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Résumé

Un nouveau modèle sphétroïde tridimensionnel basé sur l’interaction hétérorotypic des cellules de tumeur et des fibroblastes stromal est établi. Ici, nous présentons la coculture des cellules de tumeur et des fibroblastes stromal, l’imagerie de time-lapse, et la microscopie confocale pour visualiser la formation des sphéroïdes. Ce modèle tridimensionnel offre une plate-forme pertinente pour étudier les interactions tumeur-stroma et tester la thérapeutique du cancer.

Résumé

Les interactions tumeur-stroma jouent un rôle important dans la progression du cancer. Les modèles sphéroïdes tumoraux tridimensionnels (3D) sont le modèle in vitro le plus largement utilisé dans l’étude des cellules souches/initiatrices du cancer, de la recherche préclinique sur le cancer et du dépistage des médicaments. Les modèles sphéroïdes 3D sont supérieurs à la culture conventionnelle des cellules tumorales et reproduisent certains caractères importants de tumeurs solides réelles. Cependant, les sphéroïdes conventionnels de tumeur 3D sont constitués exclusivement des cellules de tumeur. Ils manquent de la participation des cellules stromales de tumeur et ont le dépôt extracellulaire insuffisant de matrice (ECM), donc seulement partiellement imitant les conditions in vivo des tissus de tumeur. Nous avons établi un nouveau modèle sphéroïde 3D multicellulaire composé des cellules de tumeur et des fibroblastes stromal qui imite mieux le microenvironnement hétérogène de tumeur in vivo et son desmoplasia indigène. La formation de sphéroïdes est strictement régulée par les fibroblastes stromaux tumoraux et est déterminée par l’activité de certaines voies de signalisation intracellulaires cruciales (p. ex. signalisation Notch) dans les fibroblastes stromaux. Dans cet article, nous présentons les techniques pour la coculture des fibroblastes de cellules-stromal de tumeur, l’imagerie de time-lapse pour visualiser des interactions cellules-cellules, et la microscopie confocale pour montrer les dispositifs architecturaux 3D des sphéroïdes. Nous montrons également deux exemples de l’application pratique de ce modèle sphéroïde 3D. Ce nouveau modèle sphéroïde 3D multicellulaire offre une plate-forme utile pour étudier l’interaction tumeur-stroma, élucider comment les fibroblastes stromal régulent la tige de cancer/cellules initiatrices, qui déterminent la progression et l’agressivité de tumeur, et explorant la participation de la réaction stromale dans la sensibilité et la résistance de drogue de cancer. Cette plate-forme peut également être un modèle in vitro pertinent pour la découverte de médicaments.

Introduction

Les tumeurs solides représentent des tissus complexes composés de cellules néoplastiques et d’une grande variété de cellules stromales1,2,3,4. Les fibroblastes stromal, ou fibroblastes cancer-associés (CAF), sont l’une des populations principales de cellules stromales dans la plupart des types de tumeurs pleines. Ils sont impliqués de façon critique dans la régulation de la croissance tumorale, la tige, la métastes, l’angiogenèse, et la résistance aux médicaments par la production de facteurs de croissance, cytokines/chemokines, synthèse de l’ECM et le remodelage des enzymes (p. ex., collagène, fibronectin, et matrice metalloproteases), libération d’exosomes, et interaction hétérocypice-cellulaire5,6,7,7,9 ,10 11, . Les FAC participent également à la détermination de la métasse spécifique aux organes cancéreux en présélectionnant un sous-ensemble de clones tumoraux provenant de populations hétérogènes de cellules tumorales dans la lésion primaire et en favorisant ces clones sélectionnés à être préparés pour la métastes à un organe éloigné spécifique dont le microenvironnement est optimal pour la recolonisation de clones sélectionnés12. En outre, les fibroblastes et leurs facteurs solubles sécrétés et ECM participent à la modulation de l’angiogenèse tumorale13,14, réponse immunitaire anti-tumorale15, et sont même impliqués dans la résistance aux médicaments et la récurrence tumorale16,17.

In vitro 3D modèles sphéroïdes tumoraux ont été développés et utilisés dans la recherche sur le cancer comme un modèle intermédiaire entre les cultures in vitro de cellules cancéreuses et les modèles de tumeur in vivo18,19,20,21. Les modèles sphéroïdes de tumeur 3D ont gagné la popularité dans la recherche de cellules souches de cancer, la recherche préclinique de cancer, et le criblage de drogue parce que ces modèles reproduisent quelques dispositifs importants des tumeurs réelles qui sont absentes dans les monocouches 2D traditionnels22. Beaucoup de modèles sphéroïdes de tumeur 3D existants sont uniquement constitués des cellules de tumeur et manquent la participation des cellules stromal de tumeur. Ceci a souvent comme conséquence les sphéroïdes de tumeur ayant le dépôt insuffisant d’ECM et l’absence des interactions hétérocypic de cellule-cellule. Les sphéroïdes 3D conventionnels formés exclusivement par les cellules cancéreuses et l’adhérence cellulaire homotypique peuvent seulement imiter partiellement les conditions in vivo des tissus tumoraux. Pour surmonter certaines de ces limitations, les investigateurs ont proposé d’incorporer de multiples types de cellules stromal dans les cocultures 3D et ont développé plusieurs modèles sphéroïdes de tumeur 3D d’hétérotype23,24,25,26,27. En outre, les chercheurs ont utilisé des matrices 3D exogènes, y compris des hydrogels naturels ou des polymères synthétiques tels que le polyéthylène glycol, le poly (lactide- co-glycolide), et le poly (N-isopropylacrylamide), pour intégrer des modèles sphéroïdes monocellulaires et multicellulaires, créant ainsi un environnement de soutien cellulaire et reproduisant des interactions de matrice cellulaire28,29, ce qui rend ces systèmes plus biologiques etpluspertinents, ce qui rend ces systèmes plus biologiques et plus pertinents. Cependant, l’incorporation de certains types de cellules stromales, telles que les cellules endothéliales, dans les cocultures 3D entraîne une complexité supplémentaire pour un système in vitro et rend difficile l’étude des interactions hétérorotypic cellules-cellules entre deux types spécifiques de cellules, telles que les interactions cellules cancéreuses-fibroblaste. En outre, les cellules endothéliales dans les tissus réels n’interagissent pas toujours directement avec les cellules cancéreuses et autres cellules stromales parce qu’il y a une couche de membrane de sous-sol enveloppée à l’extérieur des capillaires qui empêche les cellules endothéliales d’interagir directement avec les cellules cancéreuses et d’autres cellules stromales. Dans ces modèles sphéroïdes 3D, les cellules endothéliales incorporées ne forment pas réellement des vaisseaux sanguins, mais interagissent directement avec les cellules cancéreuses et d’autres cellules stromales, quelque chose qui se produit rarement in vivo. De même, les matrices exogènes employées dans certains des modèles sphéroïdes 3D ne sont pas identiques à l’ECM dans les tissus tumoraux réels en termes de structure et de composition. Toutes ces conditions artificielles peuvent donner lieu à des données trompeuses.

Nous avons récemment créé un nouveau modèle sphéroïde 3D multicellulaire composé de cellules tumorales et de CAF. Dans notre modèle, la formation des sphéroïdes de tumeur 3D est entièrement déterminée par CAF. CAF induire et réguler le phénotype de la tige tumorale / cellules initiatrices. L’ECM produit par CAF est naturel et permet à la structure desmoplastique de mieux imiter le microenvironnement tumoral in vivo. Ce nouveau modèle 3D peut être un outil utile pour le dépistage des médicaments contre le cancer et offre une plate-forme unique pour étudier l’interaction tumeur-stroma, élucider comment les FAC régulent les cellules souches/initiatrices du cancer, et explorer la participation des interactions stromales dans la sensibilité et la résistance des médicaments contre le cancer.

Protocole

1. Cultiver des cellules de mélanome et des fibroblastes de peau

  1. Cultiver des cellules de mélanome humain
    1. Cellules de mélanome humain de culture, C816131 dans des conditions conventionnelles de culture de cellules adhérentes dans le milieu complet de W489 (voir l’étape 1.2) dans un incubateur de 37 oC fourni avec 5% CO2 comme décrit précédemment32. Divisez les cellules à un rapport de 1:5 lorsqu’elles atteignent 90 % de confluence.
  2. Milieu de culture de cellules de mélanome (W489)
    1. Pour le milieu complet W489, utilisez 80 % de MCDB153 moyen, 20 % de milieu L-15 (voir Tableau des matériaux),2 % de sérum bovin fœtal (FBS), 5 x g/mL d’insuline, 1,68 mM CaCl2et 0,11 % de bicarbonate de sodium. Pour la coculture, n’ajoutez pas FBS, insuline, et CaCl2.
  3. Isolement de fibroblaste de peau de souris
    1. Couper un fragment de peau de 1 cm x 1 cm d’une souris conformément aux lignes directrices et règlements pertinents du Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement (IACUC).
    2. Digdiérez la peau par dispase (voir Tableau des matériaux) à 4 oC pendant la nuit. Dénuder le derme de l’épiderme et digérer davantage avec de la collagène (1 mg/mL dans DMEM, voir Table of Materials) à température ambiante (RT) pendant la nuit.
  4. La culture du fibroblaste de peau de souris
    1. Laver les granulés de tissu avec PBS et les culture dans DMEM avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine en 37 c/5% CO2. Divisez les cellules à un rapport de 1:2 lorsqu’elles atteignent 90 % de confluence.
    2. Transduce les fibroblastes de peau avec GFP/lentivirus en utilisant des méthodes standard avant la coculture.
  5. Caractérisation des fibroblastes de peau de souris par immunostaining
    1. Préparation cellulaire pour la coloration
      1. Ensemencer les fibroblastes de la peau dans 24 plaques de puits à une densité de 2 x 104 cellules/ puits. Le jour 2, lavez les cellules avec PBS 2x et fixez-les dans une formaline tamponneutre neutre de 2 % pendant 10 min. Retirez la formaline et lavez les cellules fixes avec du PBS deux fois.
    2. Immunomarquage
      1. Ajouter 200 l de solution de blocage à chaque puits et incuber la plaque pendant 30 min à RT, puis ajouter la souris anti-SMA diluée à 1:200 et couver à 37 oC pendant 1 h. Laver avec PBS 3x, 5 min chacun.
      2. Ajouter Alex Fluor 488 chèvre anti-souris IgG à 1:400 dilution et incuber à RT pour 1 h. Laver les anticorps 3x avec PBS, 5 min chacun.
      3. Ajouter 1 IPC DAPI g/mL et incuber à RT pendant 2 min. Retirez la solution DAPI et ajoutez 500 L de PBS dans chaque puits.
      4. Observez les cellules et prenez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.
  6. Préétiquetage des fibroblastes et des cellules de mélanome
    1. Les fibroblastes de graines dans un plat de 100 mm le jour 1 de sorte que la confluence cellulaire atteigne 60% le lendemain. Le jour 2, retirez le milieu de culture et ajoutez le GFP/lentivirus (1:3 à 1:5 dilué du stock) dans le milieu de culture ordinaire avec 4 g/mL de polybrene. Incuber les cellules dans un incubateur de 37 oC pendant 6 h, retirer le milieu et remplacer par un milieu de culture frais et régulier. Après 2 jours, observez le signal gFP des cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence. Transduce c8161 cellules avec DsRed/lentivirus dans des conditions similaires. Les protocoles pour la préparation du GFP/lentivirus et du DsRed/lentivirus ont été décrits précédemment14,34.

2. Coculture cellulaire

  1. Ensemencer la coculture C8161-fibroblaste.
    1. Le jour 0 de l’essai de formation sphéroïde, détachez les fibroblastes de C8161 et de peau en utilisant 0.25% trypsin-EDTA. Faites tourner les cellules à 250 g pendant 5 min à RT et lavez une fois avec du PBS.
    2. Resuspendre les cellules dans le milieu de coculture cellulaire (sans sérum, sans insuline, et sans calcium W489 milieu mélangé avec du sérum libre DMEM à un rapport 1:1). Ajuster la concentration cellulaire à 2 x 104 cellules/mL.
    3. Mélanger les cellules C8161 avec les fibroblastes à un rapport de 1:1 et ajouter 2 ml des mélanges cellulaires à chaque puits d’une plaque de 24 puits. Chaque puits doit contenir 2 x 104 de chaque type de cellules. Chaque condition doit être faite en triple.
      REMARQUE : Il est important d’utiliser une plaque traitée à la culture non tissulaire (voir Tableau des matériaux). Dans le cas contraire, les cellules se fixent fortement à une plaque et ne peuvent pas suspendre les sphéroïdes.
  2. Incuber les cellules à 37 oC pendant 4 h jusqu’à ce que les cellules se fixent à la plaque, puis effectuer l’imagerie en accéléré ou le balayage confocal aux points de temps indiqués pour chaque analyse.

3. Imagerie en accéléré cellulaire en direct

  1. Avant la coculture, activez le système d’imagerie time-lapse (voir Tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant et laissez l’incubateur atteindre 37 oC et 5 % CO2. Il faut généralement 1 h pour que le système atteigne l’équilibre. Placez soigneusement la plaque de culture sur la scène du microscope à l’intérieur de l’incubateur et verrouillez solidement la porte.
  2. Ouvrez le logiciel du système d’imagerie time-lapse (voir Tableau des matériaux)et choisissez le type de plaque et le fabricant afin que le microscope puisse localiser la zone de numérisation avec précision. Choisissez les puits d’intérêt et une lentille objective 10x. Choisissez les paramètres de la zone de numérisation, le temps d’intervalle entre les scans, et un démarrage ainsi qu’une heure de fin. Dans ce protocole, le nombre de format maximum pour la zone de numérisation pour 1 puits est de 36 et le temps d’intervalle est de 1 h.
  3. Enregistrer l’imagerie en time-lapse de 4 à 52 h.
    REMARQUE : L’heure de départ, l’heure de fin et la durée doivent être optimisées par type de cellule et le but de l’expérience.
  4. Lorsque vous terminez l’enregistrement d’images, utilisez le logiciel du système d’imagerie time-lapse pour récupérer les données et exporter des vidéos ou des ensembles d’images.

4. Microscopie Confocal et films 3D

  1. Placez la plaque de coculture cellulaire sur le stade d’un microscope à fluorescence inversée (voir Tableau des matériaux)et utilisez des faisceaux laser rouges et verts. Observez les cellules sous une lentille objective 5x ou 10x et choisissez un sphéroïde pour commencer la numérisation.
  2. Utilisez un pas de 1 m z pour numériser du bas vers le haut du sphéroïde. Traiter les données à l’aide d’un logiciel de traitement d’image (voir Tableau des matériaux) pour reconstruire une image 3D qui peut être encore tournée et enregistrée comme un film 3D.

5. Culture solo des cellules de mélanome et formation des clusters/agrégats 2D

  1. Graine 2 x 104 cellules de mélanome C8161 dans chaque puits d’une plaque de 24 puits tel que décrit dans la section 2.1. Culture des cellules pendant 7 à 10 jours et photographiez-les à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.

6. Vérifier si les sphéroïdes 3D et les amas/agrégats de cellules 2D sont suspendus dans le milieu ou attachés aux plaques

  1. Pour la coculture cellulaire, vérifiez les sphéroïdes 3D formés le jour 7. Pour la culture d’une seule cellule, vérifiez les clusters/agrégats 2D formés le jour 10.
  2. Mettre des plaques de culture cellulaire sur la plate-forme d’un microscope à fluorescence inversée. Mettre une aiguille pliée avec une seringue dans un puits et aspirer doucement le milieu de culture à l’intérieur et à l’extérieur pour perturber le milieu de culture dans les puits. Enregistrez ce processus en utilisant le mode film du logiciel de film (voir Tableau des matériaux). Les sphéroïdes 3D seront mobiles, mais les clusters/agrégats de cellules 2D resteront stables.

7. Image confocale des sphéroïdes 3D

REMARQUE : Les cellules cocultivées commencent à former des sphéroïdes de 48 à 72 h selon le type de fibroblastes utilisés. Généralement, les sphéroïdes s’agrandissent progressivement avec le temps. Les petits sphéroïdes peuvent fusionner pour former de plus gros sphéroïdes jusqu’au jour 7. Une fois que les sphéroïdes sont stabilisés en taille, ils peuvent durer plus de 10 jours. Après cela, les sphéroïdes se détachent souvent du fond de la plaque de culture et se rassemblent au centre des puits. Pendant l’élargissement des sphéroïdes, les cellules du centre meurent généralement en raison d’une alimentation insuffisante et/ou d’un microenvironnement toxique. Par conséquent, le pic de la formation et du calendrier des sphéroïdes 3D pour l’image des sphéroïdes matures devrait être optimisé à l’aide d’expériences pilotes. Pour ce protocole, la microscopie confocale a été effectuée autour du jour 7 quand les sphéroïdes étaient mûrs et les cellules dans le centre des sphéroïdes étaient encore vivantes selon la fluorescence et la morphologie des cellules dans le centre.

  1. Pour faire de la microscopie confocale, utilisez un laser vert et rouge pour scanner les sphéroïdes. Déterminez la zone de balayage sous un objectif de 10x et déplacez-vous du bas vers le haut du sphéroïde avec un pas de 1 m z.
  2. Générez les vidéos de formation et de rotation du sphéroïde 3D à l’aide de la fonction de projection 3D du logiciel de traitement d’image (p. ex., ImageJ).

8. Intracellular Notch1 Signaling Pathway Activity in Determining Stromal Regulation of Cancer Stem/Initiating Cells 8. Intracellular Notch1 Signaling Pathway Activity in Determining Stromal Regulation of Cancer Stem/Initiating Cells 8. Intracellular Notch1 Signaling Pathway Activity in Determining Stromal Regulation of Cancer Stem/Initiating Cells 8.

  1. Isolement et caractérisation des fibroblastes cutanés des souris Notch1 à gain et perte de fonction
    1. Isoler les fibroblastes cutanés de deux paires de souris génétiquement modifiées : Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre-/-; Lessouris ROSALSL-N1ICMD/MD)par rapport à leur contrepartie (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; Souris ROSALSL-N1ICet Loss-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP)par rapport à leur contrepartie (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP-souris31, respectivement. Isoler et caractériser les fibroblastes cutanés à l’aide du protocole décrit dans les sections 1.3-1.5.
  2. Transduce les fibroblastes de peau de souris avec GFP/lentivirus.
    1. Voir la section 1 de la méthode pour transduire les cellules avec le vecteur lentiviral.
  3. Coculture de fibroblastes et de cellules de mélanome
    1. Mener l’expérience de coculture cellulaire telle que décrite à la section 2.
  4. Évaluer l’effet de l’activité intracellulaire de la voie Notch1 dans les fibroblastes sur la détermination de la régulation stromale des cellules souches cancéreuses/initiatrices en mesurant la taille des sphéroïdes 3D
    1. Effectuer la quantification de la formation de sphéroïdes sous chaque condition en photographiant les sphéroïdes au moment où les sphéroïdes sont matures (indiqué par l’arrêt de la croissance autour du jour 5-7 selon les types de fibroblastes). Mesurez la taille des sphéroïdes 3D à l’aide du logiciel de traitement d’image.

9. Test de la réponse médicamenteuse des cellules souches/initiatrices du cancer à l’aide de l’analyse sphéroïde 3D

REMARQUE : Les FAC peuvent réguler l’hétérogénicité du cancer et induire le phénotype des cellules souches/initiatrices du cancer. Les FAC appuient également les cellules souches cancéreuses/initiatrices pour supporter les traitements cliniques. Il a été démontré que les cellules souches cancéreuses sont responsables de la résistance aux médicaments. Par conséquent, nous avons utilisé ce modèle sphéroïde 3D pour évaluer la réponse médicamenteuse des cellules souches/initiatrices du cancer. Les résultats peuvent évaluer l’efficacité clinique potentielle des médicaments anticancéreux bien.

  1. Administration des médicaments
    1. Juste après avoir coculé les cellules dans une plaque de 24 puits, préparer les médicaments dans une dilution sérielle dans le milieu de culture pour atteindre 5x d’une gamme désirée de concentrations basées sur des expériences pilotes (c.-à-d., 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, et 25 nM).
      Ajouter 0,5 ml de solutions médicamenteuses correspondantes à chaque puits des cellules cocultivées. Traiter le groupe témoin avec des supports de coculture réguliers comme mentionné ci-dessus.
    2. REMARQUE : L’inhibiteur de MEK est soluble dans les médias de culture cellulaire. Par conséquent, les contrôles vides sont 2,5 ml de milieu de culture cellulaire. Cependant, si le médicament n’est pas soluble dans la solution aqueuse et nécessite des solvants tels que DMSO, alors les médias de culture cellulaire avec la même concentration de DMSO devraient être appliqués au groupe témoin.
  2. Quantification de la réponse aux médicaments en comptant les sphéroïdes
    1. Observez les cellules traitées et les cellules non traitées à l’aide d’un microscope à fluorescence et photographiez les cellules tous les jours. Quantifier la formation de sphéroïdes dans les différents groupes expérimentaux et comparer la capacité sphéroïde-formation des cultures cellulaires sous différentes concentrations de médicaments.
      REMARQUE : Les sphéroïdes ont tendance à apparaître 5 à 7 jours après la coculture. Les effets des médicaments deviendront perceptibles à ce moment-là.
    2. Utilisez le microscope à fluorescence pour imager/photographier les sphéroïdes et les cellules des puits, puis utilisez le logiciel d’image pour calculer la taille moyenne des sphéroïdes et le nombre de sphéroïdes formés par champ de faible puissance (LPF x 4) dans chaque groupe de traitement au fil du temps.
      REMARQUE : Les cellules qui reçoivent un traitement médicamenteux efficace devraient former moins ou pas de sphéroïdes par rapport au groupe témoin. C’est une indication de l’efficacité du médicament testé sur la suppression des cellules souches cancéreuses.

Résultats

Nous avons développé une nouvelle méthode pour générer des sphéroïdes 3D avec un système de coculture de cellules hétérocypiques in vitro qui imite le microenvironnement de tumeur in vivo. Les fibroblastes sont dérivés de fibroblastes de peau de souris. Les fibroblastes de peau ont été produits commedécrit ci-dessus et ont été caractérisés en tant que cellules de '-SMA '/Vimentin '/FSP-1'. Les cellules métastatiques humaines de mélanome (C8161) ont été cultivées dans le milieu de W489 comme décrit32. Pour visualiser et distinguer des fibroblastes des cellules de tumeur, les fibroblastes et les cellules de mélanome ont été prétransduced avec GFP/lentivirus et DsRed/lentivirus, respectivement34,36, avant la coculture cellulaire.

La figure 1 montre un exemple de sphéroïdes 3D multicellulaires formés par les cellules du mélanome et les fibroblastes. Les cellules de mélanome cultivées en l’absence des fibroblastes n’ont pas formé les sphéroïdes 3D typiques, bien que quelques cellules de mélanome forment des clusters/agrégats 2D avec la culture étendue. La taille moyenne des sphéroïdes était d’environ 170 à 360 m de diamètre (moyenne de 275, SD et 37) le jour 5 à 7. En utilisant l’imagerie time-lapse, nous avons observé que les fibroblastes et les cellules tumorales interagissaient en coculture et ont commencé à former des sphéroïdes 3D à environ 36 h de coculture comme le montre la vidéo 1. La formation en time-lapse a enregistré le processus dynamique de l’interaction cellule-cellule et la phase initiale de formation sphéroïde à 4 à 52 h de la coculture. Le pic de formation de sphéroïdes 3D s’est produit autour de la journée 5 à 7. Les sphéroïdes 3D formés étaient composés de fibroblastes et de cellules du mélanome, où la majorité (80 %) étaient des cellules tumorales. La vidéo 2 montre le processus dynamique des cellules de mélanome mono-cultivées (DsRedetC8161) dans la formation de grappes/agrégats cellulaires à partir de 4 à 52 h en culture unique. La formation de clusters/agrégats 2D a atteint un sommet vers le jour 7-10. La vidéo 3 et la vidéo 4 montrent les structures d’un sphéroïde 3D et d’un amas de cellules tumorales 2D visualisés par microscopie confocale, respectivement. Le sphéroïde 3D et les amas de cellules de tumeur 2D ont été examinés par microscopie confocale le jour 7 de la coculture cellulaire. La vidéo 5 montre que les sphéroïdes 3D ont été suspendus dans le milieu de culture et mobile, tandis que la vidéo 6 montre que le cluster de cellules tumorales 2D a été attaché à la plaque de culture et immobile. La suspension dans le milieu est une caractéristique des sphéroïdes 3D qui les distingue des clusters 2D. Lorsque le milieu du plat ou du puits de culture cellulaire est perturbé par une chute ou une pipetilisation délicate du milieu de culture, les sphéroïdes 3D suspendus se déplacent, tandis que les amas cellulaires 2D sont immobiles. Seules quelques cellules mortes sont mobiles.

La figure 2A montre un exemple de ce modèle 3D servant de plate-forme unique pour étudier les interactions tumeur-stroma et pour élucider comment l’activité intracellulaire de signalisation Notch1 dans les FAC régule la tige du cancer/les cellules initiatrices et la formation sphéroïde. Deux paires de fibroblastes (Fb) isolées de la peau de Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre-/-; Lessouris ROSALSL-N1ICMD/MD)par rapport à leur contrepartie (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; Souris ROSALSL-N1ICet Loss-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP)par rapport à leur contrepartie (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP-souris35, respectivement. Tous les fibroblastes ont été transducés par GFP/lentivirus et cocultivés avec des cellules de mélanome C8161 prétransduced avec DsRed/lentivirus. La formation image en accéléré montre que Fb-GOFNotch1 a empêché les cellules du mélanome C8161 de former des sphéroïdes 3D par rapport à Fb-GOFctrl au cours de la première 4-52 h de coculture cellulaire. En revanche, Fb-LOFNotch1 a favorisé la formation de sphéroïdes 3D par les cellules du mélanome C8161 par rapport à Fb-LOFctrl. Figure 2B, en haut, montre des images représentatives de sphéroïdes 3D formés le jour 7 de la coculture cellulaire avec différents fibroblastes effectuant des activités variées de voie Notch. La figure 2B, en bas, montre les données quantitatives sur la taille moyenne des sphéroïdes 3D formés le jour 7 de la coculture cellulaire avec différents fibroblastes porteurs d’activités variées de la voie Notch.

La figure 3 montre un exemple de ce modèle 3D utilisé pour tester la réponse médicamenteuse des cellules souches/initiatrices du cancer. Il a été démontré que les cellules souches/cellules initiatrices du cancer sont responsables de la résistance aux médicaments et de la récidive du cancer. Par conséquent, l’évaluation de la réponse médicamenteuse à l’aide de ce modèle 3D peut mieux révéler l’efficacité clinique d’un médicament potentiel pour le traitement du cancer. Les cellules de mélanome de C8161 comptent sur la signalisation active de MAPK pour la croissance et l’invasion de cellules. Ils expriment également des niveaux élevés de CDK4/Kit, mais ne portent pas une mutation BRAF. Pour tester la réponse médicamenteuse des cellules souches/initiatrices du cancer vers l’inhibiteur MAPK à l’aide de ce modèle 3D, nous avons coculture des cellules et des fibroblastes du mélanome C8161 dans 24 plaques de puits. PD0325901 (voir Tableau des matériaux),un inhibiteur MAPK, a été préparé dans une dilution sérielle à une gamme de concentrations de 1 nM, 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, et 25 nM. Le PD0325901 a été ajouté aux cocultures cellulaires lorsque les mélanges cellulaires ont été plaqués. Les cellules cocultivées non traitées ont été utilisées comme contrôle. Nous avons évalué la capacité sphéroïde-formation des cocultures cellulaires sous différentes concentrations de médicaments et l’avons comparée avec le contrôle non traité. La figure 3A montre des images représentatives de sphéroïdes 3D formés le jour 5 de la coculture cellulaire sous différentes concentrations de médicaments. La figure 3B est les données quantitatives de la taille moyenne par sphéroïde et le nombre de sphéroïdes 3D formés par champ de faible puissance (LPF x 4) le jour 5 de la coculture cellulaire sous différentes concentrations de médicaments.

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Figure 1 : Formation de sphéroïdes 3D et de clusters 2D. (A) Image représentative des sphéroïdes 3D formés par la coculture des cellules humaines de mélanome C8161 et des fibroblastes de peau de souris. Les sphéroïdes 3D ont été photographiés le jour 7 de la coculture des cellules de mélanome et des fibroblastes. La taille moyenne des sphéroïdes était de 170 à 360 m de diamètre (moyenne de 275, SD et 37) le jour 5 à 7. Le nombre moyen de sphéroïdes était de 18 à 26 (20,5 à 3,6) par champ de faible puissance (LPF x4). (B) Image représentative des amas de cellules tumorales 2D formées par la culture unique des cellules du mélanome C8161. Les grappes de cellules de mélanome 2D ont été photographiées le jour 7 de la culture simple des cellules de mélanome. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2 : Élucidation du rôle de l’activité intracellulaire de voie de signalisation Notch1 dans les FAC dans la régulation des cellules souches/initiatrices du cancer à l’aide du modèle sphéroïde 3D. (A) L’activité intracellulaire de signalisation Notch1 dans caf a déterminé la formation des sphéroïdes par des cellules de mélanome dans la coculture cellulaire. La vidéo time-lapse montre que Fb-GOFNotch1 a arrêté la formation de sphéroïdes 3D par les cellules du mélanome C8161, tandis que Fb-LOFNotch1 a favorisé la formation de plus de sphéroïdes 3D par les cellules du mélanome C8161 au cours des 4 à 52 premières heures de coculture cellulaire. (B) Haut : Images représentatives des sphéroïdes 3D formés le jour 7 de la coculture cellulaire avec différents fibroblastes portant des fonctions variées de voie notch. En bas : Les données quantitatives de la taille moyenne (diamètre [m]/sphéroïde) des sphéroïdes 3D formés le jour 7 de la coculture cellulaire avec différents fibroblastes portant des activités variées de la voie Notch. Le test t de l’étudiant à deux queues a été utilisé pour l’analyse statistique. Les données sont exprimées comme moyen d’écart type (DD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3 : Évaluation de la réponse médicamenteuse des cellules souches/initiatrices du cancer à l’aide du modèle sphéroïde 3D. (A) Images représentatives de sphéroïdes 3D formés le jour 5 de la coculture cellulaire sous différentes concentrations de médicaments. (B) Les données quantitatives de la taille moyenne (diamètre [m]/sphéroïde) et le nombre de sphéroïdes 3D par champ de faible puissance (LPF x 4) se sont formés le jour 5 de la coculture cellulaire sous différentes concentrations de médicaments. Les données quantitatives sont exprimées comme moyen d’écart type (DD). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Vidéo 1 : Processus dynamique de formation de sphéroïdes 3D dans la phase précoce de la coculture cellulaire. L’imagerie en accéléré montre des interactions cellulaires-cellules dynamiques entre les fibroblastes et les cellules tumorales dans la coculture et la formation de sphéroïdes 3D au cours de la première période de 4 à 52 h de coculture cellulaire. Les cellules ont commencé à former des sphéroïdes 3D autour de 48 h après le début de la coculture. Le pic de la formation sphéroïde 3D s’est produit le jour 5 à 7 (non affiché ici). Les sphéroïdes 3D étaient composés de fibroblastes et de cellules du mélanome, où la majorité (80 %) étaient des cellules tumorales. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

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Vidéo 2 : Processus dynamique de formation de grappes 2D dans la phase précoce de la coculture cellulaire. L’imagerie en accéléré montre le processus dynamique des grappes 2D formées par les cellules C8161melanoma en culture unique. La formation de clusters 2D s’est produite autour du jour 7 à 10. L’imagerie en accéléré enregistre la période de 4 à 52 h dans une culture unique de cellules de mélanomeDsRed/C8161. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

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Vidéo 3 : Architecture et rotation d’un sphéroïde 3D tel qu’il est visualisé par microscopie confocale. Architecture et rotation d’un sphéroïde 3D. Des lasers verts et rouges ont été employés pour balayage les sphéroïdes formés le jour 7 dans la coculture de cellules. La zone d’analyse a été déterminée selon un objectif de 10x. L’analyse commence du bas vers le haut du sphéroïde à un pas de 1 m z. Le film de rotation sphéroïde 3D a été créé à l’aide du logiciel Fidji. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

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Vidéo 4 : Architecture et rotation d’un groupe de cellules tumorales 2D tel que visualisé par microscopie confocale. Architecture et rotation d’un cluster 2D. Des images confocales des faisceaux de cellules ont été prises le jour 7 de la culture simple de cellule de mélanome. La zone d’analyse a été déterminée selon un objectif de 10x. L’analyse commence du bas vers le haut du sphéroïde à un pas de 1 m z. Le film de rotation de cluster 2D a été créé à l’aide du logiciel Fidji. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

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Vidéo 5: Mouvement des sphéroïdes 3D. Les sphéroïdes 3D ont été suspendus dans le milieu de culture et n’ont pas adhéré au plat de culture/bien. Quand encore moyen dans la culture cellulaire bien a été dérangé par pipeting doux, les sphéroïdes 3D suspendus déplacé. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

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Vidéo 6 : Constance des amas de cellules tumorales 2D. Le groupe de cellules de tumeur 2D a été ancré à la plaque de culture et immobile en dépit de la perturbation du milieu de culture. Quelques cellules mortes étaient mobiles. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Les techniques de culture cellulaire 3D in vitro sont largement utilisées depuis des décennies dans la recherche sur le cancer. Comparé aux systèmes conventionnels de culture de cellules 2D, le microenvironnement 3D récapitule les interactions cellules-cellulaires et/ou cellule-matrice et permet d’imiter les conditions authentiques observées dans les tissus tumoraux. Cependant, un système 3D formé uniquement par les cellules cancéreuses et les interactions cellules-cellules homotypiques ne tient pas compte de l’importance de la conversation croisée hétérorotypique et peut fournir des résultats inexacts dans la recherche. Nous avons récemment développé un nouveau système 3D combinant les cellules cancéreuses et LES FAC pour mieux imiter le microenvironnement hétérogène de tumeur in vivo et sa réaction desmoplastic indigène et raide.

Les fibroblastes sont des composants majeurs du stroma tumoral. CAF sont impliqués dans la régulation de la progression des tumeurs en obtenant des facteurs solubles, ECM / remodelage des enzymes10,11, et exosomes. En outre, CAF jouer un rôle dans la résistance aux médicaments et la récurrence tumorale16,17. Notre système sphéroïde 3D multicellulaire peut être utilisé pour explorer les mécanismes moléculaires des interactions tumeur-stromal et pour traiter la résistance aux médicaments et la récurrence tumorale. Les FAC sont principalement dérivés de fibroblastes quiescentlocaux locaux activés et ont recruté la moelle osseuse circulante MSC, qui subissent la différenciation in situ dans CAF dans le tissu tumoral37,38,39. Dans la présente étude, nous avons utilisé des fibroblastes de la peau pour créer un modèle sphéroïde 3D multicellulaire. Cependant, d’autres types de fibroblastes (par exemple, MSC-DF), fonctionnent également d’une manière très similaire que les fibroblastes de la peau pour réguler la formation de sphéroïdes 3D des cellules tumorales3D 34. MSC-DF peut être généré à partir de la moelle osseuse murine MSC, qui est enrichi par la culture des cellules mononucléaires de moelle osseuse dans le milieu de culture cellulaire MSC pendant environ 10 jours avec des changements moyens périodiques tous les 3 jours. Ces MSC sont caractérisés comme CD73/CD105-/Lin-. Pour différencier MSC en fibroblastes, MSC sont ensuite cultivés avec DMEM complet pendant 2 semaines supplémentaires. MSC-DF sont caractérisés comme'-SMA '/Vimentin '/FSP-1'cellules 36. MSC-DF peut être des régulateurs de tumeur importants. Puisqu’une fraction de CAF dans beaucoup de types de tumeurs pleines sont différenciées des MSC circulants recrutés libérés de la moelle36,MSC-DF peut être des cibles prometteuses de traitement. Ils sont également beaucoup plus facilement manipulés ou ciblés thérapeutiquement avant d’être recrutés dans des tissus tumoraux et différenciés en CAF. Ainsi, notre modèle 3D offre un système idéal pour étudier et tester non seulement les cellules cancéreuses, mais aussi différentes fractions ou sous-populations de CAF. La méthode pour la formation sphéroïde 3D est simple. Les étapes critiques incluent l’utilisation du milieu sans sérum pour la coculture, l’application du bon rapport des fibroblastes aux cellules tumorales, et l’utilisation des plaques de culture appropriées pour la coculture. La limitation potentielle de notre méthode est que la formation des sphéroïdes 3D est en grande partie dépendante de la lignée cellulaire cancéreuse. Notre protocole de formation sphéroïde peut nécessiter l’optimisation du rapport entre les fibroblastes et les cellules cancéreuses si différentes lignées de cellules cancéreuses sont utilisées. Il convient de noter que nous avons utilisé une cellule de mélanome humain et le modèle de coculture fibroblaste souris pour la formation de sphéroïdes 3D, car il est beaucoup plus facile de créer des cellules GOF ou LOF dans les fibroblastes de souris pour l’étude du rôle d’une molécule ou d’une voie de signalisation dans la régulation de la formation sphéroïde tumorale. La capacité des cellules du mélanome humain et des fibroblastes de souris à former des sphéroïdes indique que les molécules nécessaires aux communications cellulaires-cellules fonctionnent contre les espèces. Nous avons récemment testé la coculture de fibroblastes humains avec des cellules de mélanome humain et constaté que les fibroblastes humains peuvent également réguler les cellules du mélanome humain pour former des sphéroïdes 3D.

Nous avons employé les cellules métastatiques humaines de mélanome, C8161, dans notre modèle sphéroïde 3D multicellulaire. Nous avons également testé d’autres cellules de mélanome humain, par exemple, 1205Lu32, qui porte la mutation BRAFV600E, et MeWo, qui exprime des niveaux élevés de CDK4/Kit (ATCC HTB-65), et a constaté qu’ils sont également capables de former des sphéroïdes 3D en coculture. Ceci indique que la formation des sphéroïdes 3D par des cellules de tumeur est indépendante des types de mutations oncogènes. Bien que nous n’ayons pas testé si d’autres types de cellules tumorales autres que le mélanome sont capables de former des sphéroïdes 3D avec des fibroblastes, nos résultats indiquent que la formation de sphéroïdes 3D ne se limite pas à une lignée cellulaire du mélanome et peut ne pas dépendre d’une lignée spécifique de cellules cancéreuses.

Nous avons montré deux exemples d’applications pratiques de notre modèle sphéroïde 3D. Un exemple était d’élucider l’activité intracellulaire de voie de signalisation d’entaille en régulant la tige de cancer/initiateur de phénotype de cellules et la formation sphéroïde 3D. Nous avons démontré que la voie intracellulaire de signalisation d’entaille dans CAF est un commutateur moléculaire contrôlant le phénotype de la tige de cancer/cellules initiatrices utilisant ce modèle sphéroïde 3D. Nos résultats non seulement découvrent un mécanisme moléculaire sous-jacent à la régulation stromale des cellules de tige/initiatrice de cancer et de l’hétérogénisme de cancer, mais soulignent également que la voie de Notch dans CAF est une cible critique pour des thérapies de mélanome. Cet exemple indique que notre modèle sphéroïde 3D est très utile pour étudier les mécanismes pour les interactions cancéreux-stromal de fibroblaste et identifier les cibles thérapeutiques potentielles. Un autre exemple a été de tester la réponse médicamenteuse des cellules souches cancéreuses/initiatrices en présence des FAC. Il est bien connu que la réponse médicamenteuse des cellules cancéreuses, y compris les cellules souches cancéreuses/initiatrices, varie en présence et en absence de FAC. La présence de CAF dans ce système in vitro rend ce modèle plus pertinent sur le plan clinique et les résultats des tests générés sont plus fiables. De plus, notre système sphéroïde 3D est polyvalent. Il peut être utilisé à diverses fins. Par exemple, si des cellules cancéreuses pharmacorésistantes sont employées dans ce modèle 3D, il peut être changé pour traiter la résistance de drogue et peut-être la répétition de tumeur. Il peut également être modifié pour tester ou dépister les médicaments qui ciblent principalement les FAC pour le traitement du cancer. Les FAC sont récemment devenues des cibles thérapeutiques prometteuses. Il y a des avantages à cibler les FAC. Tout d’abord, par rapport aux cellules tumorales qui sont anormales (souvent avec des altérations génétiques) et intelligentes (facilement gagner une résistance à la chimio et les radiothérapies), CAF dans le tissu tumoral sont des cellules normales et génétiquement plus stable, de sorte qu’ils sont moins susceptibles de développer une résistance aux traitements. Deuxièmement, le ciblage des FAC ne dépend pas du type de mutations oncogènes dans les cellules tumorales. Troisièmement, le ciblage des FAC peut obtenir de multiples effets de succès par le biais de fibroblastes-dépendants anti-tumeur, anti-angiogenèse, et / ou la réponse immunitaire du cancer modulation. Notre modèle sphéroïde 3D est un outil puissant pour la découverte de divers ensembles de stratégies thérapeutiques contre le cancer.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions le Dr Omaida C. Velazquez (Université de Miami) pour sa collaboration, sa consultation et sa discussion utiles; Dr Jie Li (Université de Miami) pour fournir des cellules MeWo; et le Dr Meenhard Herlyn (The Wistar Institute) pour avoir fourni toutes les autres cellules du mélanome. Nous remercions également la Dre Marcia Boulina, directrice de l’installation de base d’imagerie analytique de l’Université de Miami, pour son analyse de l’imagerie. Zhao-Jun Liu a reçu le soutien de subventions du Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award- 09BN-11), de la Women’s Cancer Association (la53e subvention annuelle) et de fonds internes de l’Université de Miami.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-253-CI
24-well plateCorning351147Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgGLife TechnologyA21202
CaCl2 1.5 MSigma-AldrichC5670-500G
Collagenase, Type 1ASigma-AldrichC-2674500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM.
DakoCytomationDakox0909
DAPI
Dispase Grade IIRoche Diagnostics165859
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)Corning10-013-CV
Fetal Bovine SerumVMR97068-085Premium Grade
Fiji (ImageJ)NIHFree for downloading, no license needed.
IncuCyte Zoom 2016AEssen Bioscience
IncuCyte Zoom SystemEssen Bioscience
InsulinSigma-AldrichI1882
L-15 Medium (Leibovitz)Sigma-AldrichL1518
Leica SP5 Inverted Confocal MicroscopeLeica
MCDB 153 MediumSigma-AldrichM7403-10X1L
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monocloneAbcamab18640
Olympus IX51 Inverted Fluorescence MicroscopeOlympusIX51
Olymupus CellSensOlympus
PD0325901Selleckchem ChemicalsS1036
Penicillin Streptomycin SolutionCorning30-002- CI100 X
Sodium Bicarbonate 7.5%Corning25-035-CI

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