효 모에 Polyglutamine 독성 분석 실험을 사용 하 여 퓨전 파트너에 형광 단백질의 영향

요약

이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.

초록

단백질 지 방화 및 라이브 셀 이미징 사용 하 여 매매의 수사에 대 한 연구는 종종 형광 기자에 게 관심사의 그들의 단백질을 융합에 의존 합니다. 끊임없이 진화 목록이 유전자 인코딩된 형광 성 단백질 (FPs) 형광 퓨전 디자인에 관해서 여러 대안을 가진 사용자를 선물 한다. 각 FP는 특정 광학 및 생물 속성이 결과 형광 융해의 생화학, 세포, 및 기능 속성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 여러 FPs 융합 파트너의 기능에 방해에 취약 일반 올리고를 형성 하는 경향이 있다. 불행히도, 몇 가지 방법만 형광 기자의 행동에 FPs의 영향을 테스트 위해 존재 합니다. 여기, polyglutamine (polyQ) 독성 분석 실험을 사용 하 여 신진 효 모 Saccharomyces cerevisiae에 FPs의 영향의 급속 한 평가 가능 하 게 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 확장 huntingtin 단백질 확장된 huntingtin 독성 올리고 포함 시체로 집계 Huntington의 질병 (HD)의 증상과 연결 됩니다. 집계 및 효 모에 polyQ 확장의 독성은 높은 FPs의 행동에 미치는 영향을 공부 하는 이상적인 실험 플랫폼을 제공 하는 형광 태그의 존재를 포함 하 여 polyQ 지역 측면 시퀀스에 따라 그들의 퓨전 파트너입니다.

서문

이후 Aequorea 빅토리아¹, 유전자 인코딩된 FPs의 넓은 팔레트에서에서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 초기 특성을 개발 하 고, 허용 동시에 지역화 및 추적 세포 생물학 여러 생활에서 셀룰러 이벤트/단백질 세포^2,3. FPs는 산호, 그리고 그러므로, 표시 특정 생물 속성을 광범위 하 게 그들의 각각 형광 스펙트럼 넘어 전환에 해파리에서 여러 유기 체에서 파생 됩니다. 이러한 속성에는 밝기, photostability, 및 다른 사람의 사이에서 oligomerize^2,4경향이 포함 됩니다. 부적절 한 상호 작용 및 융합 파트너의 기능 변경 최소화 하 고 대 한 기자 효율 극대화 형광 기자를 설계할 때 적합 한 태그의 선택에 중요 한 측면 이다 단위체 FPs를 선택 하는 주어진 세포 구획^4,,56. GFP는, 시간이 지남에 진화 되었습니다 융합 파트너^5,,78형광 태그를 추가 하는 효과 최소화 하기 위해 하는 동안 GFP 남아 평가 하기 어려운 새로운 FP의 변종에 비해 수행 하는 방법.

FPs의 동작에 몇 가지 방법이 존재 한다. 그들의 대부분 ultracentrifugation 같은 생 화 확 적인 방법을 사용 하 여 프레임의 생물 속성 테스트를 포함 하 고 젤 여과 프로토콜^9,10,,1112. 이러한 메서드는 그대로 셀에 그들의 행동에 약간의 통찰력을 제공 하는 솔루션에서 순화 된 프레임을 사용 하 여 경고. 조직된 부드러운 바인딩과 그물 (OSER) 분석 결과 제공의 개발 FPs' 경향이 생활에서 oligomerize의 정량 평가에 떠다니고 그물 tubules를 재구성 overexpressed FPs의 능력을 테스트 하 여¹³ 세포 OSER whorls¹⁴. 이 기술을 성공적으로 GFP의 단위체 및 oligomeric 변형 및 다른 프레임 간의 변화를 감지할 수 있습니다. 그러나, overexpression 뚜렷이 transfected 세포에 주로 의존 하 고 정량 및 이미지 분석 시간이 걸릴 수 기술을 자동화 된 데이터 수집 및 분석 워크플로우로 채택 하지 않는 한.

이러한 접근을 보완 하기 위해 효 모^15,16에서 독성에 형광 태그의 효과 및 polyQ 확장의 집계의 이용 하는 분석 결과 설립 했습니다. 이상 36와 polyQ 스트레치의 확장 huntingtin 단백질 (Htt)이 헌팅턴 병^17,18연관 유전자 인코딩 첫 번째 엑손에서 반복 됩니다. 가혹한 성장 결함을 결합 misfolded Htt 단백질의 강한 집계에 효 모 결과에 확장된 Htt^{e x 1} 의 식입니다. 흥미롭게도,이 고기 FPs^15,16를 포함 하 여 polyQ 스트레치 측면 시퀀스에 의해 강하게 좌우 된다. 그것은 프레임의 다른 속성 polyQ 독성 누 룩에 영향을 미칠 차동 수 합리화 했다. 실제로, GFP 같은 FPs에 비해 붉은 형광 단백질 및 그들의 진화 형태 나타났습니다 감소 독성 및 집계¹⁶. 이 원고는 polyQ 독성과 효 모에 집계에 FPs의 다음 세대의 효과 평가 하기 위해 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 이 분석 결과 이전 특징을 동시에 사용할 수 있는 FP의 변종의 신속 하 고 잠재적으로 하이 콘텐츠 분석에 대 한 새로운 FPs 고 수의 최적의 특성에 대 한 기술 평가 어떻게 그들이 수행 GFP에 비해 수 있습니다.

프로토콜

1. 새로운 붙일 태그가 Htt^ex1 효 모에는 식에 대 한 기자 들의 세대

참고:이 섹션은 프로토콜에서에 의해 수정 된 장 외. ¹⁶ 및 Albakri 외. ¹⁹.

1. 형광 단백질 또는 PCR에 의해 관심을 인코딩 순서를 증폭 하는 뇌관 디자인. 앞으로 뇌관 리더 시퀀스 소화 (GATC) 동안 제한 효소 SpeI 제한 사이트 (ACTAGT) 및 관심사의 형광 단백질 유전자의 ATG (ATG 제외)의 하류 20 기초를 지원 하기 위해 포함 되어야 합니다. 반전 뇌관 사리 제한 사이트 (GTCGAC)와 (를 포함 하 여 중지) FP 시퀀스의 정지 codon의 상류 20 기지의 반전 보수 지도자 시퀀스 (GATC)를 포함 해야 합니다.
2. Thermocycler는 다음 설정을 사용 하 여 PCR 반응을 수행 단계 1.1에서에서 설계 하는 뇌관을 사용 하 여: 1 분 및 30 주기 95 ° C에서 95 ° C에 열 s, 60 ° C 30에 대 한 s, 그리고 PCR 제품의 kB 당 2 분 동안 72 ° C. 18 주기를 수행 하는 것입니다 충분 한.
3. (트리 스-아세테이트-EDTA에 0.5%)는 agarose 젤에 PCR 반응을 실행 합니다. 단일 밴드가 예상된 제품 크기에 해당 한다. 분리 젤 정화 키트를 사용 하 여 조각.
4. 프로토콜 사용 하 여 25 (저온)를 들고 Htt^ex1 벡터 및 72 polyQ 반복 (HD-관련 된, 강한 집계를 표시). PCR 파편 및 벡터 3 h 37 ° c.에 대 한 SpeI 및 사리 금지 효소로 소화
5. 1.3 단계 에서처럼 agarose 젤에 그것을 실행 하 여 소화 벡터를 정화.
6. PCR 정화 키트를 사용 하 여 소화 PCR 파편을 정화.
7. 선 결과 소화 PCR 파편 및 p415-GAL1-플래그-25/72QpolyQ 플라스 미드¹ T4 리가 (실 온에서 1 h)을 사용 하 여. 10 µ L 반응 (T4 효소의 1 µ L, 10 X 버퍼의 1 µ L, PCR 파편의 6 µ L 및 벡터의 2 µ L)을 사용 합니다.
8. 대장균의 50 µ L로 결 찰 반응의 2 µ L 변환-유능한 세포와 30 분 동안 얼음에 그들을 품 어. 다음, 열-충격 30 42 ° C에서 셀 s. 추가 SOC 파생물 미디어의 1 mL 및 통에 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어. 100 µ g/mL 암 피 실린을 포함 하는 파운드-한 천 격판덮개에 반응의 200 µ L 플레이트. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어.
9. 3 개인적인 세균성 식민지를 선택 하 고 파운드-국물 통에 37 ° C에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함의 3 mL에서 하룻밤 성장 플라스 미드 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 DNA를 추출.
10. 500을 소화 하 여 플라스 미드를 확인 실행 반응 agarose 젤 (트리 스-아세테이트-EDTA에 0.5%)에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 SpeI 및 사리 제한 효소를 사용 하 여 DNA의 ng. 벡터 (~ 7 kb) 및 삽입의 오른쪽 크기에 두 밴드 해야 (크기는 관심사의 유전자에 따라 다름). 다음, 연속으로 플라스 미드를 확인 합니다.
11. p415-GAL1-누 룩 스트레인 W303 표준 효 모 전이 프로토콜²다음으로플래그-polyQ FP 플라스 미드를 변환.

2. 분석 결과 보 이나

1. 줄무늬 누 룩 운반 25Q/72Q 태그의 탄소 원으로 포도 당을 효 모 선택 미디어 (합성 완료-SC 신 없이)을 포함 한 천 배지에서 FP와 함께 복제 합니다. 동시에 또한 25Q/72Q-ymsfGFP 긍정적인 통제 역할을 행진.
   참고: 형광 태그를 포함 하지 않는 25Q/72Q 구문 독성 되지 않습니다 하 고 부정적인 제어 될 수 있습니다.
2. 2-3 d 30 ° C에서 번호판을 품 어.
3. 접시에서 최대 3 개의 단일 식민지를 선택 합니다.
4. 탄소 소스로 2% 포도 당으로 보충 하는 SC의 5 mL 접종
5. 각 숙박 문화의 200 µ L 작은 및 그것을 씻어 3 x 살 균 증류수.
6. 사우스 캐롤라이나 미디어 polyQ 융해의 표현을 유도를 탄소 원으로 2% 갈 락 토스를 포함 하는 셀 resuspend 미디어 튜브 회전에서 30 ° C에서 하룻밤 갈 락 토스를 품 어. 컨트롤, 포도 당 포함 된 미디어를 사용 하 여이 단계를 반복 합니다.
7. 다음날 아침, 맞춰야 600에서 광학 밀도를 셀 밀도 살 균 96 잘 접시에 SC 미디어의 0.2에서 100 µ L의 nm (OD₆₀₀).
8. 4 준비 다음 우물에 있는 미디어의 80 µ L로 잘 이전에서 샘플의 pipetting 20 µ L에 의해 살 균 물으로 각 샘플의 오부 희석.
9. 효 모 고정 도구를 사용 하 여 선택적 접시 (포도 당 또는 갈 락 토스를 포함 하는)에 셀 고 2 d 30 ° C에서 품 어.
10. 이미지 문서 장치 판 이미지.

3. 액체 문화에서 세포 성장의 정량화

1. 세포 배양,이 프로토콜의 다음 단계 2.1-2.5를 준비 합니다.
2. OD₆₀₀ 는 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 합니다.
3. 96 잘 접시에 미디어의 300에서 0.1 µ L의 OD₆₀₀ 셀을 희석.
4. 3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.
5. 떨고 기능 플레이트 리더/인큐베이터에 접시를 품 어. 600에서 샘플, 30 ° C에서 온도, 흡수도의 수를 설정 nm, 24 h, 실험 및 15 분을 선택 연속 진동 모드 측정 간격의 길이.
6. 성장 곡선을 만들고 과학적인 그래프 소프트웨어를 사용 하 여 곡선 아래의 영역을 계량 합니다. GraphPad Prism 7 것이 좋습니다. 3 복제 값으로 XY 테이블에 데이터를 붙여 넣습니다. 성장 곡선 그래프 폴더 왼쪽에 표시 됩니다. 곡선 아래의 영역을 계량, 왼쪽 상단에 분석 을 선택 하 고 곡선 아래의 영역 XY 분석을 클릭 합니다.

4. 형광 현미경 검사 법

1. 세포 배양,이 프로토콜의 다음 단계 2.1-2.5를 준비 합니다.
2. 셀 10 희석 성장 미디어와 전송 200 µ L 8 잘 이미징 챔버에 각 샘플의 x.
3. 실 온에서 63 X 계획 Aprochromoat 목표 (1.4 없음)을 갖춘 공초점 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지.
   참고: 공초점 현미경의 사용은 선택 사항. 표준 넓은 분야 형광 현미경도 사용할 수 있습니다.
4. 최적의 이미지 수집을 위한 작은 구멍 및 레이저 파워를 조정 합니다. 72Q 집계 확산 25Q 신호 보다 훨씬 밝은 때문에, 형광 신호 포화를 방지 하기 위해 다른 플라스 미드 사이 다른 수집 설정을 사용 하려면 종종 필요 합니다.
5. ImageJ²⁰ 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 처리 합니다. 이 단계에서 디스플레이 집계 수동으로 계산할 수 있습니다 셀의 비율은 원한다.

5. 점 오 점

참고:이 프로토콜에 점 오 점 단백질 표정 수준 검사에 사용 됩니다. 세포 배양,이 프로토콜의 다음 단계 2.1-2.5를 준비 합니다.

1. 단백질 lysates 유리 구슬 (100 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 1 m m dithiothreitol [DTT]) 세포의 용 해 버퍼에서 사용 하 여 생성 합니다. 프로 테아 제 억제제, 4 mM phenylmethylsulfonyl 불 (PSMF)와 프로 테아 제 억제 물 칵테일, 직접 사용 하기 전에 추가 합니다. 야간 문화의 5 mL을 작은 고 유리 구슬의 200 µ L에 세포의 용 해 버퍼의 200 µ L resuspend. 12 라운드에 대 한 소용돌이 30 s. 10 분 동안 4 ° C에서 12000 x g 에서 centrifuge 고는 상쾌한을 수집 합니다.
2. 장을 기구를 사용 하 여 니트로 멤브레인에 총 단백질의 동일한 금액을 자리. PBS 가진 막 prewet 하 고 기구를 조립. 진공 소스에 연결 하 고 나사 강화 있는지 확인 하십시오. 켜고 진공 중력에 의해 멤브레인을 통해 샘플 필터를 하자.
3. PBS-0.05 %Tween/5% 지방 없는 우유에 막을 차단 합니다.
4. 4 ° c.에 하룻밤 기본 안티 플래그 항 체로 막 품 어 단일 클로 널 반대로 플래그 m 1이 좋습니다.
5. 3 막 씻고 PSB-0.05% 트윈으로 각 10 분 x.
6. 붙일 레이블된 이차 항 체 (반대로 마우스 IgG) PBS-0.05 %Tween/5% 지방 없는 우유에 실 온에서 1 h와 막 품 어.
7. 막 PSB-0.05% 트윈와 3 x 10 분 워시.
8. 이미지-오 점 immunoblot 문서 시스템을 사용 하 여.

결과

FPs는 다른 생물 속성, oligomerize에 그들의 추세를 포함 하 여 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 융합 파트너의 동작에 영향을 미칠 수 있다. 이 프로토콜에는 여러 FPs 독성 polyQ 확장을 융합 하는 수 있는 간단한 방법을 설명 합니다. PolyQ 독성 측면 polyQ 스트레치¹⁵시퀀스에 상당히 의존 때문에,이 분석 결과 형광 polyQ 퓨전 기자 (그림 1)?...

토론

이 문서에서는, Htt^ex1 polyQ 확장 및 효 모 성장에 미치는 영향의 집계를 측정 하기 위해 다양 한 분석 공부 어떻게 다른 형광 모델로 채택 되었다 단백질 형광 기자 들의 맥락에서 그들의 퓨전 파트너 변경 . 우리이 polyQ 독성 및 집계 다른 형광 태그 사이 상당한 변화를 감지 하 고 polyQ FP 퓨전 성능에 대 한 직접적이 고 빠른 비교에 대 한 수 보여 긍정적인 컨트롤로 GFP 변형 (ymsfGFP)를 사용 하 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency)	New Englanfd Biolab	C2987
SpeI-HF	New Englanfd Biolab	R3133	High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF	New Englanfd Biolab	R0138	High fidelity enzymes are preferred
Agarose	Fisher Scientific	BP160
LB-Agar	Fisher Scientific	BP1425
LB-Broth	Fisher Scientific	BP1426
Ampicilin	Fisher Scientific	BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase	Agilent Technologies	600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator	V&P Scientific inc.	VP407AH
SPI imager	S&P Robotics inc.	spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan	Carl Zeiss Microscopy	LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers	Fisher Scientific	12565470
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+	Bio-Rad	1708265
anti-FLAG M1 antibody	Sigma-Aldrich	F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody	Thermo	A32727
Plasmid MiniPrep Kit	Fisher Scientific	K0503
Plasmid Gel extraction Kit	Fisher Scientific	K0831
PCR Purification Kit	Fisher Scientific	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Fisher Scientific	BP13354