Влияние на Fusion партнеров с помощью анализов токсичности Хантингтона в дрожжи флуоресцентных белков

Резюме

Эта статья описывает протоколы оценить эффект от флуоресцентных белков на агрегации и токсичность смятых Хантингтона расширения для быстрой оценки недавно uncharacterized флуоресцентный белок в контексте флуоресцентные репортеров.

Аннотация

Для расследования локализация протеина и торговли с использованием живых клеток исследователи часто полагаются на сплавляя их протеин интереса для флуоресцентных репортер. Постоянно развивающийся список генетически закодированный флуоресцентных белков (FPs) представляет пользователям с несколько альтернатив когда дело доходит до проектирования флуоресцентные фьюжн. Каждый FP имеет специфические оптических и биофизические свойства, которые могут повлиять на биохимические, сотовой и функциональных свойств результате флуоресцентные сплавливания. Например несколько кадров, как правило, образуют неспецифических олигомеров, которые подвержены препятствуют функции fusion партнером. К сожалению лишь несколько методов существуют для проверки воздействия на поведение флуоресцентные репортер FPs. Здесь мы опишем простой метод, который позволяет быстрой оценки влияния FPs с помощью анализов токсичности Хантингтона (polyQ) в многообещающий дрожжей Saccharomyces cerevisiae. PolyQ Расширенная гентингтина белки связаны с начала болезни Гентингтона (HD), где расширенной гентингтина объединяет в токсичных олигомеров и включение органов. Агрегирование и токсичность polyQ разложений в дрожжи сильно зависит от последовательности фланкируя polyQ региона, в том числе наличие флуоресцентные метки, обеспечивая тем самым идеальное экспериментальной платформы для изучения влияния FPs на поведение их Фьюжн-партнер.

Введение

Поскольку были разработаны первоначальные характеристики зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) от Aequorea victoria¹, широкая палитра генетически закодированный FPs, позволяя клеточных биологов одновременно локализации и отслеживания нескольких Сотовый события/белков в живых клетках^2,3. FPs являются производными от нескольких организмов, от медуз кораллов, и таким образом, конкретные биофизические свойства отображения, которые отвлекают широко за пределами их соответствующих флуоресцентного спектра. Эти свойства включают яркость, светостойкость и тенденция к oligomerize среди других^2,4. Выбор мономерных FPs является важным аспектом в выборе подходящего тега при проектировании флуоресцентный репортер, с тем чтобы свести к минимуму неуместные взаимодействий и изменения функции fusion партнером и максимизировать эффективность репортер для Учитывая сотовой отсек^4,5,6. В то время как GFP со временем, была развивались, чтобы свести к минимуму эффект добавления флуоресцентные метки в fusion партнером^5,7,8, как новые варианты FP выполняют по сравнению с GFP по-прежнему трудно оценить.

Существуют несколько методы характеризовать поведение FPs. Большинство из них включают проверку биофизические свойства FPs, с использованием биохимических подходов, таких как ultracentrifugation и гель фильтрации протоколов^9,10,,1112. Такие методы имеют ограничение использования очищенной FPs в растворе, предлагая меньшюю проницательность в их поведение в нетронутым клеток. Развития предлагает пробирного организованной гладкой эндоплазменный ретикулум (Осер) количественной оценки FPs тенденция к oligomerize в живых клеток¹³ путем тестирования гиперэкспрессия FPs возможность реорганизовать эндоплазматического ретикулума трубочки в Осер мутовках¹⁴. Этот метод может успешно обнаружить изменения между мономерные и олигомерные варианты GFP и другие FPs. Однако она опирается главным образом на гиперэкспрессия временно transfected клеток, и количественный и анализа изображений может занять много времени, если техника принимается как автоматизированный сбор данных и анализ рабочего процесса.

Для того, чтобы дополнять эти подходы, мы создали assay который использует эффект флуоресцентные метки на токсичность и агрегации polyQ разложений в дрожжи^15,16. Расширение стрейч polyQ с более чем 36 повторяет в течение первого экзона гена кодирования белок гентингтин (НТТ) связан с болезни Гентингтона^17,18. Выражение расширенной Htt^ex1 в дрожжей приводит к сильным агрегации смятых Htt белка, в сочетании с дефектом серьезный рост. Интересно, что эти фенотипы сильно повлияли последовательностей фланкируя polyQ стрейч, включая FPs^15,16. Было рационализировано, что различные свойства FPs дифференциально могут повлиять на токсичность polyQ дрожжей. Действительно по сравнению с GFP-подобных FPs, красных флуоресцентных белков и их развивались форм показали снижение токсичности и агрегации¹⁶. Эта рукопись содержит подробный протокол для оценки эффекта следующего поколения FPs на polyQ токсичности и агрегации в дрожжей. Этот assay позволяет для быстрого и потенциально высоким содержанием анализа FP вариантов, которые могут использоваться параллельно с ранее охарактеризовать методы для оптимального характеристика новых FPs и может оценить, как они выполняют по сравнению с GFP.

протокол

1. поколение новых дневно меткой Htt^ex1 репортеров для выражения в дрожжи

Примечание: Этот раздел был изменен из протокола Цзян и др. ¹⁶ и Albakri и др. ¹⁹.

1. Дизайн праймеров для того чтобы усилить последовательности кодирования флуоресцентный белок или интерес методом ПЦР. Форвард грунт должен включать лидер последовательности для оказания помощи энзима ограничения во время пищеварения (GATC), затем ограничение сайта SpeI (ACTAGT) и 20 баз по течению ГПТ (исключая ГПТ) флуоресцентного белка гена интереса. Обратный грунт должен включать лидер последовательности (GATC), следуют Сали ограничения сайта (GTCGAC) и обратный дополнение 20 основ вверх по течению стоп кодон FP последовательности (включая стоп).
2. С помощью грунты, предназначенные на этапе 1.1, выполнять реакции PCR с помощью Термоциклер со следующими параметрами: тепла до 95 ° C за 1 мин и цикла при 95 ° C за 30 сек, 60 ° C за 30 s и 72 ° C 2 мин ПЦР продукта в КБ. Выполнение 18 циклов является достаточным.
3. Запуск реакции PCR на геле агарозы (0,5% в трис ацетат ЭДТА). Там должны однодиапазонный соответствующий размер ожидаемого продукта. Изолируйте фрагмента, используя комплект для очистки гель.
4. Протокол использует вектор^ex1 Htt, перевозящих 25 (нетоксичный) и 72 (HD-связанных, отображение сильный агрегации) polyQ повторяется. Дайджест ПЦР фрагментов и вектор с SpeI и Сали энзимами ограничения для 3 ч при 37 ° C.
5. Очищайте переваривается вектор, запустив его на геле агарозы как в шаге 1.3.
6. Очищайте фрагмента переваривается ПЦР, используя комплект для очистки ПЦР.
7. Перевязать результирующий фрагмент переваривается ПЦР и p415 -GAL1-флаг-25/72QpolyQ плазмид¹ с помощью T4 лигаза (1 ч при комнатной температуре). Используйте 10 мкл реакции (1 мкл T4 фермента, 1 мкл 10 X буфер, 6 мкл ПЦР фрагментов и 2 мкл вектора).
8. Преобразовать 2 мкл реакции перешнуровки в 50 мкл кишечнойпалочки-компетентных клеток и инкубировать их на льду за 30 мин. Затем теплового шока клетки при 42 ° C за 30 s. Добавить 1 мл SOC нарост СМИ и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч в шейкере. Плита 200 мкл реакции на табличке LB-агар, содержащий ампициллина 100 мкг/мл. Инкубируйте пластины при 37 ° C на ночь.
9. Выберите три индивидуальных бактериальных колоний, выращивать их на ночь в 3 мл LB-бульон, содержащий 100 ампициллин мкг/мл при 37 ° C в шейкере и извлечь плазмидной ДНК, используя комплект для очистки плазмиды.
10. Проверьте плазмида, переваривание 500 нг ДНК с помощью SpeI и Сали энзимов ограничения для 1 ч при 37 ° C и запуск реакции на геле агарозы (0,5% в трис ацетат ЭДТА). Там должно быть две полосы на правом размеров вектор (~ 7 КБ) и вставить (размер зависит от гена интереса). Затем проверьте плазмида путем sequencing.
11. Трансформировать p415 -GAL1-флаг- polyQ-FP плазмид в штамм дрожжей W303 после преобразования протокола Стандартный дрожжи².

2. Анализируя Assay

1. Полоска дрожжи клоны проведение 25Q/72Q, отмеченных FP интерес на табличке агар, содержащие дрожжи выбор СМИ (синтетический завершить SC без лейцина) с глюкозой как источника углерода. В то же время также испещрять 25Q/72Q-ymsfGFP в качестве позитивного элемента управления.
   Примечание: 25Q/72Q конструкций, которые не содержат флуоресцентные метки не являются токсичными и может служить в качестве отрицательного контроля.
2. Инкубируйте пластины при 30 ° C для 2-3 d.
3. Выберите до трех колоний одного из пластины.
4. Прививать 5 мл SC с 2% глюкозы как источника углерода.
5. Пелле 200 мкл каждую ночь культуры и мыть его 3 x с стерильной дистиллированной воды.
6. Ресуспензируйте клетки в средствах массовой информации SC, содержащий 2% галактозы как источника углерода побудить выражение polyQ сплавливания. Инкубируйте галактозы, СМИ в одночасье при 30 ° C в ротатор трубки. Как элемент управления повторите этот шаг с помощью средств массовой информации, содержащие глюкозу.
7. Следующим утром, выравнивания ячеек плотности оптической плотности на 600 Нм (₆₀₀OD) 0,2 в 100 мкл SC СМИ в стерильных 96-луночных пластины.
8. Подготовка четырех пятикратный разведений в 80 мкл СМИ в следующем хорошо каждого образца с стерильной водой путем дозирования 20 мкл пример из предыдущего.
9. Использование дрожжей, закрепление инструмента месте клетки на выборочной пластин (содержащие глюкозы или галактозы) и Инкубируйте на 30 ° C для 2 d.
10. Изображения пластины с устройством документации изображения.

3. Количественная оценка роста клеток в культуре жидких

1. Подготовьте культур клеток, следующие шаги 2.1-2.5 настоящего Протокола.
2. Измерьте ОД₆₀₀ с помощью спектрофотометра.
3. Разбавьте клетки к ОД₆₀₀ 0.1 в 300 мкл СМИ в 96-луночных пластины.
4. Запуск каждого образца в трех экземплярах.
5. Инкубируйте пластину в тарелку читателя/инкубаторе с трястия возможностями. Задать количество образцов, температура 30 ° c, поглощения в 600 Нм, длина измерения интервалов 15 мин, и выберите режим непрерывной тряски и экспериментов до 24 ч.
6. Создание кривой роста и количественно определить площадь под кривой с использованием научного графического программного обеспечения. 7 Призма GraphPad рекомендуется. Вставка данных в таблицу XY с тремя реплицировать значения. Кривая роста будет показан в папке графики на левой стороне. Чтобы измерить площадь под кривой, выберите анализировать в левом верхнем углу и нажмите площадь под кривой в XY анализы.

4. Люминесцентная микроскопия

1. Подготовьте культур клеток, следующие шаги 2.1-2.5 настоящего Протокола.
2. Разбавить клетки 10 x на рост средств массовой информации и передачи 200 мкл каждого образца 8-Ну тепловизионных камер.
3. Изображение клетки с помощью конфокального микроскопа с 63 X плана Aprochromoat цели (1.4 NA) при комнатной температуре.
   Примечание: Использование конфокального микроскопа является необязательным. Стандартный-поля флуоресцентный Микроскоп также могут быть использованы.
4. Отрегулируйте обскуры и лазерной энергии для приобретения оптимального изображения. Так, как агрегатов 72Q гораздо ярче, чем диффузные 25Q сигнал, то часто требуется использовать разные приобретения между различными плазмиды для того, чтобы избежать насыщения флуоресцентного сигнала.
5. Обработка изображения с помощью ImageJ²⁰ или другой обработки изображений программное обеспечение. На этом шаге требуемый процент клеток, что агрегат дисплея можно рассчитать вручную.

5. точка помаркой

Примечание: В настоящем Протоколе, точка помарка использована для изучения уровнях выражения протеина. Подготовьте культур клеток, следующие шаги 2.1-2.5 настоящего Протокола.

1. Генерировать лизатов белка с использованием стекляруса литического буфера (100 мм трис, рН 7,5; 200 мм NaCl; 1 мм ЭДТА; 5% глицерина, 1 мм Дитиотреитол [DTT]). Добавление ингибиторов протеазы, 4 мм phenylmethylsulfonyl фторид (PSMF) и ингибитор протеазы, коктейль, непосредственно перед использованием. Пелле 5 мл на ночь культуры и Ресуспензируйте в 200 мкл стеклянные бусы и 200 мкл буфера lysis. Вихрь 30 s 12 раундов. Центрифуга на 12000 x g при 4 ° C на 10 мин и собирать супернатант.
2. Пятно равное количество суммарных белков на нитроцеллюлозную мембрану с использованием микрофильтрации аппарат. Prewet мембрана с PBS и собрать аппарат. Подключитесь к источнику вакуума и убедитесь, что винты затянуты. Включите пылесос и пусть пример фильтра через мембраны под действием силы тяжести.
3. Блокировать мембрану в PBS - 0,05% Tween/5% обезжиренного молока.
4. Проинкубируйте мембрану с основного антитела анти флаг на ночь при 4 ° C. Рекомендуется моноклонального анти флаг M1.
5. Промойте мембрану 3 x 10 мин с ОВО - 0,05% анимации.
6. Проинкубируйте мембрану с дневно обозначенные вторичное антитело (анти мыши IgG) за 1 ч при комнатной температуре в PBS - 0,05% Tween/5% обезжиренного молока.
7. Промойте мембрану 3 x 10 мин с ОВО - 0,05% анимации.
8. Изображение блот с помощью системы документации immunoblot.

Результаты

FPs имеют различные биофизические свойства, включая их тенденция к oligomerize, которые могут повлиять на поведение их слияние партнеров в контексте флуоресцентные репортеров. Этот протокол описывает простой метод, где несколько кадров может быть сливается с разложения ток...

Обсуждение

В этой статье, различных анализов для измерения агрегации Htt^ex1 polyQ разложения и их влияние на рост дрожжей были заняты как модель для изучения как различные флуоресцентные белки изменяют их слияние партнеров в контексте флуоресцентные репортеров . С помощью GFP вариант (ymsfGFP) как поз...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency)	New Englanfd Biolab	C2987
SpeI-HF	New Englanfd Biolab	R3133	High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF	New Englanfd Biolab	R0138	High fidelity enzymes are preferred
Agarose	Fisher Scientific	BP160
LB-Agar	Fisher Scientific	BP1425
LB-Broth	Fisher Scientific	BP1426
Ampicilin	Fisher Scientific	BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase	Agilent Technologies	600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator	V&P Scientific inc.	VP407AH
SPI imager	S&P Robotics inc.	spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan	Carl Zeiss Microscopy	LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers	Fisher Scientific	12565470
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+	Bio-Rad	1708265
anti-FLAG M1 antibody	Sigma-Aldrich	F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody	Thermo	A32727
Plasmid MiniPrep Kit	Fisher Scientific	K0503
Plasmid Gel extraction Kit	Fisher Scientific	K0831
PCR Purification Kit	Fisher Scientific	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Fisher Scientific	BP13354