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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La carcinogenèse de peau à deux étapes est induite par deux produits chimiques topiques appliqués. Un mutagène 7,12-dimethylbenz[a]anthracene) provoque des mutations dans les cellules épidermiques et une application continue du stimulateur de croissance générale 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate accélère la formation de papillome cutané.

Résumé

Le cancer est l'une des maladies humaines les plus dévastatrices. Les modèles expérimentaux de cancer sont importants pour obtenir la perspicacité dans l'interaction complexe de différents types et gènes de cellules en favorisant la progression de tumeur et pour fournir une plate-forme pour tester l'efficacité de différentes approches thérapeutiques. L'un des modèles expérimentaux de cancer inflammatoire le plus couramment utilisé est le modèle de cancérogène de la peau à deux étapes DMBA-TPA. La formation de tumeur est induite dans ce modèle par l'application topique de deux produits chimiques différents, 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) et 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA), qui causent ensemble la formation de papillome dans la peau. Comme le résultat primaire est la formation de papillome dans la peau, le modèle est un moyen idéal, fiable, et reproductible pour adresser l'initiation de tumeur (survie tumeur-libre) et la progression de tumeur (nombre et taille des tumeurs visibles). Les effets du traitement DMBA-TPA sont transmis par un mécanisme inflammatoire, ce qui rend ce modèle particulièrement approprié pour étudier le rôle du système immunitaire dans la formation tumorale. Cependant, ce modèle est limité à la peau et à d'autres surfaces où les produits chimiques peuvent être appliqués. Un protocole détaillé est fourni dans cet article pour utiliser le modèle avec succès.

Introduction

Le cancer est l'une des principales causes de décès dans le monde. Par conséquent, il y a une demande pour développer des modèles expérimentaux fiables de maladie pour obtenir une meilleure compréhension de la maladie aussi bien que pour explorer des approches thérapeutiques potentielles. L'un des modèles expérimentaux in vivo les plus couramment utilisés pour étudier le développement du cancer de la peau est le modèle de carcinogenèse de la peau à deux étapes induit chimiquement à deux étapes1,2. Le modèle fournit un outil pour étudier l'initiation, la promotion et la progression de tumeur en plus des événements spécifiques tels que l'infiltration de cellules immunitaires et l'angiogenèse.

Pour employer le modèle de carcinogenèse de peau de deux étapes, la peau arrière des souris est traitée avec deux produits chimiques différents qui induisonnt ensemble la formation de tumeur. Le modèle est initié avec une faible dose de la mutagène, DMBA, suivie d'une exposition prolongée au promoteur de la tumeur, TPA3 (Figure 1). DMBA mute l'ADN au hasard en formant des adducts covalents avec l'ADN des cellules épidermiques et des cellules souches de kératinocyte primaire4,5,6,7. Certaines de ces mutations aléatoires ont lieu dans un proto-oncogène, comme Hras1 (mutations dans Kras et Nras sont également détectées) et la conversion de proto-oncogènes en oncogènes conduit la formation tumorale sous des stimuli appropriés. TPA, à son tour, est l'agent de croissance de croissance de tumeur le plus couramment utilisé. Sa cible moléculaire est la protéine kinase C (PKC)8. TPA active également la signalisation Wnt/ -caténine qui est cruciale pour la formation de tumeur dans le modèle9. L'exposition répétée et prolongée à l'agent de promotion mène à la signalisation accrue de cellules, à la production accrue des facteurs de croissance, et à une réaction inflammatoire locale, qui sont évidentes dues à la synthèse accrue d'ADN et à l'infiltration inflammatoire de cellules dans la peau traitée.

Les principaux médiateurs inflammatoires du modèle DMBA-TPA ont été identifiés10. Interleukin-17A (IL-17A) est connu pour être particulièrement tumorigène dans le modèle DMBA-TPA11,12. Il travaille en synergie avec l'interleukine 6 (IL-6) et participe au recrutement de macrophage et de neutrophile13,14. En outre, les cellules CD4et T et les neutrophiles se sont avérés tumorigènes dans le modèle DMBA-TPA. Enfin, les macrophages peuvent également promouvoir la tumorigénèse dans le modèle15,16,17.

Pendant la phase de promotion, la prolifération cellulaire des cellules mutées est améliorée et une hyperplasie soutenue de l'épiderme est maintenue1. Cela conduit au développement du papillome dans la peau en 10-20 semaines, après quoi les papillomes commencent à se convertir en tumeurs malignes, carcinomes épidermoïdes (SCC)2. Cependant, moins de 10% des papillomes progressent vers la malignité, bien que ce pourcentage dépende également du fond génétique des souris2,18. Pendant des décennies, on ne savait pas quel type de cellules ont été initialement mutés dans les tumeurs conduisant à la malignité, même si certaines études avaient rapporté des caractéristiques clairement distinctes dans les tumeurs malignes par rapport aux papillomes bénins19,20. Cependant, des études récentes ont considérablement augmenté notre compréhension sur l'origine clonale de la formation de tumeur dans le modèle21de DMBA-TPA. 22. 23. Il a été démontré que les deux cellules épithéliales dérivées de moelle osseuse et les cellules souches pileux follicules contribuent à la formation de tumeur22. Des études de traçage de lignée scénographie spécifiques à la scène ont révélé que les papillomes bénins sont d'origine monoclonal, mais ils recrutent de nouvelles populations épithéliales21,23. Cependant, un seul des clones cellulaires fonctionne comme un moteur de la carcinogenèse; il contient une mutation hras23. La progression vers la formation de carcinome est associée à un balayage clonal23.

Le DMBA cancérogène initie la formation de papillome et TPA favorise la croissance tumorale. Par conséquent, l'initiation de tumeur peut être étudiée séparément de la promotion en interrompant l'expérience avant la période de traitement de TPA. Comme la progression de tumeur est étudiée hebdomadairement elle offre une grande occasion pour l'analyse détaillée de croissance de tumeur tout au long de l'étude. Puisque les tumeurs sont produites par des produits chimiques externes, une mutation oncogène dans la lignée germinale est inutile. Ainsi, l'étude des effets d'un fond génétique (par exemple, knock-out/transgène contre type sauvage) sur la tumorigénèse est simple2. En somme, le modèle de cancer de la peau DMBA/TPA est une approche particulièrement utile pour étudier le rôle du système immunitaire dans la progression tumorale ainsi que pour l'évaluation des étapes d'initiation et de promotion de tumeur indépendamment ou interdépendante.

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Figure 1 : Contour du modèle de carcinogenèse de la peau induit par DMBA-TPA. Le DMBA cancérogène est appliqué topiquement pour induire des mutations d'ADN dans la phase d'initiation du modèle. L'agent de promotion de la croissance TPA est administré 2x par semaine pour améliorer la prolifération cellulaire pendant la phase de promotion, conduisant au développement de papillomes dans la peau. Les animaux sont sacrifiés après que la réponse du papillome a atteint un plateau, généralement dans les semaines 15-20, selon le fond génétique des souris. Une petite proportion des papillomes peut se développer davantage en SCC dans un délai de 20 à 50 semaines. Pour étudier les premiers événements de la phase d'initiation et de promotion précoce, des échantillons peuvent être prélevés (p. ex., peu de temps après la deuxième demande d'APT). Une photographie représentative et l'hématoxylin et l'éosine souillées section transversale des papillomes sur une peau de souris C57BL/6 après 19 semaines de traitement sont montrées. Barre d'échelle de 0,1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Protocole

Le protocole décrit ici a été approuvé par le Comité national d'éthique animale de Finlande (numéro de protocole ESAVI/23659/2018).

1. Animaux expérimentaux, réactifs et équipements

  1. Utilisez des souris assorties à l'âge et au sexe. Commencez l'étude à l'âge de 7 à 9 semaines, parce que la peau de la plupart des souris est en telogen (la phase de repos) vers cet âge2.
  2. Observez le comportement des animaux pendant l'étude et s'ils se battent, ce qui arrive souvent avec les mâles, les loger séparément. Les combats peuvent causer des coupures dans la peau, qui favorisent la formation tumorale. Les souris femelles sont préférées en raison de leur comportement moins agressif. La taille typique du groupe expérimental varie entre 8 et 20 animaux par groupe24,25,26,27.
    REMARQUE: Les calculs de puissance basés sur la variance biologique observée dans les études antérieures aident à choisir une taille de groupe suffisamment grande. Les souches utilisées comme exemples dans cet article incluent Balb/c et C57BL/6. Cependant, beaucoup d'autres souches de souris telles que SENCAR et FVB ont été utilisés avec le modèle DMBA-TPA, ainsi que Wistar et Sprague-Dawley rats2,28,29. Une licence du comité national ou local du travail animalier est nécessaire avant le début de l'étude. En plus des considérations générales de bien-être, les critères d'évaluation spécifiques au modèle sont généralement le carcinome épidermoïde (SCC) et une infection de la peau. Les rayures dans la peau en raison de démangeaisons après l'application des produits chimiques tumorigènes dans l'acétone est typique, mais sinon les animaux ne devraient montrer aucun signe d'inconfort. Peser régulièrement (p. ex., 2 x 2 fois par mois) aide à évaluer le bien-être des animaux.
  3. Utilisez le DMBA et le TPA, tous deux dilués dans l'acétone. La concentration de travail de DMBA est de 250 g/L. Une dose pour un animal est de 50 g de DMBA dans 200 l'acétone. La concentration en stock de TPA est de 125 g/L et la concentration de traitement de 25 g/L. Une dose de TPA pour un animal est de 5 g sur 200 l'acétone.
    CAUTION: Le DMBA est nocif s'il est avalé et peut causer le cancer. L'acétone s'évapore rapidement et est inflammable. Il peut causer des étourdissements et irriter les yeux. Utilisez un masque respiratoire et/ou travaillez sous vide. Changer de gants après avoir manipulé l'un de ces produits chimiques. Les cages ventilées individuellement empêchent la propagation des produits chimiques pendant le logement des souris. Après l'application, recueillir les conseils pipette utilisé pour la manipulation de la DMBA et éliminer comme déchets dangereux.
    REMARQUE: Le DMBA doit être protégé de la lumière. Le TPA dilué est stocké dans -20 oC, de préférence protégé de la lumière.
  4. Procurez l'équipement suivant : une balance, un rasage ordinaire pour la fourrure, des pipettes et des pointes d'une taille appropriée, une règle ordinaire, un appareil photo numérique, un bloc-notes et un stylo ou un ordinateur pour enregistrer les papillomes, un système d'anesthésie inhalée ou un équipement de souris avec une ouverture sur le dessus arrière, et un système de narcose de dioxyde de carbone pour sacrifier des souris.

2. Induction et promotion de papillome de peau

  1. Raser la peau du dos et peser l'animal. Plus tard, raser la peau chaque fois que nécessaire, mais pas au moment de l'exposition chimique.
    REMARQUE: Soyez prudent lorsque vous vous rasez autour des papillomes et évitez de faire des coupures sur la peau. Pesez chaque animal toutes les 2 semaines pour remarquer toute perte de poids potentielle.
  2. Appliquer 50 g de DMBA dans 200 l d'acétone topique sur la zone rasée à l'aide d'une pipette 48 h après avoir rasé la fourrure. Si nécessaire, retenez l'animal à l'aide d'une anesthésie par inhalation légère ou d'un contrôle de souris.
  3. Après 7 jours, donnez la première dose de TPA. Appliquer 5 g de TPA dans 200 l d'acétone topique avec une pipette 2x par semaine, de préférence le lundi et le jeudi ou le mardi et le vendredi.
  4. Comptez, enregistrez et photographiez les papillomes chaque semaine. Une masse palpable de plus de 1 mm de diamètre est considérée comme un papillome si elle reste plus d'une semaine. Marquez chaque papillome individuel sur une carte et énumérez sa taille chaque semaine. Stockez les photographies numériques.

3. Sacrifice d'animaux et collecte d'échantillons

  1. Continuer le traitement jusqu'à ce que la réponse tumorale atteigne un plateau. En général, on s'attend à ce que la charge de papillome augmente 10 à 20 semaines après l'initiation, selon la souche de souris utilisée. Le plateau est attendu dans 15 à 20 semaines. Une faible proportion des papillomes (moins de 3 %) peut se développer en SCC dans les 20 à 50 semaines2.
  2. Sacrifiez les animaux 24 h après la dernière demande d'APT. Utilisez la narcose de dioxyde de carbone avec la dislocation cervicale ou une autre méthode appropriée.
  3. Selon la question de recherche, recueillir le matériel d'échantillon approprié des animaux30,31.
    1. Par exemple, prélever des échantillons de sang avant de sacrifier et séparer le plasma.
    2. Couper des morceaux de la peau pour la coloration immunohistochimie (IHC) (par exemple, l'hématoxylin et l'éosine, la prolifération ou les cellules inflammatoires).
    3. Utilisez des poinçons de biopsie pour recueillir des morceaux de peau avec du tissu papillome ou de la peau non papillome (traitée) pour l'expression des gènes (p. ex., qPCR) et/ou des analyses de protéines (p. ex., western blot ou ELISA).
    4. Recueillir un morceau de la rate et la peau drainant les ganglions lymphatiques pour l'analyse de cytométrie de flux si une analyse plus détaillée des populations de cellules immunitaires est souhaitée. Vous pouvez également séparer les couches épidermiques et cutanées pour d'autres analyses.

4. Statistiques

  1. Dessinez une courbe de survie Kaplan-Meier du temps sans papillome et utilisez le test de classement des billes Mantel-Cox pour la survie. Dessinez une courbe linéaire du nombre de papillomes par semaine. Étant donné qu'il s'agit de données de comptage, utilisez un modèle de régression non linéaire. Consultez un statisticien si nécessaire.

Résultats

Le principal résultat est le temps de survie (c.-à-d. sans papillome) entre le traitement ou les groupes de génotype. Le résultat secondaire est le nombre de papillomes par semaine dans chaque groupe (figure 2). Les résultats attendus sont une différence statistiquement significative dans le temps libre du papillome et dans le nombre de papillomes entre les groupes expérimentaux (deux ou plus). Il est recommandé de compter le nombre de papillomes et de tracer une courbe pendant la ph...

Discussion

Le cancer de la peau d'Origine DMBA-TPA est l'un des modèles de cancer les plus couramment utilisés parce qu'il est hautement reproductible et fournit des informations sur la progression tumorale de l'initiation à la malignité. La principale mesure des résultats, la formation du papillome, est facilement et de manière fiable quantitative. Le modèle traite à la fois de l'initiation tumorale (survie sans tumeur) et de la progression (nombres et tailles tumoraux) simultanément. Le modèle est adapté pour l'étude ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par l'Académie de Finlande (subventions 25013080481 et 25013142041 (I.J.), 286377 et 295814 (M.P.), 287907 (T.J.)), fondation Deivikki et Sakari Sohlberg (M.P., T.J.), Finnish Medical Foundation (T.P.), The Competitive State Research Financement de la zone de responsabilité d'expert de l'hôpital universitaire de Tampere (subvention 9V049 et 9X044 (M.P.), 9X011 et 9V010 (T.J.)), Le financement de la recherche d'État concurrentiel de la zone de responsabilité experte des laboratoires Fimlab (subvention X51409 (I.J.)), Tays Fondation de soutien (I.J., M.P., T.J.), Tampere Tuberculosis Foundation (I.J., M.P., T.J.), la Finnish Cultural Foundation (M.V.), la Paulo Foundation (T.P.), Cancer Society of Finland (M.P.) et la Fondation Emil Aaltonen (T.P.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1000 ul RPT XL Graduated Filter Tip (Sterile), RefillStarlabS1182-1730-C
300 ul RTP Graduated Filter Tip (sterile), RefillStarlabS1180-9710-C
7,12-Dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)SigmaD3254-100MGHarmful if swallowed and may cause cancer. Store protected from light.
AcetoneSigma1000141011Evaporates rapidly and is inflammable.
Attane vet 1000 mg/gPiramal Critical Care LimitedLiquid isoflurane for inhalation
Battery-Operated Clipper IsisAlbert Kerlb GmbHGT421For shaving the fur
CONTRAfluran-RestgasfilterZeoSys GmbHFor anesthesia
Linex Nature N1030 Ruler 30 cmStaples Business Advantage60383For measuring papillomas
Medium CO2 Chamber 300 x 200 x 200mm - RedVetTech Solutions LtdAN045ARFor sacrifice
MekasoftMekalasi23008Table cover
Mice (Balb/c JRj)Janvier labsOther strains also possible
Mice (C57BL/6JRj)Janvier labsOther strains also possible
Panasonic Lumix DMC-FS5 Digital CameraPanasonic
ParaformaldehydeMerck30525-89-4For histology samples
Phorbol 12-myristate 13-acetate aka 12-Otetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)EnzoBML-PE160-0001
Precision balance PLJ-C/PLJ-GKERN & SOHN GmbHPLJ 600-3CM
Pre-Set CO2 System-2 Chamber-S/S HousingVetTech Solutions LtdAN044BXFor sacrifice
RNAlaterQiagen76104For nucleic acid samples
Tacta pipette 100-1000 ulSartoriusLH-729070
Tacta pipette 20-200 ulSartoriusLH-729060
UNO Anaesthetic Key FillerScintica instrumentation inc.For anesthesia
UNO Face Mask for MouseScintica instrumentation inc.For anesthesia
UNO FM2200 FlowmeterScintica instrumentation inc.For anesthesia
UNO Gas Exhaust UnitScintica instrumentation inc.For anesthesia
UNO Induction BoxScintica instrumentation inc.For anesthesia
UNO200VAP VaporizerScintica instrumentation inc.For anesthesia

Références

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