Conception expérimentale pour Laser Microdissection ARN-Seq: Leçons tirées d'une analyse du développement du maïs Feuille

Résumé

Many developmentally important genes have cell- or tissue-specific expression patterns. This paper describes LM RNA-seq experiments to identify genes that are differentially expressed at the maize leaf blade-sheath boundary and in lg1-R mutants compared to wild-type. The experimental considerations discussed here apply to transcriptomic analyses of other developmental phenomena.

Résumé

Les gènes ayant des rôles importants dans le développement ont souvent des profils d'expression spatialement et / ou temporellement restreint. Souvent, ces transcrits de gènes ne sont pas détectés ou ne sont pas identifiés comme étant différentiellement exprimés (DE) dans l'analyse du transcriptome d'organes de la plante entière. Laser Microdissection ARN-Seq (LM ARN-Seq) est un outil puissant pour identifier les gènes qui sont DE dans des domaines spécifiques de développement. Cependant, le choix des domaines cellulaires pour microdissect et comparer, et la précision des microdissections sont cruciales pour le succès des expériences. Ici, deux exemples illustrent des considérations de conception pour les expériences de transcriptomique; une LM analyse de l' ARN-seq pour identifier les gènes qui sont DE selon l'axe proximal-distal maïs feuille, et une seconde expérience pour identifier les gènes qui sont dans DE liguleless1-R (lg1-R) mutants par rapport au type sauvage. Les éléments clés qui ont contribué au succès de ces expériences ont été détaillées histologiques et situ analyses d' hybridation de la région à analyser, la sélection des primordiums de feuilles à un stade de développement équivalent, l'utilisation de points de repère pour sélectionner des régions morphologiques pour microdissection, et microdissection des domaines précisément mesurés. Ce document fournit un protocole détaillé pour l'analyse des domaines de développement en LM ARN-Seq. Les données présentées ici montrent comment la région sélectionnée pour microdissection aura une incidence sur les résultats obtenus.

Introduction

La feuille de maïs est un modèle idéal pour étudier la formation des champs de développement au cours de la morphogenèse, car il a une frontière distincte entre la lame et la gaine qui se prête à la dissection génétique (Figure 1A). Pendant les premiers stades de développement de la feuille, une bande linéaire de cellules plus petites, la bande de preligule (PLB), subdivise l'ébauche de feuille en pré-lame et pré-gaine domaines. Une ligule frange semblable et oreillettes triangulaires se développent à partir de la PLB (Figure 1A, C, D). écrans génétiques ont identifié des mutations qui perturbent la limite lame-gaine. Par exemple, liguleless1 récessive (LG1) mutations supprimer la ligule et oreillettes ^{1, 2, 3, 4} (figure 1B). L'hybridation in situ a révélé que la transcription lg1 accumule au PLB et ligule émergents, ce qui en fait un excellent marqueur pour le développement ligule ^{5, 6} (figure 1E).

Figure 1: type sauvage et liguleless1-R feuilles de maïs. (A) région limite Blade-gaine de maturité des feuilles de type sauvage montrant les structures de ligule et oreillette. (B) de la région de la frontière Blade-gaine mature liguleless1-R feuille montrant l' absence de structures de ligule et oreillette. Feuilles en A et B ont été coupés en deux le long de la nervure médiane. (C) longitudinale coupe de type sauvage feuille primordium. L'échantillon a été traité et colorées pour l'analyse histologique. Initier la ligule ressort comme une bosse en saillie par rapport au plan de la lame (pointe de flèche). (D) sect longitudinaleion par type sauvage feuille primordium. L'échantillon a été traité pour LM, comme décrit dans le texte. Arrowhead indique lancer ligule. (E) LG1 hybridation in situ de la tige latérale en coupe longitudinale de sommet en. Les astérisques indiquent l' accumulation de transcription lg1 au PLB du primordium P6 feuille. Les flèches indiquent la base de P6 primordium. Bar indique la mesure de la base de l'ébauche à la PLB. Les barres d'échelle en A et B = 20 mm. Les barres d'échelle dans CE = 100 um. Ce chiffre a été modifié depuis la référence ⁶ (Droit d' auteur Société américaine des biologistes végétaux). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Dans cette étude, LM ARN-Seq a été utilisée pour identifier un ensemble de gènes qui sont exprimés de manière différentielle (DE) à la limite lame-gaine par rapport à d'autres parties du primordium foliaire et Ide gènes ntifier qui sont dans des mutants DE lg1-R par rapport aux frères et sœurs de type sauvage. LM ARN-Seq est une méthode de quantification de l' accumulation du transcrit dans des cellules spécifiques ou des domaines cellulaires ^7. Les systèmes LM combinent un laser et un microscope avec un appareil photo numérique. tissus Sectionné est monté sur des lames et vu à travers le microscope. Le logiciel de LM comprend généralement des outils de dessin qui permettent à l'utilisateur d'esquisser une région sélectionnée pour microdissection. Les coupes laser le long de la ligne, et le tissu sélectionné est catapulté hors de la diapositive et dans un tube suspendu au-dessus de la diapositive. LM permet à l'utilisateur de microdissect domaines précis, y compris les couches de cellules spécifiques et même des cellules individuelles ^{8, 9.} L'ARN peut alors être extrait du tissu microdissection. Par la suite, le composant ARN-Seq utilise le séquençage de la prochaine génération à la séquence des banques d' ADNc générées à partir de l'ARN extrait ^10,= "xref"> 11.

Les principaux avantages de LM ARN-seq sont la capacité à quantifier l' accumulation des transcrits dans des domaines bien définis et la capacité de profiler l'ensemble transcriptome simultanément ^7. La technique est particulièrement adaptée à sonder les événements précoces du développement, où la région d'intérêt est souvent microscopique. Des études antérieures ont utilisé LM combiné avec la technologie des biopuces pour étudier les processus de développement dans les plantes ^{9, 12, 13.} ARN-Seq a l'avantage de quantifier les transcriptions à travers une large gamme dynamique, y compris les gènes de faible exprimés, et de l' information de séquence préalable est pas nécessaire ^{10, 11.} En outre, LM ARN-Seq a le potentiel de mettre en évidence les gènes importants pour le développement qui peuvent manquer dans les écrans de mutagenèse en raison de la redondance génétique ou à la létalité de la perte-ofmutant de fonction.

Gènes importants pour le développement, tels que sheath1 étroite (NS1) et en forme de cuvette de cotyledon2 (CUC2), ont souvent des profils d'expression spécifiques d'un seul ou de quelques cellules ^{17, 18, 19, 20.} Beaucoup sont exprimés seulement au cours des étapes précoces du développement et non pas dans l'organe mature. Lorsque des organes entiers ou de grands domaines sont analysés, ces transcrits spécifiques des cellules sont diluées et ne peuvent pas être détectées dans les analyses plus classiques. En permettant des analyses des domaines bien définis, LM ARN-Seq permet à ces gènes spécifiques de tissus à être identifiés et quantifiés.

Les facteurs cruciaux dans le succès des expériences décrites ici ont une analyse histologique approfondie qui a guidé la sélection de l'étape de développement approprié et le domaine de l'analyse, et MeasureMe précisent de domaines de cellules tissulaires pour LM. Pour veiller à ce que les domaines équivalents ont été échantillonnés pour toutes les répétitions, les tissus ont été recueillis à partir de primordiums foliaires au même stade de développement et les domaines microdissection ont été mesurés par rapport aux repères morphologiques telles que la ligule émergente (figure 2). Il est connu que certains gènes sont exprimés dans un gradient allant de la pointe à la base de la feuille. En mesurant les domaines précis, la variation due à l' échantillonnage à différents endroits le long de l'axe proximal-distal feuille a été maintenu à un minimum (figure 3A). Par microdissecting domaines de la même taille, la variation due à la différence de dilution des produits de transcription spécifiques de cellules a également été réduite (figure 3B). des sections longitudinales latérales du sommet de pousses ont été utilisées pour toutes microdissections. Ceux - ci sont des profilés qui sont perpendiculaires à l'axe de la nervure médiane marge (figure 4). En utilisant uniquement les sections qui incluent le SAM assure que les régions latérales équivalentes deprimordia foliaires sont analysés.

Dans les échantillons traités et sectionnés pour LM, le premier signe morphologique d'excroissance ligule est une bosse sur le côté adaxial en raison de divisions cellulaires périclines dans l'épiderme adaxiales (figure 1D, Figure 2). Il a été déterminé que la ligule émergente pourrait être identifié de manière fiable à plastochron 7 primordia foliaires de scène. Nous étions intéressés par les gènes exprimés dans toute la région, y compris le ligule ligule émergents et les cellules immédiatement distales qui formeront l'auricule. Afin de s'assurer que les pièces de tissus équivalents ont été faites, la bosse ligule a été utilisé comme point de repère morphologique et un rectangle de 100 um centrée sur la bosse ligule a été sélectionné pour LM (figure 2A, 2B). rectangles de taille équivalentes de pré-lame et pré-gaine ont été choisis parmi les mêmes primordia foliaires.

Les analyses des plantes mutantes ont présenté une liguleless challe différentnge; mutants lg1-R ne forment pas une ligule, donc cette fonctionnalité morphologique ne peut pas être utilisé pour sélectionner la région pour LM. Au lieu de cela, le domaine de l' accumulation de transcription lg1 dans de type sauvage primordiums foliaires a été déterminé, et une région qui engloberait ce domaine a été défini. Ces analyses préliminaires ont été effectuées sur des plants de la même plantation qui ont été utilisés pour l'analyse finale, puisque les travaux antérieurs ont montré que l'emplacement de la PLB varie en fonction des conditions de croissance. L'hybridation in situ a indiqué que les transcriptions LG1 accumulent dans la PLB de P6 primordiums foliaires (figure 1E). Nous avons choisi un domaine 400-900 um à partir de la base de la primordia feuille qui englobait le domaine d'expression lg1 (rectangles violets, figure 2A) et capturé ces régions équivalentes de type sauvage et les plantes lg1-R. Pour réduire au minimum la variation des conditions de fond et de croissance génétique lorsque l'on compare transcriptaset accumulation dans lg1-R et des plantes de type sauvage, ségrégation des familles de mutants et frères et sœurs de type sauvage ont été utilisés.

Protocole

NOTE: Fixer le tissu pour l'analyse histologique en même temps que le tissu est fixé pour LM. Examiner les coupes colorées pour caractéristiques morphologiques qui guideront plus tard LM. Lorsque l'on compare mutant au type sauvage, effectuer l' hybridation in situ ou immunolocalisation pour définir le domaine où le gène d'intérêt est exprimé (dans ce cas lg1).

1. Fixation des tissus et traitement

1. Cultivez appartements de plants de maïs à deux semaines vieux dans des conditions standard ^6.
2. Disséquer apex de pousse pour les sections latérales (figure 4).
   1. plantules d'accise juste au-dessous du niveau du sol.
   2. En utilisant une lame de rasoir, retirer les tranches minces de la base de la tige (coupe 1, la figure 4A) jusqu'à un ovale de chaumes entouré par une ou deux feuilles matures est visible (figure 4B).
   3. Faire une autre coupe d' environ 10 mm au- dessus de la base (coupé 2, figure 4A).Ce segment de 10 mm contiendra le SAM et les jeunes primordia foliaires.
   4. Tourner le segment de 10 mm de sorte que la base est orientée vers le haut. Faire deux entailles parallèles à l'axe latéral de sorte qu'une tranche de tissu 2-3 mm d' épaisseur est obtenue (coupes 3 et 4, la figure 4B). Jeter les deux parties extérieures et de retenir la tranche centrale pour la fixation et l'intégration.
      NOTE: Les feuilles extérieures peuvent être coupés et jetés.
3. Fixer le tissu et le processus d'intégration.
   1. Veiller à ce que tous les matériaux à utiliser dans les étapes suivantes sont RNase. Traiter la solution avec du pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) (1 ml de DEPC par litre de solution. Laisser incuber pendant une nuit avec agitation occasionnelle par secousses, et l'autoclave). Cuire la verrerie dans un four à 200 ° C ou plus pendant au moins 6 heures et traiter articles en plastique avec une solution de décontamination RNase.
   2. Jour 1: Immergez tranches de tissu dans ~ 10 ml de solution de Farmer (3: 1 de l'éthanol: acide acétique) en flacon de verre sur la glace. Après tous les échantillons ont été disséqués, appliquer VACUUm pour éliminer les bulles d'air et la pénétration de l'aide de fixateur. Tenir sous vide pendant 10 min puis relâchez le vide lentement. Remplacer fixateur et incuber à 4 ° C pendant la nuit en agitant doucement.
   3. Jour 2: Incuber dans la série suivante de solutions, ~ 10 ml chacune, 1 h chacune, toutes avec agitation douce; 85% d'éthanol à 4 ° C, 95% d'éthanol à 4 ° C, 100% d'éthanol à 4 ° C, 100% d'éthanol à 4 ° C, 100% d'éthanol à 4 ° C, 1: 1 éthanol: xylènes à la température ambiante, 100% de xylènes à la température ambiante, 100% de xylènes à la température ambiante.
      NOTE: Les xylènes sont toxiques par contact et inhalation. Travailler dans une hotte et utiliser des gants appropriés.
   4. Ajouter un tissu de paraffine enrobage des pastilles moyennes à environ la moitié du volume de xylènes et laisser incuber pendant une nuit à température ambiante sous agitation douce.
   5. Jour 3: Transférer le flacon à 60 ° C du four jusqu'à ce que les granulés fondent. Verser la solution et remplacer avec des produits frais tissu fondu milieu d'enrobage. Changez les deux moyennes plusieurs foisau cours de la journée.
   6. Jour 4: Changement tissu milieu d'inclusion une fois le matin. Retour à 60 ° C jusqu'à ce que le four après-midi.
4. blocs de fonte
   1. Placez les moules d'enrobage sur la plaque chaude de la station d'enrobage de tissus. Utilisez une pince pour transférer les échantillons de tissus aux moules d'enrobage avec la surface de coupe vers le bas. Compléter le moule avec de la paraffine fondue et placez l'anneau d'encastrement sur le dessus du moule. Transfert à une plaque froide jusqu'à ce que la paraffine a solidifié. Stocker les blocs de paraffine à 4 ° C dans un récipient hermétique avec du gel de silice.

2. Sectionnement et diaporama Préparation

1. Couper 10 sections um sur un microtome ^25.
2. Examiner les rubans et choisissez sections médianes. sections médians sont ceux qui comprennent le SAM, qui apparaît comme un dôme de cellules entourées de primordia foliaires.
3. sections de montage sur des lames.
   1. Placer les lames qui conviennent à LM (soit RNase libre oucuite) sur 42 ° C glisser plus chaud et appliquer plusieurs gouttes de solution d'éthanol à 50% pour couvrir la diapositive.
   2. Float sections sur une solution d'éthanol jusqu'à ce que les sections ont élargi.
      NOTE: Flottant sections sur la solution de l'éthanol plutôt que de l'eau maintient l'ARN dans un état précipité en réduisant la dégradation de l'ARN.
   3. Inclinez diapositive et éliminer la solution de l'éthanol en excès par aspiration avec une pipette de transfert jetable. Utilisez des lingettes non pelucheux pour évacuer toute solution d'éthanol supplémentaire.
   4. diapositives sec à 42 ° C pendant plusieurs heures ou toute la nuit. Magasin glisse à 4 ° C dans un récipient hermétique avec du gel de silice.
4. Déparaffiner glisse le jour de l'utilisation.
   1. Préparer trois bocaux en verre Coplin contenant; 100% de xylènes (I), les xylenes 100% de xylènes (xylènes II) et 100% d'éthanol (~ 50 ml de chaque solution).
   2. En utilisant des pinces propres pour le transfert des diapositives, Immerger les lames dans les xylenes I pendant 2 min, les xylènes II pendant 2 min et 100% d'éthanol pendant 1 min.
   3. vidange glissées sur des lingettes non pelucheux et l'air sec à la température ambiante.

3. Microdissection de Blade, ligule et gaine échantillons de plastochrone 7 Feuille Primordia

1. Fixer les diapositives sur scène de LM microscope. Utilisez cinq ou six diapositives pour chaque réplique, en utilisant cinq sections par lame.
   REMARQUE: Tissue mise en commun pour un seul répliquée est illustré sur la figure 5.
2. Examiner les lames et d'identifier les cinq sections les plus médianes sur chaque diapositive, en utilisant la SAM apex comme point de référence central.
   NOTE: Cela peut être fait à faible grossissement, généralement un objectif 5X est suffisante.
3. En utilisant 10X ou 20X objectif, identifier la position de la ligule de la feuille 7 plastochrone primordium de chaque section. La ligule sera visible comme une bosse en saillie de la surface adaxial de l'ébauche de feuille. Marquer cette position à l'aide de l'outil de dessin du logiciel LM; sélectionnez l'icône de crayon, déplacer le curseur sur la positi appropriéesur et cliquez et faites glisser la souris pour dessiner.
   NOTE: Un 10X ou un objectif 20X est approprié pour cela et les étapes ultérieures. Lors de l' utilisation des sections latérales, les deux faces de chaque ébauche de feuille sont présents dans chaque section (figure 2A).
4. Utilisation de l'outil de la règle et de l'outil de dessin rectangulaire, mesurer 100 um élevés rectangles centrés sur la ligule de chaque section (rectangles rouges, Figure 2A, 2B). Ceux-ci seront l'échantillon "Ligule".
   1. Pour utiliser l'outil de la règle; sélectionnez l'icône de la règle, déplacez le curseur à une extrémité de l'objet à mesurer, cliquez et faites glisser pour mesurer l'objet. La longueur de la règle sera affiché sur l'écran.
   2. Pour dessiner un rectangle; sélectionnez l'icône du rectangle, déplacez le curseur sur un point qui sera un coin du rectangle, cliquez et faites glisser pour dessiner un rectangle de la taille appropriée. Sinon, sélectionnez l'outil de dessin en ligne droite et tirer quatre lignes droites.
   3. Mesure 100 pm 50 pm rectangles positionnés au-dessus et au-dessous du rectangle "ligule".
      NOTE: Ce seront les "Blade" et des échantillons "gaine", respectivement (vert et bleu rectangles, Figure 2A, 2B). Sur la base de nos données histologiques, un rectangle de 100 um englobe la région de la ligule entier. taille des portions équivalentes de la lame et de la gaine ont été choisies pour faire en sorte que des quantités similaires de tissu ont été prélevés dans chaque cas. Écarteurs de 50 um ont été utilisés pour faire en sorte qu'aucun tissu région ligule est inclus par inadvertance dans la lame ou de la gaine microdissections.
5. Microdissect mesurée rectangles (figure 2D - 2F) ^{7, 8, 9,} collecte d' échantillons Ligule, lames et gaine dans des tubes séparés. Utilisez la fonction de découpe au laser pour couper à travers la section de tissu le long du contour du domaine sélectionné. Utilisez le cataFonction de pult pour propulser le rectangle de tissu de la lame et dans le couvercle du tube (figure 2D - 2F).

4. Microdissection de Blade, ligule et gaine adaxial épidermiques échantillons de plastochrone 7 Feuille Primordia

1. Sélectionnez sections et utiliser l'outil de règle pour mesurer 100 um élevés segments centrés sur la plastochron 7 ligule, tel que décrit dans la section 3 (ci-dessus).
   1. Sélectionnez uniquement les cellules épidermiques adaxiales de chaque 100 um haute "Blade" et "gaine" segment (vert et bleu sélections, figure 2C) en décrivant avec l'outil de dessin. L'épiderme est la couche cellulaire externe; le côté adaxial est le plus proche de la SAM.
   2. Pour l'échantillon "Ligule", sélectionnez uniquement les cellules de la ligule bosse émergents comme décrit dans la section 3.3 (sélection rouge, figure 2C).
2. Microdissect régions sélectionnées, la collecte Blade, Ligule et Sheae épiderme échantillons dans des tubes séparés, comme décrit dans la section 3.5.

5. Microdissection de plastochrone 6 Feuille Primordia de lg1-R et frères et sœurs de type sauvage

1. Cultivez ségrégation des familles de mutant (lg1-R) et les plantes de type sauvage.
2. Fix et processus pousse apex pour LM, comme décrit dans les sections 1.2-1.4. Correction de type sauvage et apex de pousses mutantes dans des flacons séparés afin de les garder séparés. Des échantillons provenant de la même plantation doivent être fixés et traités pour une hybridation in situ.
3. Déterminer où lg1 est transcrit dans la fratrie de type sauvage, en effectuant lg1 hybridation in situ ^{6, 26, 27.} Mesurer la position de l' accumulation de transcription lg1 de la base du primordium foliaire dans plusieurs échantillons (figure 1E).
4. Sur la base des données d'hybridation in situ, choisir la partie de la feuille primordium qui englobe la région où lg1 est transcrit. Dans ce cas, 400-900 um à partir de la base de plastochron 6 primordiums foliaires (rectangles violets, figure 2A).
5. Microdissect partie de primordiums foliaires sélectionnée, comme décrit dans la section 3.5, la collecte lg1-R et des échantillons de type sauvage dans des tubes séparés.

6. Appliquer l'ARN Extraction Buffer

1. Appliquer un tampon d'extraction d'ARN 50 ul de tissu microdisséquée et procéder à l'extraction de l'ARN. Continuer avec l' extraction de l' ARN, l'amplification d' ARN, construction de la banque, le séquençage et l' analyse bioinformatique comme décrit dans la référence ^6.

Résultats

En utilisant le schéma de LM décrit à la figure 2, environ 1,000,000-1,500,000 um ² de tissu ont été recueillies pour chaque répétition dans le tout-cell-couches LM (Figure 5), et 200 000 pm ² pour répliquer pour l'épiderme adaxial LM. Environ 2.500.000 um ² de tissu ont été recueillis pour chaque répétition dans la LM de primordia foliaires de type sauvage lg1-R et. Deux séries d'amplificat...

Discussion

La conception expérimentale est un facteur critique dans des expériences d'ARN-seq. Les principales considérations sont le domaine précis (s) et le stade de développement (s) à analyser, et quelles comparaisons seront faites. Il est crucial de penser en termes de comparaisons, puisque la sortie est généralement une liste de gènes qui sont DE entre deux ou plusieurs conditions. Comme avec toutes les expériences, il est important de modifier qu'une seule variable à la fois. Par exemple, lorsque l'on...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220	Used for RNase treatment of solutions
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	72000
RNase Zap	Sigma-Aldrich	R2020-250ML	RNase decontamination solution
Ethanol absolute 200 proof	Fisher Scientific	BP28184
Acetic acid, glacial	Sigma-Aldrich	A6283
Glass vials - 22 ml	VWR	470206-384
Xylenes, histological grade	Sigma-Aldrich	534056-4L
Paraplast plus	Sigma-Aldrich	P3683-1KG
Disposable base molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm	VWR	15154-072
Embedding rings	VWR	15154-303
Silica gel packets	Electron Microscopy Sciences	71206-01	Desiccant for storage of paraffin blocks
Oven	Fisher Scientific	15-103-0503	Oven must maintain temperature of 60 °C
Paraffin embedding station	Leica	EG1160
Microtome	Leica	RM2235
Slide warmer	Electron Microscopy Sciences	71317-10
Coplin jars	Electron Microscopy Sciences	70316-02
Laser microdissector	Zeiss
KIMWIPES™ Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34120	Lint-free wipes for wicking excess solutions from microscope slides
Membrane Slide 1.0 PEN	Zeiss	415190-9041-000	Slides for laser microdissection
Adhesive Cap 200 opaque	Zeiss	415190-9181-000	Tubes for laser microdissection
PicoPure RNA Isolation Kit	ThermoFisher Scientific	KIT0204