Super-risoluzione Imaging della Divisione Macchine batterica

Riepilogo

Descriviamo un super-risoluzione metodo di imaging per sondare l'organizzazione strutturale del batterica FtsZ-ring, un apparecchio essenziale per la divisione cellulare. Questo metodo si basa su analisi quantitative di fotoattivati ​​localizzazione microscopia (PALM) immagini e può essere applicata ad altre proteine ​​batteriche citoscheletro.

Abstract

Divisione cellulare batterica richiede il montaggio coordinato di più di dieci proteine ​​essenziali alla midcell ^1,2. Centrale di questo processo è la formazione di un anello simile sovrastruttura (Z-ring) dalla proteina FtsZ al piano di divisione ^3,4. La-Z anello costituito da più singolo filamento protofilamenti FtsZ, e comprendere la disposizione dei protofilamenti all'interno Z-ring fornirà sul meccanismo di Z-ring e la sua funzione di generatore di forza ^5,6. Questa informazione è rimasta inafferrabile a causa delle limitazioni attuali convenzionale microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica. Microscopia a fluorescenza convenzionale non è in grado di fornire una immagine ad alta risoluzione di Z-ring a causa del limite di diffrazione della luce (~ 200 nm). Electron cryotomographic di imaging ha rilevato sparsi protofilamenti FtsZ in piccole C. cellule crescentus ^7, ma è difficile da applicare a grandi cellule qualiE. coli o B. subtilis. Qui si descrive l'applicazione di un metodo di risoluzione super-microscopia a fluorescenza, microscopia localizzazione fotoattivati ​​(PALM), per caratterizzare quantitativamente l'organizzazione strutturale della E. coli Z-ring ^8.

PALM offre sia immagini alta risoluzione spaziale (~ 35 nm) e un'etichettatura specifica per consentire l'identificazione univoca delle proteine ​​bersaglio. Abbiamo etichettato FtsZ con il mEos2 fotoattivabile proteina fluorescente, che passa da verde a fluorescenza (eccitazione = 488 nm) al rosso fluorescenza (eccitazione = 561 nm) in caso di attivazione a 405 nm ^9. Durante un esperimento PALM, singoli FtsZ-mEos2 molecole sono stocasticamente attivati ​​e le corrispondenti posizioni centroide delle singole molecole sono determinati con <20 nm precisione. Un super-risoluzione di immagine di Z-ring viene poi ricostruita sovrapponendo le posizioni centroide di tutti i rilevati FtsZ-mEos2 molecole. <p class = "jove_content"> Usando questo metodo, abbiamo trovato che la Z-anello ha una larghezza fissa di circa 100 nm ed è composto da un fascio di allentato protofilamenti FtsZ che si sovrappongono tra loro in tre dimensioni. Questi dati forniscono un trampolino per ulteriori indagini modifiche ciclo cellulare dipendenti della Z-ring ¹⁰ e può essere applicata ad altre proteine ​​di interesse.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Inoculare i terreni LB con una singola colonia di ceppo JB281 [BW25113 / pJB042 (P _Lac: FtsZ-mEos2)]. Crescere durante la notte in uno shaker a 37 ° C.
2. Diluire la cultura 1:1000 in M9 ⁺ minimi di media [Sali M9, 0,4% di glucosio, 2 mM _MgSO4, 0.1 mM CaCl _2, Acidi MEM aminoacidi e vitamine] e crescere fino a metà-log fase (OD ₆₀₀ = 0,2-0,3) in presenza di cloramfenicolo (150 mcg / ml) a temperatura ambiente (RT).
3. Indurre la cultura con 20 mM IPTG per 2 ore (vedi nota n ° 1).
4. Cultura pellet in microcentrifuga (8000 rpm, 1 min) e risospendere in un volume uguale di M9 ^+; ripetizione. Dopo la risospensione secondi, continuare la crescita a temperatura ambiente per 2 h.
5. Fissare cultura indotta con 4% paraformaldeide in PBS (pH = 7,4) a temperatura ambiente per 40 min. Cultura pellet e risospendere in un volume uguale di PBS; repeat. Se le cellule di imaging in diretta, saltare fissazione, cultura pellet e risospendere con un volume ugualedi M9 ^- [Sali M9, 0,4% di glucosio, 2 mM _MgSO4, 0.1 mM CaCl _2, Acidi MEM Amino]; ripetere.
6. Diluire perle oro 01:10 con la cultura sedimento. Applicare il campione alla camera di imaging preparato (vedi punto 2.4).

[1] Nota: Il protocollo di induzione al di sopra (passi 1,1-1,3) è stato ottimizzato per il sistema di espressione del ceppo JB281. Condizioni di induzione dettagliate possono variare per altri sistemi di espressione o di proteine ​​di interesse.

2. Assemblea della Camera Imaging

1. Fare una soluzione al 3% (w / v) in agarosio M9 ^-. Melt agarosio a 70 ° C in un banco blocco termico per 40min. Conservare agarosio fuso a 50 ° C per 5 h.
2. Collocare un vetrino pulito microaqueduct nella metà superiore della camera di imaging con gli elettrodi rivolti verso il basso. Allineare la guarnizione inferiore sul vetrino microaqueduct modo da coprire i canali di perfusione.
3. Applicare ~ 50 microlitri del fuso agarosio al centro del vetrodiapositiva. Immediatamente sopra la goccia di gel di agarosio con un panno pulito, asciutto coprioggetto. Permettere al gel di solidificare a temperatura ambiente per 30 min.
   1. Per pulire coprioggetti: organizzare vetrini in un supporto in ceramica e ultrasuoni per 20 minuti nella rotazione bagni di acetone, etanolo e KOH 1M in barattoli di vetro. Ripetere il ciclo per tre volte, per un totale di 9 sonications, seguito da un singolo sonicazione in dH ₂ O. Conservare i coprioggetti puliti fresco dH ₂ O. Prima dell'uso, soffiare coprioggetto secco con aria filtrata.
4. Rimuovere accuratamente il vetrino coprioggetto, lasciando cuscinetto di gel sulla diapositiva microaqueduct. Immediatamente aggiungere 1 ml di campione di coltura cellulare (vedi passo 1.6) all'inizio del cuscinetto di gel. Attendere ~ 2 min, consentendo soluzione che deve essere assorbita dal cuscinetto di gel. Top Gel pad con un nuovo pulito, asciutto coprioggetto. Montare la camera tutta di immagini secondo le istruzioni del produttore.

3. Acquisizione di immagini

1. Accendere la fotocamera microscopio, e laser. Aprire MetaMorph morbidoware (Molecular Devices).
2. Luogo appropriato di eccitazione / emissione filtri nel percorso di immagini (Figura 1).
3. Impostare potenze laser e le impostazioni di acquisizione di conseguenza.
   1. 488 nm laser = 15 mW (vedi nota # 2)
   2. 561-nm laser = 75 mW
   3. 405-nm laser = 2 mW ± filtro a densità neutra (Vedi nota # 3)
4. Bloccare camera di imaging nella fase tramite l'adattatore stadio complementare.
5. Designare una regione appropriata immagini (100x100 pixel) che è omogeneamente illuminato da tutti e tre i laser.
6. Individuare un'area campione che contiene sia cellule e marcatori fiduciali (perle d'oro) nelle immediate vicinanze, ma non sovrapposti.
7. Concentrarsi sulla superficie delle cellule più vicini al coprioggetto. Acquisire un'immagine campo chiaro con 50 ms tempo di integrazione e spostare il focus 0,5 micron nel campione (Figura 3Ai).
8. Acquisire insieme immagine verde fluorescenza con eccitazione da 488-n m utilizzando un laser di integrazione 50 ms di tempo (Figura 3Aii).
9. Acquisire streaming video in canale rosso con illuminazione continua da 405-nm e 561-nm laser. Per cellule fisse, un frame rate 50 ms è utilizzato per un totale di 20.000 frames (~ 17 totale min) con la potenza del laser 405-nm rampa di circa 10% ogni 1.000 fotogrammi (vedi nota # 4). Per cellule vive, un telaio 10 ms rate viene utilizzato per un totale di 3000 frames (~ 30 s totale) alla temperatura costante di 405-nm potenza laser.
10. Spostare il fuoco posteriore alla superficie inferiore delle cellule e acquisire un'altra immagine brightfield come al punto 3.7.

[2] Nota: L'intensità integrata della fluorescenza verde di una cellula è direttamente proporzionale al numero totale di FtsZ-mEos2 molecole espresse nella cella. Il 488-nm potenza di eccitazione e impostazioni di acquisizione d'insieme fluorescenza deve essere mantenuta costante per tutte le celle in modo che la relativa FtsZ-mEos2 livelli di espressione in cellule differenti possono essere confrontati.

ONTENUTO "> [3]. Nota: celle fisse sono ripreso con la densità neutra (ND) filtro (figura 1, componente ottico # 5) in posizione al fine di ottenere una bassa velocità di attivazione in modo che ogni singola molecola può essere identificato con precisione i ND filtro viene rimosso quando l'imaging cellule vive per aumentare il tasso di attivazione, pur mantenendo una bassa probabilità di due molecole di essere attivati ​​simultaneamente in una diffrazione limitata zona. La velocità più applicato alle celle di imaging è necessario per ridurre il tempo totale di acquisizione, in tal modo "congelare" la Z-ring nel tempo e limitare l'effetto del fotodanneggiamento alla cella.

[4] Nota: Il numero di fotogrammi acquisiti sono stati ottimizzati per il nostro sistema e dipendono dalla particolare struttura cellulare, etichettatura densità, tasso di attivazione e se esaurire tutto il pool di fluorofori è importante per l'analisi. In cellule vive, è importante per ottenere un numero sufficiente di localizzazioni in un breve periodo di time possibile per evitare la sfocatura dell'immagine dovuta al movimento della struttura cellulare.

4. PALM Immagine Costruzione

1. Determinare la posizione del centroide di ogni punto rilevato.
   1. Caricare la pila di immagini in Matlab (The MathWorks, Inc.).
   2. Ritagliare la serie di immagini in una regione attorno a una cella che esclude tutti i cordoni fiduciali.
   3. Selezionare una soglia di intensità per il rilevamento punto che è al di sopra del livello di fondo, ma al di sotto della media intensità posto. Abbiamo spiegare la variazione del livello di fondo durante un esperimento calcolando la media corrente di intensità massima utilizzando una finestra cornice 150. La soglia di intensità per ciascun frame viene quindi interpolato dai valori medi.
   4. Sottrarre la rispettiva soglia di ogni fotogramma. I potenziali punti sono identificati come tre pixel adiacenti con intensità sopra la soglia.
   5. Montare l'intensità di fluorescenza di ogni punto prospettico ad un bidimensionale Gaussiafunzione n [Equazione # 1] usando un algoritmo non lineare almeno quadrati (Figura 2). La precisione di localizzazione di ciascun punto viene calcolato utilizzando il numero totale di fotoni rilevati [Equazione # 2]. Qualsiasi posto scarsamente in forma con una precisione di localizzazione superiore a 20 nm (cellule fisse) o 45 nm (cellule vive) viene scartato (vedi nota # 5). Qualsiasi punto con un'intensità maggiore di due volte la media intensità, forse a causa di emettitori sovrapposte, anche scartato.
   6. Per le cellule fisse, rimuovere le osservazioni ripetute della stessa molecola, ignorando qualsiasi punto la cui posizione baricentro si trova a 45 nm di qualsiasi altro posto che l'ha preceduta da 6 fotogrammi o meno. Per le cellule vive, tutti i punti vengono mantenuti.
2. Calibrare deriva esempio utilizzando movimento fiducial marker.
   1. Ritagliare una regione di pixel 10x10 intorno un marcatore fiducial.
   2. Sottrarre la relativa soglia determinato in 4.1.3 da ogni fotogramma.
   3. Montare il profilo di intensità in ognitelaio con dei minimi quadrati algoritmo raccordo assumendo una forma bidimensionale gaussiana.
   4. Calcolare lo spostamento tra le posizioni centroide rispetto al telaio 1.
3. Correggere la posizione del centroide di ogni molecola unica indicata al punto 4.1 con la deriva campione adeguato calcolato in 4.2. Confrontate le immagini acquisite in campo chiaro 3.7 e 3.10. Se le cellule sono osservate per spostarsi rispetto al marker fiduciali, i dati sono buttato.
4. Sovrapporre tutte le posizioni corrette baricentro su una singola immagine composta da pixel 15x15 nm. Tracciare ogni molecola unica come unità-area, bidimensionale profilo gaussiano centrato alla posizione del centroide con una deviazione standard inferiore alla precisione di localizzazione [Equazione # 2]. Ciò si traduce in una mappa di densità di probabilità, in cui l'intensità di un pixel è proporzionale alla probabilità di trovare una molecola di tale pixel (Figura 3Aiv).
5. Confrontando le immagini PALM alle immagini d'insieme.
   1. Replot il centroposizioni id come in 4.4, ma su un aereo con 150x150 pixel nm e una deviazione standard pari a 250 nm. Questo genera un'immagine PALM che imita un diffrazione limitata dell'immagine, che può essere utilizzata per confrontare la diffrazione limitata, immagine acquisita insieme a 3,8 (Figura 3Aiii).
   2. Per confermare che le molecole rilevate sono rappresentativi di tutta la popolazione, confrontare l'immagine ricostruita insieme (Figura 3Aiii, passo 4.5.1) con l'immagine di fluorescenza insieme sperimentale (Figura 3Aii, passo 3.8) per verificare che entrambe le immagini mostrano strutture di forma simile , l'orientamento e l'intensità relativa.

[5] Nota: la precisione di localizzazione minimo richiesto è stato determinato empiricamente per ogni metodo di imaging riportando le precisioni di tutte le molecole per un dato campione e la selezione di un taglio adeguato.

5. PALM Image Analysis

1. Misura Z-Ring widthe diametro.
   1. Ruotare l'immagine PALM modo da orientare verticalmente lungo l'asse della cella (Figura 4A).
   2. Ritaglia la regione contenente il cellulare Z-ring.
   3. Calcolare l'intensità cumulativa proiettando un profilo di intensità lungo l'asse lungo della cella.
   4. Montare il profilo di intensità di una distribuzione gaussiana. La larghezza dell'anello è definito come la massima larghezza di mezzo completo (FWHM) della distribuzione gaussiana attrezzata (Figura 4B).
   5. Proiettare il profilo cumulativo 5.1.2 intensità lungo l'asse corto della cella. Il diametro dell'anello è definita come la lunghezza del profilo di intensità (Figura 4C).
2. Plotting Densità FtsZ (vedi nota 6).
   1. REPLOT le posizioni centroide come in (4.4), ma senza il profilo Gaussiano tale che ogni molecola unica viene dato un valore di 1 e assegnato ad un pixel corrispondente alla posizione centroide. In questo modo, l'intensità di ciascunpixel rappresenta il numero totale di molecole rilevate in quel pixel. L'immagine PALM densità può anche essere visualizzato come una trama di contorno (Figura 5E).
3. Determinazione della risoluzione spaziale.
   1. Teoricamente-realizzabile risoluzione spaziale: creare un PSF rappresentativo per l'intero campione con la precisione media determinata localizzazione di tutte le molecole rilevate e il calcolo della FWHM (equazione # 3).
   2. Sperimentalmente-raggiunto risoluzione spaziale: calcolare lo spostamento medio tra le osservazioni ripetute della stessa molecola.

[6] Nota: Abbiamo usato totale PALM riflessione interna (TIR-PALM, Figura 1 e 5) per limitare l'attivazione ed eccitazione di un sottile strato (~ 200 nm) sopra la cella / vetro interfaccia. in modo che soltanto le molecole FtsZ associate con la membrana più vicino al coprioggetto sarà rilevato.

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Risultati

Illustrato in Figura 3Aiv è bidimensionale, super-risoluzione resa del Z-ring generato dal metodo di imaging PALM descritto sopra. Qui di seguito, riassumiamo informazioni qualitative e quantitative che possono essere ottenuti da esse.

Qualitativamente, abbiamo osservato che la Z-ring è una struttura irregolare che adotta più configurazioni (singola banda o arco elicoidale) che non sono distinguibili in tradizionali immagini di fluorescenza (confronta Figura 3A-Di...

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Discussione

Immagini PALM contengono informazioni sui conteggi molecola e posizioni all'interno di una cella, consente un'analisi dettagliata della distribuzione e la disposizione delle molecole proteiche bersaglio che è difficile da ottenere con altri mezzi. Di seguito si evidenzieranno le precauzioni che dovrebbero essere prese per estrarre informazioni quantitative precise, pur mantenendo la rilevanza biologica delle immagini PALM. Abbiamo anche esplorare le informazioni che possono essere meglio ottenuta utilizzando ce...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
50 x MEM Aminoacidi	Sigma	M5550
100 x MEM Vitamine	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46-102-RF
16% paraformaldeide	Electron Micrsocopy Scienze	15.710-S
SeaPlaque GTG agarosio	Lonzo	50111
50 nm Oro Perle	Microsfere-Nanosfere	790113-010
FCS2 Imaging Camera	Bioptechs
Fase Adattatore	ASI	I-3017
Microscopio invertito	Olimpo	IX71
NA 1,45, 60x Obiettivo	Olimpo
IXON EMCCD Camera	Andor Tecnologia	DU897E
488 nm Sapphire Laser	Coerente
561-nm Sapphire Laser	Coerente
405-nm Laser CUBE	Coerente