세균 본부 기계의 슈퍼 해상도 이미징

요약

우리는 박테리아 FtsZ-링의 구조 조직, 세포 분열에 필수적인 장치에 꼽는 영상 방법 수퍼 해상도를 설명합니다. 이 방법은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 이미지의 정량 분석​​에 기반을두고 있으며 다른 세균 cytoskeletal 단백질에 적용 할 수 있습니다.

초록

박테리아 세포 분열이 midcell ^1,2에서 열 개 이상의 필수 단백질의 조율 조립이 필요합니다. 이 과정의 중심은 부문 계획 ^3,4에서 FtsZ 단백질의 링과 같은 suprastructure (Z-링)의 형성이다. Z-링은 여러 단일 좌초 FtsZ의 protofilaments로 구성되어 있으며, Z-링 안쪽에 protofilaments의 배열을 이해하는 것은 힘 발전기 ^5,6 등 Z-링 조립 및 기능의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공 할 것입니다. 이 정보는 기존의 형광 현미경과 전자 현미경에 의한 전류 제한에 어려운 남아있다. 종래의 형광 현미경은 빛의 회절 한계 (~ 200 nm 정도)에 의한 Z-링의 고해상도 이미지를 제공 할 수 없습니다. 전자 cryotomographic 영상은 작은 C.에 FtsZ의 protofilaments을 분산 감지했습니다 crescentus 세포 ⁷ 만 같은 큰 전지에 적용하기 어려운대장균 또는 B. subtilis. 다음은 슈퍼 해상도 형광 현미경 방법의 응용 프로그램을 설명, Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)는 양적 E.의 구조적 조직을 특징하는 대장균 Z-링 ^8.

PALM 이미지가 모두 높은 공간 해상도 (~ 35 nm 정도) 및 대상 단백질의 모호 식별을 사용하려면 특정 레이블을 제공합니다. 우리는 405 nm의 ^9시에 활성화에 붉은 색 형광 (여기 = 561 nm의)에 녹색 형광 (여기 = 488 나노 미터)에서 전환 photoactivatable 형광 단백질 mEos2과 FtsZ을 표시. PALM의 실험이 진행되는 동안, 단일 FtsZ-mEos2 분자 stochastically 활성화되고 단일 분자의 해당 중심 위치는 <20 나노 미터 정밀도로 결정됩니다. Z-링의 슈퍼 해상도 이미지가 검색된 모든 FtsZ - mEos2 분자의 중심 위치를 중첩에 의해 재건되어 있습니다. <P 클래스 = "jove_content">이 방법을 사용하여, 우리는 Z-반지 ~ 100 nm의 고정 폭을 가지고 있으며 가로, 세로, 높이로 서로 겹쳐 FtsZ의 protofilaments의 느슨한 번들로 구성되어있는 것으로 나타났습니다. 이 데이터는 Z-링 ^(10)의 세포주기에 의존 변경의 추가 조사를위한 발판을 제공하고 관심을 다른 단백질에 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 변형 JB281의 단일 식민지로 LB 미디어의 예방 [BW25113 / pJB042 (P _라크 : FtsZ-mEos2)]. 37 흔드는에서 하루 아침에 성장 ° C.
2. M9에 ​​문화 1:1,000 ⁺ 최소한의 미디어 [M9 소금, 0.4 % 포도당, 2 MM MgSO _4, 0.1 MM CaCl _2, 가상 아미노산과 비타민]를 희석 중순 로그 단계 (= 0.2-0.3 OD _600)로 성장 실온 (RT)에서 chloramphenicol (150 μg / ML)의 존재 인치
3. 20 μM는 (주 # 1 참조) 2 시간에 IPTG와 문화를 유도.
4. 펠렛의 microcentrifuge (8,000 RPM, 1 분)의 문화와 M9 ^+의 동일한 볼륨에 resuspend, 반복. 두 번째 resuspension 후, 2 시간에 RT로 성장을 계속합니다.
5. 40 분 RT에서 PBS에 4 % paraformaldehyde (산도 = 7.4)로 유도 문화를 수정합니다. PBS의 동일한 볼륨에서 펠렛 문화와 resuspend, 반복. 영상 라이브 세포 경우, 동일한 볼륨으로 고정, 펠릿의 문화, resuspend을 건너 뛰M9의 ^- [M9 소금, 0.4 % 포도당, 2 MM MgSO _4, 0.1 MM CaCl _2, 가상 아미노산]; 반복.
6. resuspended 문화와 1시 10분 금 구슬을 희석. (단계 2.4 참조) 준비 이미징 챔버에 샘플을 적용합니다.

[1] 참고 : 위의 유도 프로토콜 (단계 1.1-1.3)이 변형 JB281의 표현 시스템에 최적화되었습니다. 자세한 유도 조건은 관심의 다른 표현 시스템 또는 단백질에 따라 다를 수 있습니다.

2. 이미징 챔버의 조립

1. ^- M9의 3 % (w / V) 아가로 오스 솔루션을 확인하십시오. 40 분을위한 벤치 톱 열 블록에 70에서 아가로 오스 ° C를 녹여. 저장소가 최대 5 시간까지 50 ° C에서 아가로 오스을 누그러 뜨렸다.
2. 아래로 향한 전극과 이미징 챔버의 상단 반으로 깨끗한 microaqueduct 슬라이드를 놓습니다. 재관류 채널을 커버 할만큼 microaqueduct 슬라이드 아래 근육을 맞 춥니 다.
3. 유리의 중앙에 녹은 아가로 오스의 ~ 50 μl을 적용슬라이드. 깨끗하고 마른 coverslip 즉시 상단 아가로 오스 겔 비말. 겔 30 분 동안 RT에서 더욱 강화 할 수 있습니다.
   1. coverslips를 청소하려면 : 세라믹 홀더에 coverslips을 주선하고 아세톤, 에탄올과 유리 병에 1M 코의 온천을 돌려 20 분 동안 sonicate. DH ₂ O.에서 하나의 sonication에 이어, 9 sonications의 총, 사이클을 세 번 반복 신선한 DH ₂ O.에서 청소 coverslips를 저장 사용하기 전에, 필터 공기 건조 coverslips을 날려 요.
4. 조심스럽게 microaqueduct 슬라이드에 젤 패드를두고, coverslip을 제거합니다. 바로 겔 패드의 상단에 세포 배양 샘플 1 μl (단계 1.6 참조)을 추가합니다. 솔루션은 젤 패드에 의해 흡수 될 수 있도록 ~ 2 분 기다리십시오. 새로운 깨끗하고 건조 coverslip으로 인기 젤 패드. 제조업체의 지침에 따라 전체 이미징 챔버를 조립.

3. 이미지 수집

1. 현미경, 카메라와 레이저를 켜십시오. MetaMorph 소프트를 엽니 다도자기 (분자 장치).
2. 이미지 경로에 적절한 여기 / 방출 필터 (그림 1)을 넣습니다.
3. 이에 따라 레이저 힘과 수집 설정을 설정합니다.
   1. 488 나노 미터 레이저 = 15 MW (참고 # 2 참조)
   2. 561 나노 미터 레이저 = 75 MW
   3. 405 나노 미터 레이저 = 2 MW ± 중립적 인 밀도 필터 (참고 # 3 참조)
4. 보완 무대 어댑터를 통해 무대로 이미징 챔버를 잠급니다.
5. homogenously 세 레이저 조명하는 적절한 이미지 지역 (100x100 픽셀)을 지정합니다.
6. 세포와 인접 해 fiducial 마커 (금 구슬)하지만, 중복 둘을 포함하는 샘플 영역을 식별합니다.
7. coverslip에 가장 가까운 세포의 표면에 초점을 맞 춥니 다. 50 MS 통합 시간와 하나 brightfield 이미지를 획득하고 (그림 3Ai) 샘플에 초점을 맞추고에게 0.5 μm 이동합니다.
8. 488-N에서 여기와 앙상블 녹색 형광 이미지를 취득 m 레이저 50 MS 통합 시간 (그림 3Aii)를 사용하여.
9. 405 나노 미터와 561 나노 미터 레이저에서 연속 조명과 붉은 색 채널에 스트리밍 비디오를 획득. 고정 셀의 경우 50 밀리 프레임 속도가 1,000 프레임 ~ 10 % 상승 (ramp) 405-nm의 레이저 전원과 20,000 프레임 (~ 17 분 총)의 총 (참고 # 4 참조)에 사용됩니다. 라이브 세포를 들어, 10 MS 프레임 속도는 일정한 405-nm의 레이저 전원에서 3000 프레임 (~ 30의 총)의 총에 사용됩니다.
10. 셀의 아래쪽 표면에 다시 포커스를 이동하고 단계 3.7에서와 같이 다른 brightfield 이미지를 획득.

[2] 참고 : 셀의 녹색 형광의 통합 강도가 셀에 표현 FtsZ-mEos2 분자의 총 수에 직접 비례합니다. 488 나노 미터의 여기 파워와 앙상블 형광 인수 설정은이 상대 FtsZ이 - mEos2 다른 셀의 표현 수준을 비교할 수 있도록 모든 셀에 대해 지속적으로 유지해야합니다.

ontent "> [3]. 참고 : 고정 셀이 각각의 분자가 정확하게 식별 할 수 있도록 속도가 느린 활성화 속도를 달성하기 위해 장소에서 중립 밀도 (ND) 필터 (그림 1, 광학 구성 요소 # 5)으로 이미징되는 회절 - 제한된 공간에서 동시에 활성화되는 두 분자의 낮은 확률을 유지하면서 영상은 세포가 활성화 속도를 높이기 위해 사는 ND 필터가 제거됩니다. 빠른 속도가 살고있는 셀 이미징에 적용되는 총 획득 시간을 줄일 필요합니다, 따라서 시간에 Z-링을 "동결"과 셀 photodamage의 효과를 제한.

[4] 참고 : 구입 한 프레임의 번호가 시스템에 대해 최적화되어 있으며 특정 세포 구조에 의존 한, 밀도를 라벨 인증 속도와 fluorophores의 전체 풀을 소진 여부는 분석에 중요합니다. 라이브 세포에서는 TI의 짧은 기간에 지역화의 충분한 수를 확보하는 것이 중요합니다내가 가능한 세포 구조의 움직임으로 인해 이미지의 흐리게을 방지합니다.

4. PALM 이미지 구축

1. 감지 된 각 영역의 중심 위치를 결정합니다.
   1. MATLAB (MathWorks, Inc의)로 이미지 스택을로드합니다.
   2. 모든 fiducial 구슬을 제외 한 셀 주위 영역에 이미지 스택을 자르세요.
   3. 배경 해발하지만, 평균 현장 강도 낮은 곳을 감지하기 위해 강도 임계 값을 선택합니다. 우리는 150 프레임 창을 사용하여 최대 강도의 실행중인 평균을 계산하여 실험을하는 동안 백그라운드 수준의 변화에​​ 대한 설명. 각 프레임에 대한 강도 기준 액은 다음 실행 평균 값에서 보정됩니다.
   4. 각 프레임에서 각각의 임계 값을 뺍니다. 예비 곳이 임계치를 넘는 농도 든 세 인접 픽셀로 표시되어 있습니다.
   5. 2 차원 Gaussia 각 예비 영역의 형광 강도에 맞게N 기능을 [수식 1] 비선형 최소 제곱 알고리즘 (그림 2)를 사용하여. 각 지점의 현지화 정밀도가 감지 광자의 총 개수 [수식 # 2]를 사용 계산됩니다. 현지화 정밀도을 가진 저조한 적합한 장소는 큰 20 나노 미터 (고정 셀) 또는 45 나노 미터 (라이브 세포) (참고 # 5 참조) 삭제됩니다. 중복 방사체로 인해 평균 강도의 두 배보다 큰 강도를 가진 곳은도 삭제됩니다.
   6. 고정 세포를 들면, 중심 위치를 45 나노 미터 이내의 거리에 있습니다 모든 지점을 경시하여 동일한 분자의 반복 관찰을 제거 6 프레임 이하하여 앞서 다른 곳의. 라이브 세포를 들어, 모든 장소가 유지됩니다.
2. fiducial 마커의 움직임을 사용하여 샘​​플 드리프트를 보정합니다.
   1. fiducial 마커 주위에 10x10 픽셀 영역 오려 내기.
   2. 각 프레임에서 4.1.3에서 결정된 각각의 임계 값을 뺍니다.
   3. 각 강도 프로필을 맞추기최소 제곱 피팅 알고리즘을 통해 프레임은 2 차원 가우스 모양을 가정.
   4. 1 프레임에 상대적으로 중심 위치 사이의 변위를 계산합니다.
3. 4.2 계산 적절한 샘플 드리프트와 4.1 식별 고유 한 각 분자의 중심 위치를 수정합니다. 3.7과 3.10에 인수 brightfield 이미지를 비교합니다. 세포 fiducial 마커에 상대적으로 이동 관찰하는 경우, 데이터는 밖으로 던져 수 있습니다.
4. 15x15 나노 미터 픽셀로 구성된 하나의 이미지에있는 모든 수정 된 중심 위치를 비교하십시오. 현지화 정밀 [수식 2]와 같은 표준 편차와 중심 위치에 중심 단위 지역, 2 차원 가우스 프로필로 각각의 독특한 분자 그리기. 픽셀의 강도가 해당 픽셀의 분자를 찾는 가능성 (그림 3Aiv)에 비례 확률 밀도지도에이 결과를 표시합니다.
5. 앙상블 이미지에 PALM 이미지를 비교.
   1. 정을 Replot4.4에서와 같이하지만, 150x150 nm의 픽셀 및 250 nm의와 같은 표준 편차와 비행기에 이드 위치. 이 3.8 (그림 3Aiii)에 인수 회절 - 제한된, 앙상블 이미지로 비교하는 데 사용할 수있는 회절 - 제한된 이미지를 모방 PALM 이미지를 생성합니다.
   2. 감지 분자가 전체 인구의 대표임을 확인하려면 두 이미지가 유사한 형태의 구조를 보여 확인하기 위해 실험 앙상블 형광 이미지 (그림 3Aii 단계 3.8)으로 복원 앙상블 이미지 (그림 3Aiii 단계 4.5.1)를 비교 , 오리엔테이션 및 상대 강도.

[5] 참고 : 필요한 최소 현지화 정밀도는 주어진 샘플에 대한 모든 분자의 precisions를 모의하고 적절한 차단을 선택하여 각각의 이미징 방법에 대해 경험적으로 결정되었습니다.

5. PALM 이미지 분석

1. Z-링 Widt 측정H와 직경.
   1. 수 있도록 수직 방향 세포의 긴 축 (그림 4A)에 PALM 이미지를 회전합니다.
   2. Z-링을 포함하는 세포 지역 오려 내기.
   3. 세포의 긴 축을 따라 강도 프로필을 투영하여 누적 강도를 계산할 수 있습니다.
   4. 가우스 분포에 강도 프로필을 맞 춥니 다. 링 너비가 된 가우스 분포의 전체 폭 반 최대 (FWHM) (그림 4B)로 정의됩니다.
   5. 셀의 짧은 축을 따라 5.1.2의 누적 강도 프로파일을 프로젝트. 링 직경은 강도 프로파일 (그림 4C)의 전체 길이로 정의됩니다.
2. (참고 # 6 참조) FtsZ 밀도를 음모를 꾸미고 있구나.
   1. (4.4)에서와 같이 중심 위치를 Replot하지만, 각각의 고유 한 분자가 1의 값을 부여하고 중심 위치에 해당하는 단일 픽셀에 할당되는 등의 가우스 프로필이없는. 각각의 이러한 방법으로, 강도픽셀은 픽셀에서 감지 분자의 총 수를 나타냅니다. 밀도 PALM 이미지는 윤곽 플롯 (그림 5E 호야)로 시각화 할 수 있습니다.
3. 공간 해상도를 결정.
   1. 이론적으로 - 달성 공간 해상도 : 검색된 모든 분자의 평균 결정 현지화 정밀도를 사용하여 전체 샘플에 대한 대표 PSF를 생성하고 FWHM을 (수식 # 3) 계산합니다.
   2. 실험적으로 - 달성 공간 해상도 : 같은 분자의 반복 관찰 사이의 평균 변위를 계산합니다.

[6] 참고 : 우리는 전지 / 유리 계면 위의 얇은 층 (~ 200 nm 정도)에 활성화 및 흥분을 제한하는 (티르-PALM, 그림 1, 5)의 총 내부 반사 PALM를 사용했습니다. 그래서 coverslip에 가장 가까운 막과 관련된 만 FtsZ 분자가 감지 될 것입니다.

결과

위에 설명 된 PALM 이미징 메서드에서 생성 된 Z-링의 2 차원, 슈퍼 해상도 렌더링은 그림 3Aiv에 도시. 아래에, 우리는 그들로부터 얻을 수 질적 및 양적 정보를 요약.

질적, 우리는 Z-반지 종래의 형광 이미지 (그림 3A-Dii와 IV를 비교)의 구별없는 여러 구성 (싱글 밴드 또는 나선형 아크) 채택 불규칙한 구조입니다 관찰했다. 다음과 같은 관찰은 특정 구조...

토론

PALM 이미지는 다른 방법으로 달성하기 어려운 목표 단백질 분자의 분포와 배열에 대한 자세한 분석을 수 있도록 분자 수와 세포 내 위치에 대한 정보가 들어 있습니다. 다음은 PALM 이미지의 생물학적 관련성을 유지하면서 정확한 정량적 정보를 추출하기 위해 이동해야합니다주의 사항을 설명합니다. 우리는 또한 최고의 라이브 대 고정 셀을 사용하여 얻을 수있는 정보를 탐색. 마지막으로, 우리?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약 / 재료의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
50 X 가상 아미노산	시그마	M5550
가상 비타민 100 X	시그마	M6895
IPTG	Mediatech	46-102 - RF
16 % Paraformaldehyde	전자 Micrsocopy 과학	15710-S
SeaPlaque GTG 아가로 오스	Lonzo	50,111
50 나노 미터 골드 비즈	마이크로 - Nanospheres	790113-010
FCS2 이미징 상공 회의소	Bioptechs
무대 어댑터	ASI	I-3017
역 현미경	하늘	IX71
1.45 NA, 60x 목표	하늘
IXON EMCCD 카메라	ANDOR 기술	DU897E
488-nm의 사파이어 레이저	응집성의
561-nm의 사파이어 레이저	응집성의
405 - 나노 미터 CUBE 레이저	응집성의