Application de la microscopie vitesse haut débit Super-résolution en direct cil primaire

Résumé

Récemment, nous avons cartographié les emplacements de spatiales en trois dimensions (3D) de voies de transport pour différentes protéines translocation à l’intérieur des cils primaires dans des cellules vivantes. Ici ce détails papier expérimental, le processus d’échantillons biologiques et les analyses de données pour la fluorescence 3D Super-resolution imaging approche nouvellement appliqués en live cils primaires.

Résumé

Le cil primaire est une saillie axée sur les microtubules sur la surface de nombreuses cellules eucaryotes et contient un complément unique de protéines cette fonction critique dans la motilité cellulaire et signalisation. Étant donné que les cils sont incapables de synthétiser ses propres protéines, près de 200 protéines ciliaires uniques doivent être victimes de la traite entre le cytosol et les cils primaires. Toutefois, il est toujours un défi technique pour mapper des lieux (3D) en trois dimensions des voies de transport pour ces protéines en direct cils primaires en raison des limites existant actuellement techniques. Pour conquérir le défi, récemment nous avons développé et utilisé une microscopie haute vitesse super-résolution 3D virtuel, appelée la microscopie monopoint bord-excitation auxiliaire diffraction (vitesse), pour déterminer l’emplacement dans l’espace 3D de voies de transport pour les deux cytosolique et les protéines membranaires des cils primaires de cellules vivantes. Dans cet article, nous allons démontrer la configuration détaillée de la microscopie de vitesse, la préparation des cellules exprimant les protéines ciliaires fluorescence-protéine-marquées, le suivi en temps réel de la molécule unique de protéines individuelles en direct CIL et la réalisation de densité de probabilité spatiale 3D cartes des itinéraires de transport pour les protéines ciliaires.

Introduction

Puisqu’a déclaré Ernst Abbe en 1873, la résolution de microscopie optique conventionnelle a cru être limitée à environ 200 nm en raison de la diffraction de la lumière de l’objectif^1,2. Actuellement, les techniques de microscopie photonique Super-résolution briser cette limitation et permettent la capture d’images dynamiques avec résolution diffraction subsidiaire (< 200 nm). Les techniques généralement entrent dans deux grandes catégories : stimulée par des approches d’émission épuisement (STED) microscopie basée, qui génèrent des diffraction sous illumination volume en raison de la réponse optique non linéaire de fluorophores à échantillons³; et microscopie photonique photoactivation (PALM) et microscopie de reconstruction optique stochastique (tempête)-techniques de Super-résolution, qui utilisent des fonctions mathématiques pour localiser le centre de gravité des fluorophores et ensuite reconstituer ces centroïdes basées sur pour former la Super-résolution images^4,5. Actuellement, en raison de la configuration optique relativement uncomplicated, PALM et tempête beaucoup travaillent en activant uniquement un petit sous-ensemble des fluorophores dans chaque image d’une vidéo longue d’une préparation biologique. Cela permet la localisation plus précise en 2D raccord gaussienne de la tache fluorescente, appelé la fonction de point propagation (PSF), de protéines marquées fluorescent dans chaque image de la vidéo. L’emplacement 2D de chaque molécule marquée fluorescent peut ensuite être superposé sur un seul plan d’imagerie pour produire une image de Super-résolution de la préparation biologique^1,2. Tandis que ces molécules simples de localisation, Super-résolution approches à la microscopie certainement a révolutionné la mode d’exécution de l’imagerie d’échantillons biologiques, il y a encore des défis à surmonter. Par exemple, STORM et PALM peuvent réaliser leurs meilleures résolutions spatiales après fixation d’échantillons biologiques et ainsi présenter une représentation statique des protéines fluorescent marqué, qui est une restriction semblable de la microscopie électronique. En outre, pour parvenir à une résolution spatiale élevée pour chaque protéine fluorescent marqué dans des cellules vivantes, des échantillons doivent être copiés à des framerates très longs qui sont incapables de saisir la dynamique des protéines. Par conséquent, il est nécessaire pour surmonter ces obstacles techniques principales.

Pour obtenir une haute résolution spatio-temporelle qui est bien adaptée pour détecter les protéines rapides ou ARN dans des cellules vivantes, nous avons développé la microscopie de Super-résolution vitesse dans notre laboratoire (Figure 1)^6,,^{7, 8}. plusieurs avancées techniques majeures en microscopie de vitesse précédemment nous ont permis de suivre avec succès les transport nucléocytoplasmique de petites molécules, protéines, ADN messagère et virus par native nucléaire pore complexes (NPC)^{6, 7 , 8}. en bref, les fonctionnalités suivantes de microscopie de vitesse seront utilisées pour suivre les macromolécules rapides par le biais de structures cône d’éclairage symétrique sous micromètre dans des cellules vivantes, telles que les PNJ et les cils primaires : (1) une tendance ou un l’éclairage vertical PSF permet l’excitation des molécules simples dans un volume de la petite limite de diffraction dans le plan focal (Figure 1) ; (2), les fibres discontinues de polyesters incliné peut éviter grandement fluorescence out-of-focus et donc d’améliorer le rapport signal-bruit. (3), la densité optique de 100 à 500 kW / cm² dans l’illumination PSF permet à des milliers de photons à collecter des fluorophores unique avec des vitesses de détection rapide (> 500 Hz). Vitesse de détection (4), le jeûne réduit aussi considérablement l’erreur de localisation spatiale de molécules simples (< 10 nm) pour déterminer les trajectoires spatiales des molécules fluorescentes en mouvement dans des cellules vivantes, car la diffusion moléculaire est l’un des principaux facteurs imperfections de la localisation de la molécule unique pour le déplacement des molécules à l’origine. Algorithmes de transformation (5) bien établie 2D à la 3D pour nous permettent de fournir des cartes de densité de probabilité spatiale 3D des itinéraires de transport pour les molécules dans le NPC ou cil primaire. Il convient de noter que notre processus de conversion entre le cartésien et le système de coordination cylindrique est utilisé pour générer un suivi de molécules simples densité de probabilité spatiale 3D carte plutôt que 3D (Figure 2). Auparavant, la microscopie électronique données ont révélé que le NPC^9,10 et le cil primaire¹¹ tous les deux ont une structure par rotation symétrique. En principe, diffusant au hasard des molécules se déplaçant à travers le NPC ou cil primaire devrait également avoir des distributions de cône d’éclairage symétrique. Comme illustré à la Figure 2, un nombre élevé de diffusion au hasard des molécules à l’intérieur de la bouteille générerait des distributions cône d’éclairage symétrique à la vue de coupe transversale que celle dans le NPC, encore ayant pour résultat une sensiblement uniforme spatiale distribution au sein de chaque sous-région infime entre deux anneaux voisins (Figure 2E). Cette répartition uniforme entraîne que la distribution spatiale le long de la dimension θ dans le système cylindrique est constante. Puis les coordonnées 3D (R, X, θ) peuvent être simplifiées pour les coordonnées 2D (R, X, constante). En fait, notre processus de conversion entre le cartésien et les systèmes cylindriques est de la 2D (X, Y) en 2D (R, X, constante). La constante θ, fait référence à la densité spatiale p dans la Figure 2E, est calculée en utilisant l’équation A.

En fin de compte, suivi de la molécule unique a large application dans la recherche biologique, il est donc naturel qu’une pléthore de techniques est développée pour remplir les niches biologiques spécifiques^12,13,14. Tel est le cas avec la microscopie de vitesse. Auparavant, lorsqu’il est couplé avec un algorithme de transformation 3D, cette technique a été développée pour résoudre les voies de transport 3D de molécules à travers les PNJ, une symétrie de révolution et sous-sous-diffraction-taille de la structure biologique⁶en transit. Dans cet article, cils primaires sont avérés organites excellent modèle aussi bien. Cils primaires sont des organites cylindriques, antenne-like (rayon de ~ 125 nm) qui projettent de la surface des cellules mammifères plus^15,16,17. Ils sont responsables de recevoir des signaux externes et de transmettre une réponse intracellulaire, généralement associée à la croissance et le métabolisme^15,16. Par conséquent, du flux des protéines structurales, recyclage des récepteurs transmembranaires et la transmission des messagers intracellulaires est des responsabilités vitales des cils primaires. À la jonction entre les cils primaires et le corps cellulaire est une barrière de sélectivité critique, appelée zone de transition ou TZ, grâce auquel tous les transports de cette protéine doivent avoir lieu à^{11,18,19, 20}. En plus de la fonction blocage de la TZ, au moins deux processus de transport, intraflagellaire transport et diffusion passive, sont considérés comme responsables de la circulation des protéines à travers cette région^16,,^{21, 22}. du point de vue de la santé humaine, la perte des cils primaires et déréglementation ultérieure de la signalisation en aval est caractéristique de nombreux cancers. En outre, beaucoup de maladies génétiques, comme le syndrome de Bardet-Biedl et maladie polykystique des reins, est associés à la protéine défectueuse transport²³. La taille limite de diffraction sous tant le processus complexe de transport des protéines sélectif par le biais de la TZ faire les cils primaires une cible de choix pour cette technique. Dans cet article des méthodes, nous allons démontrer le suivi d’une protéine transmembranaire ciliaire, récepteurs de la somatostatine 3 (SSTR3)²⁴, marquées extérieurement à Alexa Fluor 647 ainsi qu’une composante de l’IFT, IFT20²⁵, marquée avec une molécule GFP fusionnée.

Protocole

1. NIH-3 t 3 préparation de cellules pour la microscopie de vitesse du stock

1. 1,5 semaines avant l’expérience, récupérer une culture fraîche de NIH-3 t 3 cellules d’un stock congelé en dégel à 37 ° C et de transférer les cellules dans un flacon de culture cellulaire de² de 25 cm avec 3 mL de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium (DMEM) additionné de 110 mg/mL pyruvate de sodium, 2 mM de glutamine, sérum de veau fœtal 10 % et 1 % la pénicilline/streptomycine.
2. Incuber les cellules à 37 ° C dans une étuve à₂ CO 5 %.
3. Diviser les cellules à confluence de 80 %, environ tous les deux jours, au moins trois fois avant jour expérimentale afin d’assurer l’homogénéité du cycle cellulaire. Trypsinize des cellules avec de la trypsine de 0,25 % pendant 2 min à 37 ° C, aspirer la trypsine et remplacez-le par 2 mL de milieu. Pipette de la moyenne à plusieurs reprises à briser les agrégats cellulaires, enlever le nombre de cellules voulu et porter le volume total des médias en arrière jusqu'à 3 mL.
   NOTE : NIH-3 t 3 ont été précédemment génétiquement modifiées pour exprimer NPHP-4, une protéine qui se localise à la TZ²⁶, soudés à l’extrémité C terminale de mCherry. mCherry est un fluorophore qui peut être excité avec une illumination 561 nm quantitativement peut localiser la barrière de sélectivité TZ et orienter les cils primaires.
4. Deux jours avant l’expérience, plaque les cellules dans un fond de verre de 35 mm plat à la confluence de 60-70 % avec 1,5 mL du milieu même comme étape 1.1 et remettez les cellules dans l’incubateur.
5. Un jour avant l’expérience, transfecter chimiquement les cellules avec le plasmide désiré. Mélanger 500-1000 ng de plasmide désiré (voir la Note ci-dessous) dans un rapport de 1 : 2.5 avec le réactif de transfection dans 0,25 mL de médias de sérum réduit sans antibiotiques pour 30 min. médias d’aspirer de la 35 mm verre plat bas et remplacez-le par le plasmide de 0,25 mL / mélange de réactif de transfection plus une supplémentaire 1,25 mL de médias de sérum réduit sans antibiotiques. Médias de sérum réduit vise à faciliter une transfection réussie, induisant la croissance des cils primaires, ainsi que maintenir les cellules en vie assez longtemps pour réaliser expérience. Remettez les cellules dans l’incubateur pour l’expérience le lendemain.
   Remarque : Lorsque vous effectuez le suivi de simple-molécule de IFT20, un plasmide contenant qu'un IFT20 génétiquement modifiés soudés à son extrémité C terminale de GFP est utilisé²⁵. Lorsque vous effectuez la molécule unique suivi de SSTR3, un plasmide contenant un SSTR3 génétiquement modifiés soudés à son terminus de N à un domaine de peptide (AP) accepteur et C terminus à GFP est utilisé²². En plus de la construction de SSTR3, un plasmide contenant la ligase biotine BirA doit être exprimé conjointement et les médias de transfection doivent être complétées par 10 biotine µM. BirA joint puis biotine au domaine d’AP de molécules d’AP-SSTR3-GFP nouvellement synthétisées au niveau du re. Alexa647 conjugué à trois des quatre sites biotine-liaison streptavidine, en moyenne, peut ensuite être complété à la presse avant d’imagerie à fluorescent étiquette les molécules d’AP-SSTR3-GFP sur la surface externe de la cellule^22,27 . GFP et AlexaFluor647 sont utilisés dans cette méthode ; Toutefois, autres sondes fluorescentes peuvent servir s’ils ont de même photo-une stabilité élevée et quantum yield.
6. Si à l’aide de la construction SSTR3 marqués à l’extérieur, retirez le support du fond verre plat 1 h avant l’expérience, laver la cellule 5 fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajoute 1 mL de médias de sérum réduit additionné de 1 µM Alexa647 conjugués streptavidine.
7. Pas plus de 15 min avant l’expérience, retirez le support du verre plat fond et laver les cellules transfectées et marqués 5 fois avec 1 mL de PBS.
8. Placer 1 mL de tampon d’imagerie (20 mM HEPES, 110 mM KACO, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) dans le plat de fond de verre.
   Remarque : Dans la mémoire tampon d’imagerie, les cellules sont viables pour ne plus que 3 h. Par conséquent, seulement 2 h d’expériences sont effectuées sur chaque plat.

2. microscopie de vitesse

Remarque : La configuration de microscopie de vitesse comprend un microscope à fluorescence inversé équipé d’un objectif apochromatique de 1,4-NA 100 ×-immersion dans l’huile, 35 laser de He-Ne mW à 633 nm, 50 mW à l’état solide 488 nm et 561 nm lasers, un gain de multiplication sur puce charge-coupled device caméra et un progiciel de microscope pour l’acquisition de données et de traitement (Figure 1). Pour l’imagerie par voie individuelle, GFP, mCherry et Alexa647 sont excités par 488 nm, 561 nm ou lasers à 633 nm, respectivement. Pour le suivi de la molécule unique, éclairage point unique est utilisé pour suivre des molécules individuelles marquées fluorescent. Pour l’imagerie de fluorescence incidente, une lentille concave est placée dans le chemin d’illumination laser à étendre le faisceau dans un champ uniforme d’illumination. L’émission de fluorescence est recueillies par le même objectif, filtrée par un filtre dichroïque (405/488/561/635) et un filtre d’émission (405/488/561/635) et imagées avec la caméra CCD ci-dessus fonctionnant à 500 Hz pour le suivi de la molécule unique ou 2 Hz pour imagerie de fluorescence incidente.

1. Apposer la plaque de fond de verre sur la scène du microscope et localiser une cellule qui exprime bien les constructions désirées. Une fois qu’une cellule appropriée a été trouvée, aligner la tache NPHP4-mCherry à la base des cils primaires avec l’emplacement sur le plan d’imagerie qui correspond à l’éclairage seul point laser.
2. Capturer une image de fluorescence incidente de NPHP4-mCherry et IFT20-GFP ou AP-SSTR3-GFP en utilisant la fonction « Snap » dans l’onglet « Appareil photo » de la fenêtre de « Focus » commandes si vous utilisez le progiciel microscopie numérique (voir Table des matières).
   NOTE : Ces images agira comme une référence pour les emplacements de la molécule unique ultérieures.
3. Une fois que les images de référence sont obtenues, localement de réduire la concentration de molécules uniques marqués. Photo-eau de Javel le TZ avec 1 éclairage de laser mW pendant 20 s ou jusqu'à ce que l’intensité de la fluorescence est proche de celle de la fluorescence de fond.
   Remarque : Lorsque la concentration précise peut être contrôlée, 0,1-1 nM étiqueté molécules simples sont utilisés.
4. Pour se préparer pour le suivi de la molécule unique, réduire la puissance d’illumination laser à ~0.15 mW pour des molécules simples étiqueté avec GFP ou ~0.5 mW pour des molécules marquées avec Alexa647.
5. Dès que la puissance du laser et l’imagerie des paramètres sont ensemble, gain maximum et intensification et cadence de 2 ms, pour l’imagerie de la molécule unique, engager le laser éclairage approprié et d’enregistrer des non-photobleached, étiqueté molécules simples qui sont transportés par le biais de la région de photobleached de la TZ en cliquant sur le bouton « Stream » dans l’onglet « Appareil photo » de la fenêtre « Mise au point des commandes ».
   Remarque : Pas plus de 2 min de vidéo devraient être saisie afin de minimiser les effets de la dérive ciliaire à un niveau négligeable.
6. Après la capture de la vidéo de la molécule unique, traiter les vidéos à l’aide d’un algorithme d’ajustement gaussien 2D, telles que l’aperçu par le laboratoire de Gelles, qui justement se localise le centre de gravité de l’excitation de chaque molécule fibres discontinues de polyesters dans une zone englobante d’intérêt (AOI).
7. Sélectionnez tous les emplacements de la molécule unique avec une précision < 10 nm et rectifier le Centre des cils basé sur la distribution des molécules simples emplacements équipé d’une fonction gaussienne 2D.
   Remarque : En utilisant 2D pour l’algorithme de transformation 3D, les itinéraires 3D des itinéraires IFT20-GFP et AP-SSTR3 sont clairement montrées sur membrane axonème ou ciliaire ciliaire, respectivement.

3. 2D à 3D Transformation

1. Une fois plusieurs mille localisations pour transiter des molécules (signal/bruit ratio > 11) dans le CIL sont recueillies, sélectionnez l’axe longitudinal du CIL comme X-dimension. Faire un histogramme de dimension Y des emplacements et d’obtenir les sommes bin incréments de 10 nm.
   Remarque : La 2D à la 3D transformation peuvent être évalués à la main ou n’importe quel logiciel ou langage de programmation. Les auteurs ont mené à bien la transformation en Matlab et Python 2.7.

Résultats

Cette section illustre les données obtenues de l’exécution de microscopie de vitesse à la TZ de cils primaires pour étudier l’itinéraire de transport de SSTR3 relié par un linker externe de ~ 15 nm à Alexa647 (Figure 3A). Il a pour double objectif de la vérification de l’algorithme de transformation 3D. Alexa647 ne doit être l’étiquette de la surface extérieure du cil primaire et par conséquent, l’itinéraire de transpor...

Discussion

Ce protocole décrit l’application de la microscopie de vitesse pour le cil primaire, un organite cellulaire de signalisation qui est fortement tributaire de transport des protéines efficaces. Microscopie de vitesse peut fournir des emplacements (< 10 nm) pour des molécules marquées fluorescent haute résolution lorsqu’ils traversent l’éclairage seul point centré sur le TZ. Auparavant, il a été appliqué à l’étude de la protéine le trafic à travers les NPC^6,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 cm2 tissue culture dish	Corning	VV-01936-00
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher	15140122
Fetal bovine serum	ThermoFisher	10438018
DMEM	ThermoFisher	10566-016
OPTIMEM	ThermoFisher	31985062
Trypsin	ThermoFisher	25300054
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813-1PAK
Transit LT1	Mirus	MIR 2300
35 mm glass bottom dish	MatTek	P35GCOL-0-14-C
AlexaFluor 647-conjugated streptavidin	ThermoFisher	S21374
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
633 nm He-Ne laser	Melles Griot	25-LHP-928-249
561 nm solid state laser	Coherent	OBIS 561-50 LS
488 nm solid state laser	Coherent	1185053
Inverted fluorescence microscope	Olympus	IX81
1.4-NA 100× oil-immersion apochromatic objective	Olympus	UPLSAPO 100×
On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera	Roper Scientific	Cascade 128+
Dichroic filter	Semrock	Di01- R405/488/561/635-25x36
Emission filter	Semrock	NF01-405/488/561/635-25X5.0
Slidebook 6.0	Intelligent Imaging Innovations		digital microscopy software