Efeito de proteínas fluorescentes na fusão parceiros usando Polyglutamine ensaios de toxicidade em levedura

Resumo

Este artigo descreve os protocolos para avaliar o efeito de proteínas fluorescentes na agregação e toxicidade de misfolded polyglutamine expansão para a avaliação rápida de uma proteína fluorescente recentemente descaracterizada no contexto dos repórteres fluorescentes.

Resumo

Para a investigação de localização da proteína e tráfico utilizando imagens de células vivas, pesquisadores muitas vezes dependem de sua proteína de interesse para um repórter fluorescente de fusão. A lista em constante evolução de proteínas fluorescentes geneticamente codificadas (FPs) apresenta aos usuários com várias alternativas quando se trata de projeto de fusão fluorescente. Cada FP tem propriedades específicas de ópticas e biofísicas que podem afetar as propriedades bioquímicas, celulares e funcionais das fusões fluorescentes resultantes. Por exemplo, vários FPs tendem a formar oligómeros inespecíficos que são susceptíveis de impedir a função do parceiro de fusão. Infelizmente, apenas alguns métodos existem para testar o impacto de FPs sobre o comportamento do repórter fluorescente. Aqui, descrevemos um método simples que permite a avaliação rápida do impacto da FPs usando polyglutamine (polyQ) ensaios de toxicidade em brotamento levedura Saccharomyces cerevisiae. Huntingtina expandido PolyQ proteínas estão associadas com o aparecimento da doença de Huntington (HD), onde a huntingtina expandida agrega em oligômeros tóxicos e corpos de inclusão. A agregação e a toxicidade do polyQ expansões em levedura são altamente dependentes as sequências flanqueando a região polyQ, incluindo a presença de etiquetas fluorescentes, proporcionando uma plataforma experimental ideal para estudar o impacto do FPs sobre o comportamento de seus parceiro de fusão.

Introdução

Desde a caracterização inicial da proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria¹, uma variada gama de FPs geneticamente codificado foram desenvolvidos, permitindo que biólogos da célula localizar e rastrear simultaneamente múltiplos eventos/proteínas celulares na vida células^2,3. FPs são derivadas de vários organismos, de água-viva de coral e, portanto, a exibição Propriedades biofísicas específicas que desviam-se extensivamente para além de seu respectivo espectro fluorescente. Essas propriedades incluem o brilho, fotoestabilidade e uma tendência para oligomerize, entre outros,^2,4. Selecionar monomérico FPs é um aspecto importante na seleção de uma marca adequada ao projetar um repórter fluorescente, a fim de minimizar interações inadequadas e alterações da função do parceiro fusão e maximizar a eficiência de repórter para uma dado compartimento celular^4,5,6. Enquanto as boas práticas agrícolas, ao longo do tempo, sido evoluiu para minimizar o efeito de adicionar a tag fluorescente para a fusão parceiro^5,7,8, como novas variantes FP executam em relação ao GFP continua a ser difícil de avaliar.

Existem alguns métodos para caracterizar o comportamento de FPs. A maioria deles envolve testar propriedades biofísicas de FPs usando abordagens bioquímicas, tais como ultracentrifugação e gel filtração protocolos^9,10,11,12. Tais métodos têm a limitação do uso de FPs purificada em solução, oferecendo pequeno insight sobre seu comportamento nas células intactas. O desenvolvimento do retículo endoplasmático liso organizado (OSER) ensaio oferece uma avaliação quantificável da tendência de FPs' a oligomerize em vida células¹³ , testando a capacidade de FPs Blumental de reorganizar os túbulos do retículo endoplasmático em Espirais OSER¹⁴. Esta técnica com êxito pode detectar alterações entre monoméricas e oligoméricas variantes de GFP e outros FPs. No entanto, baseia-se principalmente na superexpressão em células transfectadas transitoriamente, e a quantificação e análise de imagens podem ser demorados, a menos que a técnica é adotada como uma coleção de dados automatizada e fluxo de trabalho de análise.

A fim de complementar essas abordagens, estabelecemos um ensaio que se beneficia do efeito de etiquetas fluorescentes sobre a toxicidade e a agregação de expansões polyQ no fermento^15,16. A expansão do trecho com mais de 36 polyQ repete dentro o primeiro exon de codificação do gene que da proteína huntingtina (Htt) está associada com a doença de Huntington^17,18. A expressão de expandido Htt^ex1 em resultados de levedura em um forte agregação da proteína Htt misfolded acoplada a um defeito grave de crescimento. Curiosamente, estes fenótipos são fortemente influenciados pelas sequências flanqueando o trecho polyQ, incluindo FPs^15,16. Isso foi racionalizado que as diferentes propriedades de FPs diferencialmente podem afetar polyQ toxicidade no fermento. De fato, comparado ao GFP-como FPs, proteínas fluorescentes vermelhas e suas formas evoluídas mostraram uma reduzida toxicidade e agregação¹⁶. Este manuscrito fornece um protocolo detalhado para avaliar o efeito da próxima geração de FPs na toxicidade polyQ e agregação em levedura. Este ensaio permite uma análise rápida e potencialmente alto teor de variantes FP que pode ser usado em paralelo com anteriormente caracterizada técnicas para caracterização ideal de novo FPs e pode avaliar qual o seu desempenho em comparação com as boas práticas agrícolas.

Protocolo

1. geração de novo fluorescente etiquetado Htt^ex1 repórteres para uma expressão em levedura

Nota: Esta secção foi modificada o protocolo por Jiang et al . ¹⁶ e Albakri et al . ¹⁹.

1. Desenho de primers para amplificar a sequência de codificação da proteína fluorescente ou interesse pelo PCR. O primer para a frente deve incluir uma sequência de líder para ajudar a enzima de restrição durante a digestão (GATC), seguida por um site de restrição SpeI (ACTAGT) e 20 bases a jusante do ATG (excluindo ATG) do gene da proteína fluorescente de interesse. O primer reverso deve incluir a sequência de líder (GATC), seguido de um sítio de restrição de SalI (GTCGAC) e o complemento de reverso de 20 bases montante do códon de parada da sequência FP (incluindo paragem).
2. Utilizando os primers desenhados na etapa 1.1, realizar a reação de PCR usando um thermocycler com as seguintes configurações: calor para 95 ° C por 1 min e ciclo a 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s e 72 ° C por 2 min por kB de produto do PCR. Realização de 18 ciclos é amplo.
3. Execute a reação de PCR em um gel de agarose (0,5% no Tris-Acetato-EDTA). Lá deve uma única banda correspondente ao tamanho do produto esperado. Isole o fragmento usando um kit de purificação de gel.
4. O protocolo emprega um vetor de^ex1 Htt carregando 25 (não tóxico) e 72 (HD-associado, exibindo uma forte agregação) polyQ repete. Digerir ambos os fragmentos PCR e o vetor com enzimas de restrição SpeI e SalI por 3 h a 37 ° C.
5. Purifica o vetor digerido, executando-o em um gel de agarose, como na etapa 1.3.
6. Purifica o fragmento digerido do PCR usando um kit de purificação de PCR.
7. Ligam o fragmento resultante de PCR digerido e p415 -GAL1-bandeira-25/72QpolyQ plasmídeos¹ usando T4 ligase (1 h à temperatura ambiente). Use uma reação de 10 µ l (1 µ l da enzima T4, 1 µ l de tampão de X 10, 6 µ l de fragmento do PCR e 2 µ l de vetor).
8. Transformar a 2 µ l de reação da ligadura em 50 µ l de Escherichia coli-células competentes e incube-os em gelo por 30 min. Então, calor-choque as células a 42 ° C por 30 s. adicionar 1 mL de mídia de consequência SOC e incubam a 37 ° C, durante 1 h em um shaker. Placa de 200 µ l da reação em um prato de LB-ágar contendo 100 ampicilina µ g/mL. Incube a placa a 37 ° C durante a noite.
9. Selecione três colônias bacterianas individuais, cultivá-las durante a noite em 3 mL de LB-caldo contendo 100 ampicilina µ g/mL a 37 ° C em uma coqueteleira e extrair o plasmídeo de DNA usando um kit de purificação de plasmídeo.
10. Verifique o plasmídeo por digestão de 500 ng de DNA usando enzimas de restrição SpeI e SalI durante 1 h a 37 ° C e a reação de executar em um gel de agarose (0,5% no Tris-Acetato-EDTA). Deve haver duas bandas com os tamanhos certos do vetor (~ 7 kb) e o insert (tamanho varia de acordo com o gene de interesse). Em seguida, verifique se o plasmídeo de sequenciação.
11. Transforme ascende a p415 -GAL1-, plasmídeos - polyQ-FP debandeirapara a cepa de levedura W303 seguindo um protocolo de transformação de fermento padrão².

2. ensaio da mancha

1. Raia o fermento clona escriturada 25Q/72Q com o FP de interesse em uma placa de ágar contendo meios de seleção de levedura (sintética completa-SC sem leucina) com glicose como fonte de carbono. Ao mesmo tempo, também marcam a 25Q/72Q-ymsfGFP para servir como controle positivo.
   Nota: 25Q/72Q construções que não contêm uma etiqueta fluorescente não são tóxicas e podem servir como controle negativo.
2. Incube as placas a 30 ° C, durante 2-3 d.
3. Selecione até três colônias única da placa.
4. Inocule 5ml de SC suplementado com 2% de glicose como fonte de carbono.
5. Pelota 200 µ l de cada cultura durante a noite e lavar 3x com estéril de água destilada.
6. Ressuspender as células em mídia de SC contendo 2% de galactose como fonte de carbono para induzir a expressão de polyQ fusões. Incube a galactose mídia durante a noite a 30 ° C em um rotador de tubo. Como um controle, repita este passo usando meios que contenham glicose.
7. Na manhã seguinte, equalizar as densidades de célula a densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) de 0,2 em 100 µ l de mídia SC em uma placa de 96 poços estéril.
8. Prepare quatro diluições quíntuplo de cada amostra com água esterilizada por pipetagem 20 µ l da amostra anterior até 80 µ l de mídia no poço próximo.
9. Use um fermento fixando a ferramenta para manchar as células em placas seletivas (contendo glicose ou galactose) e incube a 30 ° C para d 2.
10. As placas da imagem com um dispositivo de documentação de imagem.

3. quantificação do crescimento celular em cultura líquida

1. Prepare as culturas de células, seguir passos 2.1-2.5 do presente protocolo.
2. Medir o OD₆₀₀ usando um espectrofotômetro.
3. Dilua as células de uma OD₆₀₀ de 0,1 em 300 µ l de mídia em uma placa de 96 poços.
4. Execute cada amostra em triplicado.
5. Incube a placa em uma placa leitor/incubadora com agitação capacidades. Definir o número de amostras, a temperatura de 30 ° C, a absorvância em 600 nm, comprimento dos experimentos de 24 h e os intervalos de medição, a 15 min e selecione o modo de agitação contínuo.
6. Criar a curva de crescimento e quantificar a área sob a curva usando software de gráfico científico. O GraphPad Prism 7 é recomendado. Cole os dados em uma mesa XY com três valores de replicar. A curva de crescimento será mostrada na pasta gráficos no lado esquerdo. Para quantificar a área sob a curva, selecione analisar no canto superior esquerdo e clique em área sob a curva em análises XY.

4. fluorescente microscopia

1. Prepare as culturas de células, seguir passos 2.1-2.5 do presente protocolo.
2. Diluir as células 10 x em crescimento media e transferência 200 µ l de cada amostra a câmaras de imagem de 8 poços.
3. Imagem das células usando um microscópio confocal, equipado com um objetivo X plano Aprochromoat 63 (1.4 at) à temperatura ambiente.
   Nota: O uso de um microscópio confocal é opcional. Também pode ser empregado um microscópio fluorescente padrão de campo amplo.
4. Ajuste a potência de pinhole e laser para aquisição de imagem ideal. Uma vez que os agregados de 72Q são muito mais brilhantes do que o sinal 25Q difusa, muitas vezes é necessário usar uma configuração diferente de aquisição entre os plasmídeos diferentes para evitar a saturação do sinal fluorescente.
5. Processe as imagens usando o ImageJ²⁰ ou outro software de processamento de imagem. Neste passo, a percentagem de células que exibição agregado pode ser calculado manualmente é desejada.

5. dot Blot

Nota: No presente protocolo, borrão do ponto é usado para examinar os níveis de expressão de proteínas. Prepare as culturas de células, seguir passos 2.1-2.5 do presente protocolo.

1. Gere o lisado de proteína usando contas de vidro em tampão de lise (EDTA 1 mM, 100 mM Tris, pH 7,5; 200 mM NaCl; 5% glicerol, 1mm ditiotreitol [TDT]). Adicione inibidores da protease, fluoreto de phenylmethylsulfonyl de 4 mM (PSMF) e cocktail, diretamente antes da utilização do inibidor da protease. 5 mL de cultura durante a noite de pelotas e Resuspenda-lo em 200 µ l de grânulos de vidro e 200 µ l de tampão de Lise. Vórtice de 30 s por 12 rodadas. Centrifugar a 12.000 x g a 4 ° C por 10 min e recolher o sobrenadante.
2. Mancha uma quantidade igual de proteínas totais em uma membrana de nitrocelulose, usando um aparelho de microfiltração. Prewet da membrana com PBS e montar o aparelho. Conectar a uma fonte de vácuo e verifique se que os parafusos estão apertados. Ligue o aspirador de pó e deixe o filtro de amostra através da membrana por gravidade.
3. Bloquear a membrana em PBS - 0.05% Tween/5% gordura de leite.
4. Incubar a membrana com anticorpo antibandeira primário durante a noite a 4 ° C. Recomenda-se o anticorpo monoclonal antibandeira M1.
5. Lavar a membrana 3 x por 10 min cada com PSB - 0,05% Tween.
6. Incube a membrana com um anticorpo secundário fluorescente etiquetada (anti-mouse IgG) por 1h à temperatura ambiente em PBS - 0.05% Tween/5% gordura de leite.
7. Lave a membrana 3 x 10 min com PSB - 0,05% Tween.
8. Imagem-blot utilizando um sistema de documentação de immunoblot.

Resultados

FPs têm diferentes propriedades biofísicas, incluindo sua tendência a oligomerize, que podem afetar o comportamento dos seus parceiros de fusão no contexto dos repórteres fluorescentes. Este protocolo descreve um método simples onde várias FPs pode ser fundido a expansões polyQ tóxicos. Desde polyQ toxicidade é altamente dependente as sequências flanqueando o estiramento polyQ¹⁵, este ensaio permite uma comparação rápida e direta de repórteres de fus...

Discussão

Neste artigo, vários ensaios para medir a agregação de Htt^ex1 polyQ expansões e seu efeito sobre o crescimento de levedura foram utilizados como modelo para estudar como diferente fluorescente proteínas alteram seus parceiros de fusão no contexto dos repórteres fluorescentes . Usando uma variante GFP (ymsfGFP) como um controle positivo, mostramos que isso detecta alterações significativas de toxicidade polyQ e agregação entre diferentes etiquetas fluorescentes e permite uma comparação direta e rá...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-alpha Competent E. coli (High efficiency)	New Englanfd Biolab	C2987
SpeI-HF	New Englanfd Biolab	R3133	High fidelity enzymes are preferred
SalI-HF	New Englanfd Biolab	R0138	High fidelity enzymes are preferred
Agarose	Fisher Scientific	BP160
LB-Agar	Fisher Scientific	BP1425
LB-Broth	Fisher Scientific	BP1426
Ampicilin	Fisher Scientific	BP1760
PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase	Agilent Technologies	600382
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments inc	EPOCH2TC
Yeast Pin Replicator	V&P Scientific inc.	VP407AH
SPI imager	S&P Robotics inc.	spImager-M
Zeiss LSM 800 confocal with AryScan	Carl Zeiss Microscopy	LSM 800
8 well Lab-Tek imaging chambers	Fisher Scientific	12565470
Bio-Dot apparatus	Bio-Rad	1706545
Chemi Doc XRS+	Bio-Rad	1708265
anti-FLAG M1 antibody	Sigma-Aldrich	F3040
Goat anti-mouse IgG alexa 555 secondary antibody	Thermo	A32727
Plasmid MiniPrep Kit	Fisher Scientific	K0503
Plasmid Gel extraction Kit	Fisher Scientific	K0831
PCR Purification Kit	Fisher Scientific	K0702
Prizm	GraphPad	N/A
TAE (Tris-Acetate-EDTA)	Fisher Scientific	BP13354