.6) в верхней части геля площадку. Подождите ~ 2 мин, что позволяет решение, которое будет поглощено гель площадку. Лучшие площадки геля с новым чистым, сухим покровным. Соберите всю камеру изображения в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.

3. Image Acquisition

1. Включите микроскопа, камеры и лазеры. Откройте MetaMorph мягкиеПосуда (Molecular Devices).
2. Поместите соответствующее возбуждение / излучение фильтры в визуализации пути (рис. 1).
3. Набор лазерных полномочий и приобретение настройки соответствующим образом.
   1. 488-нм лазер = 15 мВт (см. Примечание № 2)
   2. 561-нм лазер = 75 мВт
   3. 405-нм лазер = 2 мВт ± фильтр нейтральной плотности (См. Примечание № 3)
4. Блокировка изображений камеры в сцене с помощью дополнительного адаптера этапе.
5. Назначить соответствующем регионе томография (100x100 пикселей), который однородно освещенной всех трех лазеров.
6. Определить площадь образца, который содержит клетки и координатных меток (золотые бусины) в непосредственной близости, но не дублируют друг друга.
7. Сосредоточьтесь на поверхности клеток ближе к покровным. Приобрести одно светлое изображение 50 раз интеграции мс и переместить фокус 0,5 мкм на образце (рис. 3Ai).
8. Приобретать ансамбль зеленая флуоресценция изображение с возбуждением от 488-п м лазера на 50 мс времени интегрирования (рис. 3Aii).
9. Приобретать потокового видео в красный канал при непрерывном освещении с 405-нм и 561-нм лазеров. Для фиксированных клеток, 50 мс, частота кадров используется для в общей сложности 20000 кадров (~ 17 мин общего числа) с 405-нм Мощность лазера увеличили на ~ 10% каждые 1000 кадров (см. примечание № 4). Для живых клеток, 10 мс, частота кадров используется для в общей сложности 3000 кадров (~ 30 сек общего числа) при постоянном 405-нм Мощность лазера.
10. Переместить фокус обратно к нижней поверхности клеток и приобрести другое светлое изображение, как и в шаге 3.7.

[2] Примечание: интегральной интенсивности зеленого свечения ячейки прямо пропорциональна общему числу FtsZ-mEos2 молекулы выражается в клетке. 488-нм мощности возбуждения флуоресценции и ансамбль настройки приобретение должно быть постоянным для всех клеток так, чтобы относительная FtsZ-mEos2 уровни экспрессии в различных клетках могут быть сопоставлены.

ontent "> [3]. Примечание: Фиксированные клетки, полученную с нейтральной плотности (ND) фильтр (рис. 1, оптический компонент № 5) на место в целях достижения медленного активации так что каждая отдельная молекула может быть точно определены ND фильтр удаляется при визуализации живые клетки увеличить скорость активации, сохраняя при этом низкую вероятность две молекулы активируются одновременно в дифракционной области. быстрее ставка жить-клеточной визуализации необходимы для уменьшения общего времени приобретения, тем самым "замораживания" Z-кольца во времени и ограничения последствий фотостарения к ячейке.

[4] Примечание: количество фреймов были оптимизированы для нашей системы и зависит от конкретной клеточной структуры, маркировка плотность, скорость активации и будет ли исчерпав весь пул флуорофоров имеет важное значение для анализа. В живых клетках, важно получить достаточное количество локализаций в максимально короткий период тиМне, чтобы избежать размывания изображения из-за движения клеточной структуры.

4. PALM Изображение строительства

1. Определить центр тяжести положения каждого обнаруженного пятна.
   1. Загрузите изображение стека в Matlab (MathWorks, Inc).
   2. Обрезать изображение стека в область вокруг одной ячейки, которая исключает все координатных бисера.
   3. Выберите интенсивности порог месте обнаружения, что выше уровня фона, но ниже средней интенсивности месте. Мы учитываем изменения в фоновом уровне в течение эксперимента расчета скользящей средней максимальной интенсивности использования 150-оконная рама. Пороговой интенсивности для каждого кадра, затем интерполяции работает средние значения.
   4. Вычтите соответствующий порог из каждого кадра. Перспективные места определяются как три соседних пикселей с интенсивностью выше порога.
   5. Установите интенсивность флуоресценции каждого потенциального места для двумерного GaussiaN Функция [Уравнение № 1] с помощью нелинейного метода наименьших квадратов алгоритм (рис. 2). Локализация точность каждого места рассчитывается с использованием общего числа зарегистрированных фотонов [Уравнение № 2]. Любой плохо подходят места с локализацией точностью большей, чем 20 нм (фиксированная клеток) или 45 нм (живые клетки) отбрасывается (см. примечание 5). Любое пятно с интенсивностью больше чем в два раза средней интенсивности, возможно, из-за перекрытия излучатели, также отбрасывается.
   6. Для фиксированных клеток, удалить повторные наблюдения и той же молекулы, игнорируя любую точку которого центр тяжести позицию в течение 45 нм из любого другого места, которые предшествовали его 6 кадров или меньше. Для живых клеток, все места будут сохранены.
2. Калибровка образца дрейф использованием координатных движение маркера.
   1. Вырежьте 10x10 пикселей область вокруг координатных маркером.
   2. Вычтите соответствующего порога, определенного в 4.1.3 из каждого кадра.
   3. Установить профиль интенсивности в каждойкадр с помощью наименьших квадратов алгоритм подбора предполагая двумерной гауссовой формы.
   4. Вычислить смещение центра тяжести между позиции по отношению к раме 1.
3. Исправьте положение центра тяжести каждой уникальной молекулы, определенных в 4.1 с соответствующим дрейф образца рассчитывается в 4,2. Сравнить светлого изображения, полученные в 3,7 и 3,10. Если клетках наблюдается перемещаться относительно координатных маркеры, данные выброшены.
4. Наложите все исправленные тяжести позиций на одно изображение состоит из пикселей 15x15 нм. Сюжет каждой уникальной молекулы в единицу площади, двумерный гауссов профиль с центром в центре тяжести позицию со стандартным отклонением равным локализации точности [Уравнение № 2]. В результате карта плотности вероятности, где интенсивность пиксела пропорциональна вероятности нахождения молекулы в том, что пиксель (рис. 3Aiv).
5. Сравнение PALM изображения в ансамбле изображений.
   1. Replot CentroID позиции, как и в 4.4, но на плоскости с 150x150 пикселей нм, а стандартное отклонение равно 250 нм. Это создает PALM изображение, которое имитирует дифракционного изображения, которые могут быть использованы для сравнения с дифракционной, ансамбль изображение, полученное в 3,8 (рис. 3Aiii).
   2. Чтобы подтвердить, что обнаруженные молекулы представителем всего населения, сравните восстановленное изображение ансамбля (рис. 3Aiii, шаг 4.5.1) с экспериментальным изображение флуоресценции ансамбля (рис. 3Aii, шаг 3,8), чтобы подтвердить, что оба изображения показывают структуры подобной формы , ориентации и относительной интенсивности.

[5] Примечание: минимальная требуемая точность локализации определяется эмпирически для каждого изображения методом построения уточнения всех молекул для данного образца и выбрав соответствующую обрезания.

5. PALM анализа изображения

1. Измерение Z-Ring Widtч и диаметр.
   1. Поверните ладони изображения таким образом, чтобы ориентировать вертикально длинной оси клетки (рис. 4а).
   2. Вырежьте сотовой область, содержащую Z-кольца.
   3. Расчет совокупного интенсивности при проектировании профиля интенсивности вдоль длинной оси клетки.
   4. Установить профиль интенсивности для распределения Гаусса. Ширина кольца определяется как полная не более половины ширины (FWHM) на оборудованной распределения Гаусса (рис. 4В).
   5. Проект кумулятивный профиль интенсивности 5.1.2 вдоль короткой оси клетки. Диаметр кольца определяется как полная длина профиля интенсивности (рис. 4в).
2. Построение FtsZ плотности (см. примечание 6).
   1. Replot центр тяжести позиции, как и в (4,4), но без гауссовым профилем так, что каждая уникальная молекула данного значения 1 и назначен на один пиксель соответствующее его тяжести положения. Таким образом, интенсивность каждогопиксель представляет собой общее число молекул обнаружена в том, что пиксель. Плотность изображения PALM также могут быть визуализированы в виде контурного графика (Рисунок 5E).
3. Определение пространственного разрешения.
   1. Теоретически достижимая-пространственного разрешения: создать представителя PSF для всей выборки с использованием среднего определяется локализацией точность всех обнаружить молекулы и расчета FWHM (уравнение 3).
   2. Экспериментально-достигнуто пространственное разрешение: вычислить среднее перемещение между повторными наблюдениями той же молекулы.

[6] Примечание: Мы использовали полного внутреннего отражения PALM (TIR-PALM, рисунок 1 и 5) ограничить активацию и возбуждение в тонком слое (~ 200 нм) выше ячейки / стекло. так что только молекулы FtsZ связанных с мембраной ближе к покровным будет обнаружен.

Результаты

Показано на рисунке 3Aiv является двумерным, супер-разрешение рендеринга Z-кольцо, порожденное от метода PALM изображениями описанное выше. Ниже мы кратко качественную и количественную информацию, которая может быть получена от них.

Качественно, мы обнаружили, что ...

Обсуждение

PALM изображения содержат информацию о молекуле счета и позиции внутри клетки, что позволяет детальный анализ распределения и расположения молекул белка-мишени, которую трудно достичь другими средствами. Ниже мы приводим меры предосторожности, которые должны быть приняты для извлечен?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название Реагенты / Материал	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
50 х MEM Аминокислоты	Сигма	M5550
100 х MEM Витамины	Сигма	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% параформальдегид	Электрон Micrsocopy наук	15710-S
Легкоплавкий GTG Агароза	Лонзо	50111
50 нм Бисер Золото	Микросферы-наносферы	790113-010
FCS2 изображений палата	Bioptechs
Этап адаптер	ASI	Я-3017
Инвертационный микроскоп	Олимп	IX71
1,45 NA, 60x цели	Олимп
IXON EMCCD камеры	Андор технологии	DU897E
488-нм сапфирового лазера	Когерентный
561-нм сапфирового лазера	Когерентный
405-нм лазерный CUBE	Когерентный