Effetto di proteine fluorescenti su Fusion partner utilizzando saggi di tossicità di Polyglutamine in lievito

Riepilogo

Questo articolo descrive i protocolli per valutare l'effetto di proteine fluorescenti sull'aggregazione e la tossicità di polyglutamine misfolded espansione per la valutazione rapida di una proteina fluorescente appena atipico nel contesto del reporter fluorescenti.

Abstract

Per l'indagine di localizzazione della proteina e il traffico usando la formazione immagine di cellule vive, i ricercatori spesso si affidano loro proteina di interesse ad un reporter fluorescente di fusione. L'elenco in continua evoluzione delle proteine fluorescenti geneticamente codificate (FPs) presenta agli utenti con diverse alternative quando si tratta di design fusion fluorescente. Ogni FP ha specifiche proprietà ottiche e biofisiche che possono influenzare le proprietà biochimiche, cellulari e funzionali delle fusioni fluorescente risultante. Per esempio, parecchi FPs tendono a formare oligomeri non specifici che sono suscettibili di ostacolare la funzione del partner di fusione. Purtroppo, solo pochi metodi esistono per testare l'impatto di FPs sul comportamento del reporter fluorescente. Qui, descriviamo un metodo semplice che permette la rapida valutazione dell'impatto della FPs utilizzando poliglutammina (polyQ) saggi di tossicità nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Proteine di huntingtin PolyQ espanso sono associati con l'insorgenza della malattia di Huntington (HD), dove l'huntingtina espanso vengono aggregati in oligomeri tossici e corpi di inclusione. L'aggregazione e la tossicità di poliQ espansioni in lievito sono altamente dipendente sulle sequenze fiancheggianti la regione di poliQ, compresa la presenza di tag fluorescente, fornendo così una piattaforma sperimentale ideale per studiare l'impatto di FPs sul comportamento dei loro partner di fusione.

Introduzione

Poiché la caratterizzazione iniziale della proteina fluorescente verde (GFP) da Aequorea victoria¹, un'ampia tavolozza di FPs codificato geneticamente sono stati sviluppati, permettendo i biologi delle cellule localizzare e monitorare contemporaneamente più eventi/proteine cellulari in vita cellule^2,3. FPs sono derivati da organismi multipli, da meduse di corallo e pertanto, visualizzazione specifiche proprietà biofisiche che deviare ampiamente di là di loro rispettivo spettro fluorescente. Queste proprietà includono luminosità, fotostabilità e una tendenza a oligomerizzazione tra gli altri^2,4. Selezionando monomerico FPs è un aspetto importante nella selezione di un tag adatto quando si progetta un reporter fluorescente, per minimizzare interazioni inappropriati e alterazioni della funzione del partner di fusione e massimizzare l'efficienza di reporter per un dato il compartimento cellulare^4,5,6. Mentre GFP è, nel tempo, stato evoluto per ridurre al minimo l'effetto di aggiungere il tag fluorescente per la fusion partner^5,7,8, come nuove varianti di FP eseguire rispetto a GFP rimane difficile da valutare.

Esistono alcuni metodi per caratterizzare il comportamento di FPs. La maggior parte di essi coinvolgono test proprietà biofisiche di FPs utilizzando approcci biochimici, quali ultracentrifugazione e gel filtrazione protocolli^9,10,11,12. Tali metodi hanno l'avvertenza di utilizzare purificata FPs in soluzione, offrendo una visione poco sul loro comportamento in cellule intatte. Lo sviluppo delle offerte saggio organizzato reticolo endoplasmatico liscio (OSER) una valutazione quantificabile di tendenza FPs' a oligomerizzazione in vita cellule¹³ testando la capacità di riorganizzare i tubuli di reticolo endoplasmatico in FPs iperespresso OSER verticilli¹⁴. Questa tecnica è in grado di rilevare correttamente le modifiche tra le varianti monomerici e oligomerici di GFP e altri FPs. Tuttavia, esso si basa principalmente sulla sovraespressione in cellule trasfettate transitoriamente e la quantificazione e l'analisi di immagine può richiedere molto tempo, a meno che la tecnica viene adottata come una raccolta automatizzata dei dati e del flusso di lavoro di analisi.

Al fine di integrare questi approcci, abbiamo stabilito un'analisi che sfrutta l'effetto fluorescente tag sulla tossicità e aggregazione di poliQ espansioni in lievito^15,16. L'espansione del tratto poliQ con più di 36 ripetizioni all'interno il primo essone del gene codificante che la proteina huntingtina (Htt) è associata con la malattia di Huntington^17,18. L'espressione di espanso Htt^ex1 nei risultati di lievito in una forte aggregazione delle proteine misfolded Htt accoppiata ad un difetto di sviluppo severo. Interessante, questi fenotipi sono fortemente influenzati dalle sequenze fiancheggianti il tratto poliQ, tra cui FPs^15,16. Esso è stato razionalizzato che le diverse proprietà di FPs differenzialmente possono influenzare la tossicità polyQ in lievito. Infatti, rispetto alla GFP-come FPs, proteine fluorescenti rosse e le loro forme evolute hanno mostrato una ridotta tossicità e aggregazione¹⁶. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare l'effetto della prossima generazione di FPs sulla tossicità di poliQ e aggregazione in lievito. Questo test consente un'analisi rapida e potenzialmente ad alto contenuto di varianti FP che può essere utilizzato in parallelo con precedentemente caratterizzato tecniche per la caratterizzazione ottima del nuovo FPs e può valutare come se la cavano rispetto a GFP.

Protocollo

1. generazione di nuovo fluorescente Tagged Htt^ex1 reporter per un'espressione in lievito

Nota: Questa sezione è stata modificata dal protocollo di Jiang et al. ¹⁶ e Albakri et al. ¹⁹.

1. Disegnare primers per amplificare la sequenza che codifica la proteina fluorescente o interesse mediante PCR. Il primer forward dovrebbe includere una sequenza leader per assistere l'enzima di restrizione durante la digestione (GATC), seguita da un sito di restrizione SpeI (ACTAGT) e 20 basi a valle dell'ATG (escluse ATG) del gene della proteina fluorescente di interesse. Il primer reverse dovrebbe includere la sequenza leader (GATC), seguita da un sito di restrizione di SalI (GTCGAC) e il complemento inverso di 20 basi a Monte del codone di stop della sequenza FP (tra cui fermata).
2. Utilizzando il primer disegnati nel passaggio 1.1, eseguire la reazione di PCR utilizzando un termociclatore con le seguenti impostazioni: calore a 95 ° C per 1 min e ciclo a 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 2 min a kB del prodotto di PCR. L'esecuzione di 18 cicli è ampio.
3. Eseguire la reazione di PCR su un gel di agarosio (0,5%, Tris-acetato-EDTA). Ci deve una singola banda corrispondente alla dimensione di prodotto previsto. Isolare il frammento utilizzando un kit di purificazione del gel.
4. Il protocollo utilizza un vettore di^ex1 Htt che trasportano 25 (non tossico) e 72 (HD-associato, visualizzazione di una forte aggregazione) polyQ ripete. Digerire i frammenti PCR sia il vettore con enzimi di restrizione SpeI e SalI per 3 h a 37 ° C.
5. Purificare il vettore digerito facendolo funzionare su un gel di agarosio come descritto al punto 1.3.
6. Purificare il frammento della PCR digerito utilizzando un kit di purificazione di PCR.
7. Legare il frammento della PCR digerito risultante e p415 -GAL1-bandiera-25/72QpolyQ plasmidi¹ utilizzando ligasi T4 (1 h a temperatura ambiente). Utilizzare una reazione di 10 µ l (1 µ l di enzima T4, 1 µ l di tampone X 10, 6 µ l del frammento PCR e 2 µ l di vettore).
8. Trasformare 2 µ l di reazione di legatura in 50 µ l di Escherichia coli-cellule competenti e li Incubare in ghiaccio per 30 min. Quindi, shock termico le cellule a 42 ° C per 30 s. aggiungere 1 mL di media escrescenza SOC e incubare a 37 ° C per 1 h in uno shaker. Piastra di 200 µ l di reazione su un piatto di LB-agar contenente ampicillina di 100 µ g/mL. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte.
9. Selezionare tre diverse colonie batteriche, farle crescere durante la notte in 3 mL di LB-brodo contenente 100 ampicillina µ g/mL a 37 ° C in un agitatore ed estrarre il plasmide DNA utilizzando un kit di purificazione del plasmide.
10. Verifica il plasmide digerendo 500 ng di DNA usando gli enzimi di restrizione SpeI e SalI per 1h a 37 ° C ed eseguire la reazione su un gel di agarosio (0,5%, Tris-acetato-EDTA). Dovrebbero esserci due bande alle giuste dimensioni del vettore (~ 7 kb) e l'inserto (dimensione varia secondo il gene di interesse). Verificare quindi il plasmide mediante sequenziamento.
11. Trasformare il p415 -GAL1- plasmidi - polyQ-FPbandieranel ceppo di lievito W303 seguendo un protocollo di trasformazione lievito standard².

2. dosaggio di spotting

1. Striscia il lievito cloni trasportante 25Q/72Q taggati con FP di interesse su una piastra di agar contenente lievito selezione supporto (sintetico completare-SC senza leucina) con glucosio come fonte di carbonio. Allo stesso tempo, anche striscia 25Q/72Q-ymsfGFP per servire come controllo positivo.
   Nota: 25Q/72Q costrutti che non contengono un tag fluorescente non sono tossici e possono servire come controllo negativo.
2. Incubare le piastre a 30 ° C per 2-3 d.
3. Selezionare fino a tre singole colonie dalla piastra.
4. Inoculare 5 mL di SC completati con 2% di glucosio come fonte di carbonio.
5. A pellet 200 µ l di ogni cultura durante la notte e lavare 3 volte con sterile di acqua distillata.
6. Risospendere le cellule in media di SC che contengono 2% galattosio come fonte di carbonio per indurre l'espressione di poliQ fusioni. Incubare il galattosio media pernottamento a 30 ° C in un rotatore del tubo. Come controllo, ripetere questo passaggio utilizzando supporti contenenti glucosio.
7. La mattina successiva, equalizzare la densità delle cellule di densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) di 0,2 a 100 µ l di media di SC in una piastra a 96 pozzetti sterile.
8. Preparare quattro diluizioni quintuplo di ciascun campione con acqua sterile di pipettaggio 20 µ l del campione dal precedente fino a 80 µ l di media nel pozzo successivo.
9. Usa un lievito pinning strumento per individuare le cellule sui piatti selettive (che contengono glucosio o galattosio) e incubare a 30 ° C per 2 d.
10. Immagine delle piastre con un dispositivo di documentazione di immagini.

3. quantificazione della crescita delle cellule in coltura liquida

1. Preparare le colture cellulari, seguenti passaggi 2.1-2.5 del presente protocollo.
2. Misurare il OD₆₀₀ utilizzando uno spettrofotometro.
3. Diluire le cellule a un OD₆₀₀ di 0,1 a 300 µ l di media in una piastra a 96 pozzetti.
4. Eseguire ogni esempio in triplice copia.
5. Incubare la piastra in un lettore/incubatore di piastra con capacità di agitazione. Impostare il numero di campioni, la temperatura a 30 ° C, l'assorbanza a 600 nm, la lunghezza di esperimenti a 24 h e gli intervalli di misurazione a 15 min e selezionare la modalità di agitazione continua.
6. Creare la curva di crescita e quantificare l'area sotto la curva utilizzando software di grafica scientifica. La GraphPad Prism 7 è consigliato. Incollare i dati in una tabella di x-y con tre valori di replicare. La curva di crescita verrà mostrata sotto la cartella grafici sul lato sinistro. Per quantificare l'area sotto la curva, selezionare Analyze in alto a sinistra e fare clic su Area sotto la curva nelle analisi di XY.

4. fluorescente microscopia

1. Preparare le colture cellulari, seguenti passaggi 2.1-2.5 del presente protocollo.
2. Diluire le cellule 10 x in crescita media e trasferimento 200 µ l di ogni campione a 8 pozzetti imaging chambers.
3. Immagine le celle utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con un obiettivo X piano Aprochromoat 63 (1,4 NA) a temperatura ambiente.
   Nota: L'utilizzo di un microscopio confocale è facoltativo. Può essere impiegato anche un microscopio a fluorescenza grandangolari standard.
4. Regolare la potenza laser e pinhole per acquisizione di immagine ottimale. Poiché gli aggregati 72Q sono molto più luminosi rispetto al segnale 25Q diffusa, spesso è necessario utilizzare un'impostazione di acquisizione diversi tra i diversi plasmidi per evitare la saturazione del segnale fluorescente.
5. Elaborare le immagini usando ImageJ²⁰ o un altro software di elaborazione delle immagini. A questo punto, la percentuale di cellule che display aggregato può essere calcolato manualmente è desiderata.

5. dot Blot

Nota: In questo protocollo, dot blot è usato per esaminare i livelli di espressione della proteina. Preparare le colture cellulari, seguenti passaggi 2.1-2.5 del presente protocollo.

1. Generare la proteina lisati usando le perle di vetro in tampone di lisi (100 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl, 1 mM EDTA; 5% glicerolo, 1 mM dithiothreitol [DTT]). Aggiungere gli inibitori della proteasi, 4 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (ASL) e dell'inibitore di proteasi cocktail, direttamente prima dell'uso. A pellet 5ml della cultura durante la notte e risospendere esso in 200 µ l di perle di vetro e 200 µ l di tampone di lisi. Vortice 30 s per 12 giri. Centrifugare a 12.000 x g a 4 ° C per 10 minuti e raccogliere il surnatante.
2. Individuare una pari quantità di proteine totali su una membrana di nitrocellulosa mediante un apparato di microfiltrazione. Prewet la membrana con PBS e montare l'apparecchiatura. Connettersi a una fonte di vuoto e assicurarsi che le viti siano serrate. Applicare il vuoto e lasciare che il filtro del campione attraverso la membrana dalla forza di gravità.
3. Bloccare la membrana in PBS - 0.05% Tween/5% senza grassi del latte.
4. Incubare la membrana con l'anticorpo primario anti-FLAG durante la notte a 4 ° C. Il monoclonale anti-FLAG che M1 è raccomandato.
5. Lavare la membrana 3 x per 10 minuti ciascuno, con PSB - 0.05% Tween.
6. Incubare la membrana con un anticorpo secondario fluorescente contrassegnato (anti-IgG di topo) per 1 h a temperatura ambiente in PBS - 0.05% Tween/5% senza grassi del latte.
7. Lavare la membrana 3 x 10 min con PSB - 0.05% Tween.
8. Immagine-macchia usando un sistema di documentazione di immunoblot.

Risultati

FPs hanno differenti proprietà biofisiche, compresa la loro tendenza a oligomerizzazione, che possono influenzare il comportamento dei loro partner di fusione nel contesto del reporter fluorescenti. Questo protocollo descrive un metodo semplice dove più FPs possono essere fusi per espansioni polyQ tossici. Poiché polyQ tossicità dipende fortemente le sequenze fiancheggianti il tratto poliQ¹⁵, questo dosaggio permette un confronto rapido e diretto dei reporter d...

Discussione

In questo articolo, vari metodi per misurare l'aggregazione di Htt^ex1 polyQ espansioni e loro effetto sulla crescita del lievito sono stati impiegati come un modello per studiare come i diversi fluorescente proteine alterano i loro soci di fusione nel contesto del reporter fluorescenti . Usando una variante GFP (ymsfGFP) come controllo positivo, abbiamo mostrato che questo rileva cambiamenti significativi nella tossicità di poliQ e aggregazione tra i diversi tag fluorescente e consente un confronto diretto e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency)	New Englanfd Biolab	C2987
SpeI-HF	New Englanfd Biolab	R3133	High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF	New Englanfd Biolab	R0138	High fidelity enzymes are preferred
Agarose	Fisher Scientific	BP160
LB-Agar	Fisher Scientific	BP1425
LB-Broth	Fisher Scientific	BP1426
Ampicilin	Fisher Scientific	BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase	Agilent Technologies	600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator	V&P Scientific inc.	VP407AH
SPI imager	S&P Robotics inc.	spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan	Carl Zeiss Microscopy	LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers	Fisher Scientific	12565470
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+	Bio-Rad	1708265
anti-FLAG M1 antibody	Sigma-Aldrich	F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody	Thermo	A32727
Plasmid MiniPrep Kit	Fisher Scientific	K0503
Plasmid Gel extraction Kit	Fisher Scientific	K0831
PCR Purification Kit	Fisher Scientific	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Fisher Scientific	BP13354