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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cet article décrit les protocoles afin d’évaluer l’effet des protéines fluorescentes sur l’agrégation et la toxicité de l’expansion de polyglutamine mal repliées pour l’évaluation rapide d’une protéine fluorescente nouvellement indéterminée dans le contexte de reporters fluorescents.

Résumé

Pour l’enquête de localisation des protéines et du trafic à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes, chercheurs comptent souvent sur leur protéine d’intérêt à un journaliste fluorescent de fusion. La liste en constante évolution des protéines fluorescentes génétiquement encodés (FPs) présente aux utilisateurs plusieurs solutions de rechange en matière de conception de fusion fluorescent. Chaque FP possède des propriétés optiques et biophysiques spécifiques qui peuvent affecter les propriétés biochimiques, cellulaires et fonctionnelles les fusions fluorescent qui en résulte. Par exemple, plusieurs FPs tendent à former des oligomères non spécifiques qui sont susceptibles d’entraver la fonction de la partenaire de fusion. Malheureusement, seulement quelques méthodes existent pour tester l’impact des FPs sur le comportement du reporter fluorescent. Nous décrivons ici une méthode simple qui permet une évaluation rapide de l’impact d’images par seconde en utilisant les épreuves de toxicité polyglutamine (polyQ) dans la levure Saccharomyces cerevisiae. PolyQ-élargi la huntingtine protéines sont associées à l’apparition de la maladie de Huntington (MH), où la huntingtine élargie regroupe en oligomères toxiques et des corps d’inclusion. L’agrégation et la toxicité des expansions de polyQ chez les levures sont fortement tributaires des séquences flanquant la région polyQ, y compris la présence d’étiquettes fluorescentes, fournissant ainsi une plate-forme expérimentale idéale pour étudier l’impact des FPs sur le comportement de leurs partenaire de fusion.

Introduction

Étant donné que la caractérisation initiale de la protéine fluorescente verte (GFP) de Aequorea victoria1, une large palette de génétiquement encodé IPS ont été développés, permettant aux biologistes cellulaires de localiser et de suivre simultanément plusieurs événements/protéines cellulaires dans la vie des cellules de2,3. FPs proviennent de plusieurs organismes, de méduses, coraux, et par conséquent, Visualisez les propriétés biophysiques spécifiques qui détourner largement au-delà de leur spectre de fluorescence respectif. Ces propriétés incluent luminosité photostabilité et une tendance à oligomerize, entre autres,2,4. Sélection de monomère FPs est un aspect important dans la sélection d’une balise appropriée lorsque vous concevez un journaliste fluorescent, afin de minimiser les interactions inappropriées et altérations de la fonction de la partenaire de fusion et de maximiser l’efficacité de journaliste pour une étant donné le compartiment cellulaire4,5,6. Tandis que GFP a, au fil du temps, a été élaborée pour minimiser l’effet de l’ajout de la balise fluorescente à la fusion partenaire5,7,8, comment les nouvelles variantes FP effectuent par rapport à la GFP reste difficile à évaluer.

Peu de méthodes existe pour caractériser le comportement des FPs. La plupart d'entre eux comportent des essais des propriétés biophysiques des FPs en utilisant des approches biochimiques, tels que l’ultracentrifugation et gel filtration protocoles9,10,11,12. Ces méthodes ont la mise en garde de l’utilisation de FPs purifiée en solution, offrant une vision un peu dans leur comportement dans les cellules intactes. Le développement de l’offre de dosage du réticulum endoplasmique lisse (OSER) organisé une évaluation quantifiable de tendance FPs' à oligomerize la vie des cellules13 en testant la capacité du FPs surexprimée à réorganiser les tubules de réticulum endoplasmique dans OSER verticilles14. Cette technique peut détecter avec succès des changements entre monomères et oligomères variants de la GFP et autres FPs. Toutefois, il s’appuie principalement sur la surexpression dans les cellules transfectées transitoirement, et la quantification et l’analyse de l’image peuvent prendre beaucoup de temps à moins que la technique est adoptée comme une collecte automatisée des données et les flux de travail de l’analyse.

Afin de compléter ces approches, nous avons établi une analyse qui profite de l’effet des étiquettes fluorescentes sur la toxicité et l’agrégation des expansions polyQ dans levure15,16. L’expansion de l’étirement de polyQ avec plus de 36 se répète dans le premier exon du gène codage de que la protéine huntingtine (Htt) est associée à la maladie de Huntington17,18. L’expression d’étendue Httex1 dans les résultats de la levure dans une forte agrégation de la protéine Htt mal repliée, couplée à un défaut de croissance sévère. Fait intéressant, ces phénotypes sont fortement influencées par les séquences flanquant le tronçon de polyQ, y compris les FPs15,16. Il a été rationalisé que les différentes propriétés de FPs peuvent affecter différemment polyQ toxicité chez la levure. En effet, par rapport à GFP-like FPs, protéines fluorescentes rouges et leurs formes évoluées ont montré une toxicité et agrégation réduit16. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé afin d’évaluer l’effet de la prochaine génération de FPs sur la toxicité de polyQ et agrégation dans la levure. Ce dosage permet une analyse rapide et potentiellement forte teneur des variantes FP qui peut être utilisé en parallèle avec caractérisait auparavant techniques pour la caractérisation optimale de nouveau FPs et peut évaluer comment ils effectuent par rapport à la GFP.

Protocole

1. génération de nouveau fluorescent tag Httex1 Reporters pour une Expression dans la levure

Remarque : Cette section a été modifiée par le protocole de Jiang et al. 16 et Albakri et al. 19.

  1. Concevoir des amorces pour amplifier la séquence codant pour la protéine fluorescente ou intérêt par PCR. L’apprêt avant devrait inclure une séquence de chef de file pour aider l’enzyme de restriction pendant la digestion (GATC), suivie d’un site de restriction SpeI (ACTAGT) et 20 bases en aval de l’ATG (à l’exclusion des ATG) du gène protéine fluorescente d’intérêt. L’apprêt inverse devrait inclure la séquence de tête (GATC), suivie d’un site de restriction de SalI (GTCGAC) et le complément inverse de 20 bases en amont du codon stop de la séquence FP (y compris l’arrêt).
  2. En utilisant les amorces conçues à l’étape 1.1, effectuer la réaction de PCR utilisant un thermocycleur avec les paramètres suivants : chaleur à 95 ° C pendant 1 min et cycle à 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 2 min par Ko du produit PCR. Effectuer 18 cycles est ample.
  3. Exécutez la réaction PCR sur gel d’agarose (0,5 % en Tris-acétate-EDTA). Il faut une seule bande correspondant au diamètre du produit attendu. Isoler le fragment à l’aide d’un kit de purification de gel.
  4. Le protocole utilise un vecteur deex1 Htt transportant 25 (non toxique) et 72 (HD-associés, affichant une forte agrégation) polyQ se répète. Digérer les fragments PCR tant le vecteur avec des enzymes de restriction SpeI et SalI pendant 3 h à 37 ° C.
  5. Purifier le vecteur digéré en l’exécutant sur gel d’agarose comme dans l’étape 1.3.
  6. Purifier le fragment PCR digéré à l’aide d’un kit de purification de PCR.
  7. Ligaturer le fragment résultant de PCR digéré et p415 -GAL1-drapeau-25/T4 ligase (1 h à température ambiante) à l’aide de plasmides de 72QpolyQ1 . Utiliser une réaction de 10 µL (1 µL d’enzyme T4 1 µL de tampon de X 10, 6 µL du fragment PCR et 2 µL de vecteur).
  8. Transformer 2 µL de la réaction de ligature dans 50 µL d’Escherichia coli-cellules compétentes et les incuber sur glace pendant 30 min. Puis, choc thermique les cellules à 42 ° C pendant 30 s. Ajouter 1 mL de médias excroissance SOC et incuber à 37 ° C pendant 1 h dans un shaker. Plaque de 200 µL de la réaction sur une plaque de LB-agar contenant 100 ampicilline µg/mL. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
  9. Sélectionnez les trois colonies bactériennes individuelles, cultivez-les du jour au lendemain dans 3 mL de bouillon LB contenant 100 ampicilline µg/mL à 37 ° C dans un shaker et extraire l’ADN à l’aide d’un kit de purification de plasmide de plasmide.
  10. Vérifiez le plasmide en digérant 500 ng d’ADN à l’aide des enzymes de restriction SpeI et SalI pendant 1 h à 37 ° C et exécuter la réaction sur un gel d’agarose (0,5 % en Tris-acétate-EDTA). Il devrait y avoir deux bandes à la bonne taille du vecteur (~ 7 Ko) et l’insert (la taille varie selon le gène d’intérêt). Ensuite, vérifiez le plasmide par séquençage.
  11. Transformer le p415 -GAL1- plasmides - polyQ-FPdrapeaudans la souche de levure W303 suite à un protocole de transformation levure standard2.

2. repérer le dosage

  1. Ensemencer la levure clones comptable 25Q/72Q le tag avec le PC d’intérêt sur une gélose contenant des medias de sélection de levures (synthétique complet-SC sans leucine) avec le glucose comme source de carbone. Dans le même temps, aussi ensemencer 25Q/72Q-ymsfGFP pour servir de témoin positif.
    Remarque : 25Q/72Q des constructions qui ne contiennent pas une balise fluorescente ne sont pas toxiques et peuvent servir de témoin négatif.
  2. Incuber les plaques à 30 ° C pendant 2-3 jours.
  3. Sélectionnez jusqu'à trois colonies individuelles de la plaque.
  4. Inoculer 5 mL du SC additionné de 2 % de glucose comme source de carbone.
  5. Granule 200 µL de chaque culture au jour le jour et le laver 3 x avec stérile de l’eau distillée.
  6. Remettre en suspension les cellules dans un milieu SC contenant 2 % galactose comme source de carbone pour induire l’expression de fusions de polyQ. Incuber le galactose médias nuit à 30 ° C dans un agitateur de tube. Comme contrôle, répétez cette étape en utilisant les médias contenant du glucose.
  7. Le lendemain matin, égaliser la densité des cellules à une densité optique à 600 nm (OD600) de 0,2 à 100 µL de médias SC dans une plaque à 96 puits stérile.
  8. Préparer quatre dilutions quintuplé, passant de chaque échantillon avec de l’eau stérile par pipetage 20 µL de l’échantillon de l’ancien bien dans 80 µL des médias dans le prochain puits.
  9. Utiliser une levure épinglage outil pour repérer les cellules sur des géloses sélectives (contenant du glucose ou du galactose) et incuber à 30 ° C pendant 2 jours.
  10. Les plaques d’images avec un dispositif de documentation d’images.

3. quantification de la croissance des cellules dans un milieu liquide

  1. Préparer les cultures de cellules suivant étapes 2.1-2.5 du présent protocole.
  2. Mesurer l' OD600 à l’aide d’un spectrophotomètre.
  3. Diluer les cellules à une OD600 de 0,1 à 300 µL des médias dans une plaque à 96 puits.
  4. Exécuter chaque échantillon en triple exemplaire.
  5. Incuber la plaque dans un lecteur de plaque/incubateur avec agitation capacités. Définir le nombre d’échantillons, la température à 30 ° C, l’absorbance à 600 nm, la longueur des expériences à 24h et les intervalles de mesure 15 min, puis sélectionnez le mode d’agitation continu.
  6. Créer la courbe de croissance et de quantifier l’aire sous la courbe à l’aide de logiciels graphiques scientifiques. Le GraphPad Prism 7 est recommandé. Collez les données dans une table XY avec trois valeurs répétées. La courbe de croissance apparaît sous le dossier de graphiques sur le côté gauche. Afin de quantifier l’aire sous la courbe, sélectionnez analyser en haut à gauche, puis cliquez sur la surface sous la courbe dans les analyses XY.

4. fluorescence Microscopy

  1. Préparer les cultures de cellules suivant étapes 2.1-2.5 du présent protocole.
  2. Diluer les cellules 10 x en croissance médias et transfert 200 µL de chaque échantillon à 8 puits chambres d’imagerie.
  3. Image des cellules à l’aide d’un microscope confocal, équipé d’un objectif de Aprochromoat de Plan X 63 (1,4 NA) à température ambiante.
    Remarque : L’utilisation d’un microscope confocal est facultative. Un microscope à fluorescence grand-angulaire standard peut également être employé.
  4. Régler la puissance de trou d’épingle et laser pour l’acquisition d’image optimale. Étant donné que les agrégats de 72Q sont beaucoup plus lumineux que le signal de 25Q diffuse, il faut souvent utiliser un réglage différent d’acquisition entre les plasmides différents afin d’éviter la saturation du signal fluorescent.
  5. Traiter les images à l’aide de ImageJ20 ou un autre logiciel de traitement d’image. À cette étape, le pourcentage de cellules que l’agrégat d’affichage peut être calculé manuellement est souhaité.

5. dot Blot

Remarque : Dans ce protocole, tache de point est utilisée pour examiner les niveaux d’expression de protéine. Préparer les cultures de cellules suivant étapes 2.1-2.5 du présent protocole.

  1. Générer des lysats de protéines à l’aide de perles de verre dans le tampon de lyse (EDTA 1 mM, 100 mM Tris, pH 7,5 ; 200 mM NaCl ; 5 % de glycérol, dithiothréitol 1 mM [TNT]). Ajouter des inhibiteurs de protéase, le fluorure de phénylméthylsulfonyle (PSMF) de 4 mM et inhibiteur de la protéase cocktail, directement avant utilisation. 5 mL de la culture au jour le jour à pellets et il resuspendre dans 200 µL de perles de verre et 200 µL de tampon de lyse. Vortex 30 s pour 12 tours. Centrifuger à 12 000 g à 4 ° C pendant 10 minutes et recueillir le surnageant.
  2. Repérer une quantité égale de protéines totales sur une membrane de nitrocellulose, à l’aide d’un appareil de microfiltration. Prewet de la membrane avec du PBS et assembler l’appareil. Se connecter à une source de vide et vérifiez que les vis sont serrées. Allumer l’aspirateur et laisser le filtre de l’échantillon à travers la membrane par gravité.
  3. Bloquer la membrane dans le lait sans gras de PBS - 0.05 % Tween/5%.
  4. Incuber la membrane avec des anticorps anti-drapeau primaire durant la nuit à 4 ° C. L’anticorps monoclonal anti-Flag que M1 est recommandé.
  5. Laver la membrane 3 x pour 10 min chacun avec PSB - 0,05 % de Tween.
  6. Incuber la membrane avec un anticorps secondaire fluorescent étiqueté (anti-souris IgG) pendant 1 h à température ambiante dans le lait sans gras de PBS - 0.05 % Tween/5%.
  7. Laver la membrane 3 x 10 min avec PSB - 0,05 % de Tween.
  8. Image-tache à l’aide d’un système de documentation immunoblot.

Résultats

FPs ont différentes propriétés biophysiques, notamment leur tendance à oligomerize, qui peuvent affecter le comportement de leurs partenaires de fusion dans le cadre de reporters fluorescents. Ce protocole décrit une méthode simple, où plusieurs FPs peuvent être fusionnés à l’expansion de la polyQ toxique. PolyQ toxicité étant fortement dépendante des séquences flanquant l' étirement polyQ15, ce test permet de comparer rapidement et directement de ...

Discussion

Dans cet article, divers essais pour mesurer l’agrégation des expansions de polyQ Httex1 et leur effet sur la croissance de levure étaient employés comme modèle pour étudier comment les différents fluorescentes protéines modifient leurs partenaires en matière de fusion dans le cadre de reporters fluorescents . En utilisant une variante de la GFP (ymsfGFP) comme témoin positif, nous avons montré qu’il détecte des changements significatifs dans les polyQ toxicité et agrégation entre différentes...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude est soutenue par une subvention de fonctionnement des instituts de recherche en santé à M.L.D. et P.L. Le travail présenté ici est pris en charge par une attribution de fonds Leader John R. Evans de la Fondation canadienne pour l’Innovation et un fonds correspondant provenant du Fonds de recherche de l’Ontario à P.L. Y.J. est supporté par une maîtrise à la bourse de doctorat transfert du doyen de l’École Schulich de M dernière édition et en médecine dentaire à l’Université de Western Ontario. S.D.G. est soutenu par une bourse de doctorat du Canada de l’ALS.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency)New Englanfd BiolabC2987
SpeI-HFNew Englanfd BiolabR3133High fidelity enzymes are preferred
SalI-HFNew Englanfd BiolabR0138High fidelity enzymes are preferred
AgaroseFisher ScientificBP160
LB-AgarFisher ScientificBP1425
LB-BrothFisher ScientificBP1426
AmpicilinFisher ScientificBP1760
PfuUltra High-fidelity DNA PolymeraseAgilent Technologies600382
EPOCH2 microplate spectrophotometerBioTek Instruments incEPOCH2TC
Yeast Pin ReplicatorV&P Scientific inc.VP407AH
SPI imagerS&P Robotics inc.spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScanCarl Zeiss MicroscopyLSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambersFisher Scientific12565470
Bio-Dot apparatusBio-Rad1706545
Chemi Doc XRS+Bio-Rad1708265
anti-FLAG M1 antibodySigma-AldrichF3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibodyThermo A32727
Plasmid MiniPrep KitFisher ScientificK0503
Plasmid Gel extraction KitFisher ScientificK0831
PCR Purification KitFisher ScientificK0702
PrizmGraphPadN/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)Fisher ScientificBP13354

Références

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