JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Установлена новая трехмерная сфероидная модель, основанная на гетеротипическом взаимодействии опухолевых клеток и стромальных фибробластов. Здесь мы представляем сокультуру опухолевых клеток и стромальных фибробластов, замедленной визуализации и конфокальной микроскопии для визуализации формирования сфероидов. Эта трехмерная модель предлагает соответствующую платформу для изучения опухолево-стромного взаимодействия и тестирования терапии рака.

Аннотация

Опухолево-стромноговзаимодействия играют важную роль в прогрессировании рака. Трехмерные (3D) опухолевые модели сфероидов являются наиболее широко используемыми моделью in vitro при изучении раковых стволовых/инициирующих клеток, доклинических исследованиях рака и скрининге лекарств. 3D сфероидные модели превосходят традиционную культуру опухолевых клеток и воспроизводят некоторые важные символы реальных твердых опухолей. Однако обычные 3D-опухолевые сфероиды состоят исключительно из опухолевых клеток. Они не имеют участия опухолевых стромальных клеток и имеют недостаточное внеклеточное matrix (ECM) осаждение, таким образом только частично имитируя in vivo условия туморных тканей. Мы создали новую многоклеточную 3D-сфероидную модель, состоящую из опухолевых клеток и стромальных фибробластов, которая лучше имитирует неоднородную микросреду in vivo tumor и ее родную десмоплазию. Формирование сфероидов строго регулируется опухолевыми стромальными фибробластами и определяется активностью некоторых важнейших внутриклеточных сигнальных путей (например, сигнализации Ночка) в стромальных фибробластах. В этой статье мы представляем методы кокультуры опухолевых клеток-стромневых фибробластов, замедленной визуализации для визуализации взаимодействия клеток и конфокальной микроскопии для отображения 3D архитектурных особенностей сфероидов. Мы также показываем два примера практического применения этой 3D сфероидной модели. Эта новая многоклеточная 3D сфероидная модель предлагает полезную платформу для изучения взаимодействия опухолево-стромы, разъясняя, как стромальные фибробласты регулируют раковые стволовые/инициационные клетки, которые определяют прогрессирование опухоли и агрессивность, и изучает участие стромальной реакции в чувствительности и резистентности к раковым препаратам. Эта платформа также может быть соответствующей моделью in vitro для обнаружения наркотиков.

Введение

Твердые опухоли представляют сложные ткани, состоящие из неопластических клеток и большого разнообразия стромальных клеток1,2,3,4. Стромальные фибробласты, или связанные с раком фибробласты (CAF), являются одним из видных популяций стромальных клеток в большинстве типов твердых опухолей. Они критически участвуют в регулировании роста опухоли, стволовые, метастазы, ангиогенез, и лекарственная устойчивость через производство факторов роста, цитокинов / хемокины, синтез ECM и ремоделирования ферментов (например, коллаген, фибронектин, и матрицы металлопротеазы), высвобождение экзосомы, и прямой гетероций кcell-взаимодействия5,7,9,11, 10, . CAF также принять участие в определении рака органа конкретных метастазов путем предварительного отбора подмножество опухолевых клонов из гетерогенных популяций опухолевых клеток в первичном поражении и содействие эти выбранные клоны, которые будут загрунтованы для метастазов к конкретному удаленному органу, микроокружение которого является оптимальным для повторной колонизации выбранных клонов12. Кроме того, фибробласты и их выделяемые растворимые факторы и ECM участвуют в модуляции опухолевого ангиогенеза13,14,противоопухолевого иммунного ответа15,и даже участвуют в лекарственной устойчивости и рецидиве опухоли16,17.

In vitro 3D опухоли сфероидмодели были разработаны и использованы в исследованиях рака в качестве промежуточной модели между in vitro раковых клеток культур и in vivo модели опухоли18,19,20,21. 3D опухоли сфероидмодели приобрели популярность в исследовании раковых стволовых клеток, доклинических исследований рака, и скрининг наркотиков, потому что эти модели воспроизводят некоторые важные особенности реальных опухолей, которые отсутствуют в традиционных 2D монослоев22. Многие существующие 3D опухолевые сфероидные модели являются исключительно образовавшиеся из опухолевых клеток и не участвуют в работе опухолевых стромальных клеток. Это часто приводит к опухолевых сфероидов, имеющих недостаточное осаждение ECM и отсутствие гетеротипических клеточных взаимодействий. Обычные 3D-сфероиды, образованные исключительно раковыми клетками и гомотипической клеточной сливкой, могут лишь частично имитировать условия in vivo опухолевых тканей. Чтобы преодолеть некоторые из этих ограничений, исследователи предложили включить несколько типов стромальных клеток в 3D-культуры и разработали несколько гетеротипов 3D опухолевых сфероидовмодели 23,24,25,26,27. Кроме того, исследователи использовали экзогенные 3D матрицы, в том числе природные гидрогели или синтетические полимеры, такие как полиэтиленгликоль, поли (лактид-ко-гликолид),и поли (N-isopropylacrylamide), для встраивания моноклеточныхи многоклеточных сфероидных моделей, создавая клеточную среду и воспроизводя клеточные матрицы28. Тем не менее, включение некоторых типов стромальных клеток, таких как эндотелиальные клетки, в 3D-кокультуры приводит к дополнительной сложности для системы in vitro и затрудняет изучение гетеротипических клеточных взаимодействий между двумя конкретными типами клеток, таких как раковые клеточные фибробластные взаимодействия. Кроме того, эндотелиальные клетки в реальных тканях не всегда напрямую взаимодействуют с раковыми клетками и другими стромальными клетками, потому что есть слой подвальной мембраны, обернутый за пределами капилляров, что предотвращает непосредственное взаимодействие эндотелиальных клеток с раковыми клетками и другими стромальными клетками. В этих 3D сфероидных моделей, включенных эндотелиальных клеток на самом деле не образуют кровеносные сосуды, но взаимодействуют непосредственно с раковыми клетками и другими стромальными клетками, то, что редко происходит in vivo. Аналогичным образом, экзогенные матрицы, используемые в некоторых 3D сфероидных моделях, не идентичны ECM в реальных опухолевых тканях с точки зрения структуры и состава. Все эти искусственные условия могут привести к вводящим в заблуждение данным.

Недавно мы создали новую многоклеточную 3D-сфероидную модель, состоящую из опухолевых клеток и CAF. В нашей модели, образование 3D опухолевых сфероидов полностью определяется CAF. CAF индуцировать и регулировать фенотип опухолевых стволовых / инициирующих клеток. ECM производства CAF является естественным и позволяет десмопластической структуры, чтобы лучше имитировать микроокружение опухоли in vivo. Эта новая 3D модель может быть полезным инструментом для скрининга наркотиков рака и предлагает уникальную платформу для изучения опухоли-стромы взаимодействия, разъяснять, как CAF регулировать рак стволовых / инициирующих клеток, и изучить участие стромальных взаимодействий в чувствительность и резистентность к раковым препаратам.

протокол

1. Культивирование клеток меланомы и фибробластов кожи

  1. Культивирование клеток меланомы человека
    1. Культура клеток меланомы человека, C816131 в обычных условиях культуры адепта клеток в полной среде W489 (см. шаг 1.2) в инкубаторе 37 градусов по Цельсию поставляется с 5% CO2, как описано ранее32. Разделите клетки в соотношении 1:5, когда они достигают 90% выпуклости.
  2. Меланома клеточной культуры среды (W489)
    1. Для полного W489 среды, используйте 80% MCDB153 среднего, 20% L-15 среднего (см. Таблица материалов), 2% плода крупного рогатого скота сыворотки (FBS), 5 мкг /мл инсулина, 1,68 мМ CaCl2, и 0,11% бикарбонат натрия. Для сокультуры не добавляйте FBS, инсулин и CaCl2.
  3. Мышь кожи фибробластизоляции
    1. Вырежьте фрагмент кожи 1 см х 1 см от мыши в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами Комитета по уходу и использованию животных учреждения (IACUC).
    2. Дайджест кожи путем диспази (см. Таблица материалов) при 4 градусах Цельсия в одночасье. См. Таблицу материалов( при комнатной температуре (RT) на ночь см.
  4. Мышь кожи фибробластов культивирования
    1. Вымойте ткани гранулы с PBS и культуры их в DMEM с 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина в 37 КС / 5% CO2. Разделение клеток в соотношении 1:2, когда они достигают 90% выпуклости.
    2. Преобразуем фибробласты кожи с помощью GFP/лентивирусса, используя стандартные методы перед кокультурой.
  5. Характеристика фибробластов кожи мыши путем иммуносохранения
    1. Подготовка клеток для окрашивания
      1. Семена кожи фибробластов в 24 хорошо пластины при плотности 2 х 104 клетки / хорошо. На второй день, мыть клетки с PBS 2x и исправить их в 2% нейтральный буферный формалин в течение 10 минут. Удалить формалин и мыть фиксированные клетки с PBS в два раза.
    2. Иммуностоинг
      1. Добавьте 200 qL блокирующего раствора к каждому колодцу и инкубировать пластину в течение 30 минут на РТ, затем добавьте мышь против-Я-СМА разбавленной в 1:200 и инкубировать при 37 кв С в течение 1 ч. Промойте с PBS 3x, 5 мин каждый.
      2. Добавить Алекс Fluor 488 коза анти-мышь IgG в 1:400 разбавления и инкубировать на RT в течение 1 ч. Вымойте антитела 3x с PBS, 5 мин каждый.
      3. Добавьте 1 мкг/мл DAPI и инкубировать на RT в течение 2 мин. Удалите dAPI раствор и добавьте 500 л PBS в каждую скважину.
      4. Наблюдайте за клетками и принимайте изображения с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа.
  6. Предварительная маркировка фибробластов и клеток меланомы
    1. Фибробласты семян в 100 мм блюдо на 1 день так, что клеточная стоя достигает 60% на следующий день. На второй день, удалить культуры среды и добавить GFP / лентивирус (No 1:3-1:5 разбавленного из запасов) в обычной среде культуры с 4 мкг /мл полибрена. Инкубировать клетки в инкубаторе 37 градусов по Цельсию в течение 6 ч, удалить среду и заменить свежей обычной культуры среды. Через 2 дня наблюдайте сигнал GFP от клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Преобразуй клетки C8161 с помощью DsRed/лентивируса при аналогичных условиях. Протоколы для подготовки GFP / лентивирус и DsRed / лентивирус были описаны ранее14,34.

2. Клеточная кокультура

  1. Семена C8161-фибробластной кокультуры.
    1. На день 0 сфероид образования асссее, отсоединить как C8161 и фибробластов кожи с помощью 0,25% трипсин-EDTA. Спин вниз клетки на 250 г в течение 5 минут на RT и мыть один раз с PBS.
    2. Resuspend клетки в среде сокультуры клетки (сыворотки свободного, инсулина свободного, и средства W489 свободного, смешанного с сывороткой свободноd DMEM на коэффициенте 1:1). Отрегулируйте концентрацию клеток до 2 х 104 ячеек/мл.
    3. Смешайте клетки C8161 с фибробластами в соотношении 1:1 и добавьте 2 мл клеточных смесей к каждой скважине из 24 скважин. Каждая скважина должна содержать 2 x 104 из каждого типа клеток. Каждое условие должно быть сделано в тройном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать не-ткани культуры обработанные пластины (см. Таблица материалов). В противном случае, клетки будут сильно прикрепляться к пластине и не в состоянии от приостановки сфероидов.
  2. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию в течение 4 ч до тех пор, пока клетки не прикрепят к пластине, а затем выполняйте замедленное изображение или конфоковое сканирование в указанные временные точки для каждого исследования.

3. Live Cell Time-lapse Imaging

  1. Перед сокультурой включите систему визуализации замедленного времени (см. Таблицу Материалов)в соответствии с инструкциями производителя и дайте инкубатору достичь 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Обычно для достижения равновесия система обычно занимает 1 ч. Аккуратно поместите культурную пластину на сцену микроскопа внутри инкубатора и надежно запереть дверь.
  2. Откройте программное обеспечение системы визуализации замедленного действия (см. Таблица Материалов)и выберите тип пластины и производителя, чтобы микроскоп мог точно определить область сканирования. Выберите интересные скважины и объектив в 10 раз. Выберите настройки для области сканирования, интервал времени между сканированием и время запуска, а также время окончания. В этом протоколе максимальное количество формата для области сканирования для 1 скважины составляет 36, а интервал времени — 1 ч.
  3. Запись замедленного изображения от 4-52 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время начала, время окончания и продолжительность должны быть оптимизированы по типу ячейки и цели эксперимента.
  4. При заполнении записи изображений используйте программное обеспечение системы визуализации замедленного времени для получения данных и экспорта видео или наборов изображений.

4. Конфокальная микроскопия и 3D фильмы

  1. Поместите плиту клеточной кокультуры на стадию перевернутого флуоресцентного микроскопа (см. Таблица Материалов)и используйте красные и зеленые лазерные лучи. Наблюдайте клетки под объективом 5x или 10x объективным и выберите сфероид для того чтобы начать сканировать.
  2. Используйте 1 мкм z-шаг для сканирования снизу вверх сфероида. Обработайте данные с помощью программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблица материалов),чтобы реконструировать 3D-изображение, которое может быть дополнительно повернуто и сохранено в виде 3D-фильма.

5. Индивидуальная культура клеток меланомы и формирование 2D кластеров/агрегатов

  1. Семена 2 х 104 C8161 клетки меланомы в каждый колодец 24 хорошо пластины, как описано в разделе 2.1. Культура клетки в течение 7-10 дней и сфотографировать их с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа.

6. Проверка, если 3D сфероиды и 2D-клеточные кластеры / агрегаты приостановлены в средних или прилагается к пластинам

  1. Для клеточной кокультуры проверьте 3D сфероиды, образовавшиеся на 7-й день. Для культуры одноклеточных элементов проверьте 2D-кластеры/агрегаты, сформированные на 10-й день.
  2. Установите пластины культуры клеток на платформе перевернутого флуоресцентного микроскопа. Положите изогнутую иглу со шприцем в колодец и мягко аспирировать культуры среды и из нарушить культуры среды в колодцах. Запись этого процесса с помощью режима фильма программного обеспечения фильма (см. Таблица материалов). 3D-сфероиды будут мобильными, но 2D-клеточные кластеры/агрегаты останутся стойкими.

7. Конфоковое изображение 3D сфероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Cocultured клетки начинают образовывать сфероиды от 48-72 h в зависимости от типа fibroblasts использовано. Как правило, сфероиды постепенно увеличиваются со временем. Малые сфероиды могут слиферировать для формирования больших сфероидов до 7-го дня. После того, как сфероиды стабилизируются в размерах, они могут длиться более 10 дней. После этого сфероиды часто отсоединяются от нижней части культурной плиты и собираются в центре колодцев. Во время расширения сфероидов клетки в центре обычно умирают из-за недостаточного питания и/или токсичной микросреды. Таким образом, пик 3D сфероидного образования и сроки для изображения созрели сфероиды должны быть оптимизированы с помощью экспериментальных экспериментов. Для этого протокола, конфокальная микроскопия была выполнена около 7-го дня, когда сфероиды созрели и клетки в центре сфероидов были еще живы в соответствии с флуоресценцией и морфологией клеток в центре.

  1. Для делать конфокальной микроскопии, используйте зеленый и красный лазер для сканирования сфероидов. Определите область сканирования под 10x целью и перемещайтесь снизу на вершину сфероида с 1 мкм z-шагом.
  2. Создание 3D сфероидного образования и видео вращения с использованием функции 3D-проекции программного обеспечения обработки изображений (например, ImageJ).

8. Внутриклеточные Notch1 Сигнализация Путь деятельности в определении стромального регулирования рака стволовых / инициирующих клеток

  1. Изоляция и характеристика фибробластов кожи от усиления и потери функции Notch1 мышей
    1. Изолировать фибробласты кожи от двух пар генетически модифицированных мышей: Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre ROSALSL-N1IC / )мышей по сравнению с их коллегой управления (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC-мышей и Loss-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre Мышей Notch1LoxP/LoxP/ ) мышей по сравнению с их аналогом (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP-мышей 31, соответственно. Изолировать и охарактеризовать фибробласты кожи с помощью протокола, описанного в разделах 1.3-1.5.
  2. Преобразуй фибробласты кожи мыши с помощью GFP/лентивируса.
    1. См. раздел 1 для метода преобразовывания клеток с лентивирусным вектором.
  3. Кокультура фибробластов и клеток меланомы
    1. Проведите эксперимент по кокультуре клеток, как описано в разделе 2.
  4. Оценка влияния внутриклеточной активности пути Notch1 в фибробластах на определение стромальной регуляции раковых стволовых/инициирующих клеток путем измерения размеров 3D сфероидов
    1. Провести количественную оценку образования сфероидов при каждом условии фотографирования сфероидов в то время, когда сфероиды созревают (о чем свидетельствует остановка роста вокруг дня 5-7 в зависимости от типов фибробластов). Измерьте размеры 3D сфероидов с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

9. Тестирование ответ на лекарственные препараты рака стволовых / инициирующих клеток с использованием 3D сфероидной анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: CAF может регулировать гетерогенность рака и индуцировать фенотип рака стволовых / инициирующих клеток. CAF также поддерживает рак стволовых / инициирующих клеток, чтобы выдержать клиническое лечение. Раковые стволовые клетки, как было показано, несут ответственность за лекарственную устойчивость. Таким образом, мы использовали эту 3D сфероидную модель для оценки лекарственной реакции раковых стволовых /инициирующих клеток. Результат может оценить потенциальную клиническую эффективность противораковых препаратов хорошо.

  1. Медикаментов
    1. Сразу после сокультивации клеток в 24 скважины, подготовить препараты в серийном разбавлении в среде культуры, чтобы достичь 5x желаемого диапазона концентраций на основе экспериментальных экспериментов (т.е., 1 нм, 2,5 нм, 5 нм, 10 нм, и 25 нм).
      Добавьте 0,5 мл соответствующих лекарственных растворов к каждой скважине клеток- культуры. Относитесь к контрольной группе с регулярными средствами массовой информации совместной культуры, как упоминалось выше.
    2. ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибитор MEK растворим в средствах массовой информации клеточной культуры. Таким образом, пустые элементы управления 2,5 мл среды клеточной культуры. Однако, если препарат не растворим в водном растворителе и требует растворителей, таких как DMSO, то средства культуры клеток с той же концентрацией ДМСО должны быть применены к контрольной группе.
  2. Количественная оценка реакции на лекарства путем подсчета сфероидов
    1. Наблюдайте за обработанными клетками и необработанными клетками с помощью флуоресцентного микроскопа и фотографируйте клетки каждый день. Количественное образование сфероидов в различных экспериментальных группах и сравнить сфероид-образующей способности клеточных культур при различных концентрациях наркотиков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды, как правило, появляются через 5-7 дней после сокультуры. Эффекты препарата станут заметными в этот момент времени.
    2. Используйте флуоресценционный микроскоп для изображения /фотографии сфероидов и клеток в колодцах, а затем используйте программное обеспечение для изображения для расчета среднего размера сфероидов и количества сфероидов, образуютемых в поле низкой мощности (LPF x 4) в каждой группе лечения с течением времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, которые получают эффективное лечение наркотиками должны образовывать меньше или нет сфероидов по сравнению с контрольной группой. Это свидетельствует об эффективности тестируемого препарата на подавление раковых стволовых клеток.

Результаты

Мы разработали новый метод для создания 3D сфероидов с в ипроцей гетеротипической системы клеток, которая имитирует in vivo опухоли микроокружения. Фибробласты являются производными от фибробластов кожи мыши. Фибробласты кожи были созданы, как описано выше, и были охарактеризованы какклетки з-СМА/Vimentin/FSP-1. Клетки метастатической меланомы человека (C8161) были культивированы в среде W489, как описано32. Для визуализации и отличия фибробластов от опухолевых клеток, фибробласты и клетки меланомы были предтрансудированы с GFP/ лентивирус и DsRed / лентивирус, соответственно34,36, до клеточной кокультуры.

На рисунке 1 показан пример многоклеточных 3D-сфероидов, образованных путем кокультирования клеток меланомы и фибробластов. Клетки меланомы, культивированные при отсутствии фибробластов, не образуют типичных 3D сфероидов, хотя некоторые клетки меланомы образуют 2D кластеры/агрегаты с расширенной культурой. Средний размер сфероидов составлял примерно 170-360 мкм в диаметре (средний - 275, SD - 37) в день 5-7 евро. Используя замедленное изображение, мы заметили, что фибробласты и опухолевые клетки взаимодействуют в кокультуре и начали формировать 3D сфероиды на уровне около 36 ч кокультуры, как показано в видео 1. Визуализация замедленного времени зафиксировала динамический процесс взаимодействия клеток и начальную фазу образования сфероидов на уровне 4-52 ч кокультуры. Пик 3D образования сфероидов пришелся на день 5–7. Сформированные 3D сфероиды состояли из фибробластов и клеток меланомы, где большинство (80%) были опухолевые клетки. Видео 2 показывает динамический процесс отдельных культивированных клеток меланомы (DsRed/C8161) в формировании клеточного кластера / агрегатов, начиная с 4-52 ч в одной культуре. Формирование 2D-кластеров/агрегатов достигло пика в дневное время 7–10. Видео 3 и Видео 4 показывают структуры 3D сфероида и 2D опухолевого клеточного кластера, визуализированного с помощью конфокальной микроскопии, соответственно. 3D сфероидные и 2D опухолевые клетки были исследованы конфокальной микроскопией на 7-й день клеточной кокультуры. Видео 5 показывает, что 3D сфероиды были приостановлены в среде культуры и мобильных, в то время как видео 6 показывает, что 2D кластер опухолевых клеток был прикреплен к культуре пластины и неподвижно. Подвеска в среде является особенностью 3D сфероидов, которая отличает их от 2D кластеров. Когда среда в тарелке культуры клетки или наилучшим образом нарушена или падать или нежно pipetting среда культуры, suspended сфероиды 3D двигают, тогда как 2D кластеры клетки неподвижны. Лишь несколько одиночных мертвых клеток являются мобильными.

На рисунке 2показан пример этой 3D-модели, выступающей в качестве уникальной платформы для изучения опухолевых строма взаимодействий и выяснить, как внутриклеточная активность Notch1 сигнализации пути в CAF регулирует рак стволовых / инициирующих клеток и сфероидов формирования. Две пары фибробластов (Fb), изолированные от кожи Gain-Of-Function Notch1 (GOFNotch1: Fsp1.Cre ROSALSL-N1IC / )мышей по сравнению с их коллегой управления (GOFctrl : FSP1. Cre-/-; ROSALSL-N1IC-мышей и Loss-Of-Function Notch1 (LOFNotch1: Fsp1.Cre Мышей Notch1LoxP/LoxP/ ) мышей по сравнению с их аналогом (LOFctrl : FSP1. Cre-/-; Notch1LoxP/LoxP-мышей 35, соответственно. Все фибробласты были трансумции GFP / лентивирус и cocultured с C8161 клеток меланомы pretransduced с DsRed / лентивирус. Time-lapse визуализации показывает, что Fb-GOFNotch1 остановилc C8161 клетки меланомы от формирования 3D сфероидов по сравнению с Fb-GOFctrl во время первого 4-52 ч клеточной кокультуры. В отличие от этого, Fb-LOFNotch1 способствовало образованию 3D сфероидов клетками меланомы C8161 по сравнению с fb-LOFctrl. Рисунок 2B, сверху, показывает репрезентативные изображения 3D сфероидов, образованных на 7-й день клеточной кокультуры с различными фибробластами, осуществляющих различные деятельности Ноч пути. Рисунок 2B, дно, показывает количественные данные о среднем размере 3D сфероидов, сформированных на 7-й день клеточной кокультуры с различными фибробластами, несущими различные виды деятельности, проявляющие путь Notch.

На рисунке 3 показан пример этой 3D-модели, используемой для проверки лекарственной реакции раковых стволовых/инициирующих клеток. Рак стволовых / инициирующих клеток было показано, что несет ответственность за лекарственную устойчивость и рецидив рака. Таким образом, оценка ответ ных лекарств с помощью этой 3D-модели может лучше выявить клиническую эффективность потенциального препарата для лечения рака. Клетки меланомы C8161 полагаются на активные сигналы MAPK для роста клеток и вторжения. Они также выражают высокий уровень CDK4/Kit, но не несут мутации BRAF. Чтобы проверить лекарственный ответ раковых стволовых /инициирующих клеток к ингибитору MAPK с помощью этой 3D-модели, мы соврали клетки меланомы C8161 и фибробласты в 24 скважинных пластинах. PD025901 (см. Таблица материалов),ингибитор MAPK, был подготовлен в последовательном разбавлении в диапазоне концентраций от 1 нм, 2,5 нм, 5 нм, 10 нм и 25 нм. PD0325901 был добавлен в клеточные кокультуры, когда клеточные смеси были покрыты. Необработанные клетки cocultured были использованы как управление. Мы оценили сфероиднообразующую способность клеточных культур при различных концентрациях лекарств и сравнили их с необработанным контролем. На рисунке 3А показаны репрезентативные изображения 3D сфероидов, образовавшихся на 5-й день клеточной кокультуры при различных концентрациях наркотиков. Рисунок 3B — это количественные данные о среднем размере на сфероид и количествах 3D сфероидов, образуювшихся на низкоэнергетическое поле (LPF x 4) на 5-й день клеточной кокультуры при различных концентрациях наркотиков.

figure-results-6779
Рисунок 1: Формирование 3D сфероидов и 2D кластеров. (A) Представитель изображение 3D сфероидов, образованных кокультурой клеток меланомы человека C8161 и фибробластов кожи мыши. 3D сфероиды были сфотографированы на 7-й день кокультуры клеток меланомы и фибробластов. Средние размеры сфероидов составили 170-360 мкм в диаметре (средний - 275, SD - 37) в день 5-7 евро. Среднее количество сфероидов составляло 18-26 (20,5 и 3,6) на низкое поле мощности (LPF x4). (B) Репрезентативное изображение 2D опухолевых клеток, образованных одной культурой клеток меланомы C8161. 2D меланомы клеток кластеров были сфотографированы на 7-й день одной культуры клеток меланомы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-7806
Рисунок 2: Разотворение роли внутриклеточной Активности Нотч1 сигнализации пути в CAF в регулировании рака стволовых / инициирующих клеток с помощью 3D сфероидной модели. (A) Внутриклеточная Активность сигнального пути Notch1 в CAF определила образование сфероидов клетками меланомы в клеточной кокультуре. Повремени видео показывает, что Fb-GOFNotch1 остановил образование 3D сфероидов клетками меланомы C8161, в то время как Fb-LOFNotch1 способствовал образованию более 3D сфероидов клетками меланомы C8161 в течение первых 4-52 ч клеточной кокультуры. (B) Топ: Репрезентативные изображения 3D сфероидов, образовавшихся на 7-й день клеточной кокультуры с различными фибробластами, несущими разнообразные функции нотча. Внизу: Количественные данные о среднем размере (диаметр (диаметр (мкм) /сфероид) 3D сфероидов, образовавшихся на 7-й день клеточной кокультуры с различными фибробластами, несущими различные виды деятельности нотч-пути. Для статистического анализа был использован двуххвостый студенческий тест. Данные выражаются в виде среднего стандартного отклонения (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-9270
Рисунок 3: Оценка лекарственной реакции раковых стволовых/инициирующих клеток с использованием 3D-модели сфероидов. (A) Представитель изображения 3D сфероидов, образуюсложиль на 5-й день клеточной кокультуры при различных концентрациях наркотиков. (B) Количественные данные о среднем размере (диаметр (диаметр мкм/сфероид) и количестве 3D сфероидов на низкое поле мощности (LPF x 4), образующихся на 5-й день клеточной кокультуры при различных концентрациях наркотиков. Количественные данные выражаются в виде среднего стандартного отклонения (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-10182
Видео 1: Динамический процесс формирования 3D сфероидов на ранней стадии клеточной кокультуры. Визуализация по времени показывает динамические взаимодействия клеток между фибробластами и опухолевыми клетками в кокультуре и образование 3D-сфероидов в течение первого 4-52 ч клеточной кокультуры. Клетки начали образовывать 3D сфероиды около 48 ч после начала кокультуры. Пик 3D образования сфероидов пришелся на день 5-7 (не отображается здесь). 3D сфероиды состояли из фибробластов и клеток меланомы, где большинство (80%) были опухолевые клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

figure-results-11025
Видео 2: Динамический процесс формирования 2D кластеров на ранней стадии клеточной кокультуры. Визуализация замедленного времени показывает динамический процесс 2D кластеров, образованных клетками C8161melanoma в одной культуре. Формирование 2D-кластеров происходило в течение дня 7-10. Time-lapse изображений записывает период 4-52 ч водной культуре DsRed /C8161 меланомы клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

figure-results-11713
Видео 3: Архитектура и вращение 3D сфероида, как визуализировано конфокальной микроскопии. Архитектура и вращение 3D сфероида. Зеленые и красные лазеры были использованы для сканирования сфероидов, образуювшихся на 7-й день в клеточной кокультуре. Область сканирования была определена по 10-x цели. Сканирование начинается снизу вверх у сфероида на 1 мкм z-шаг. 3D сфероид вращения фильм был создан с использованием программного обеспечения Фиджи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

figure-results-12457
Видео 4: Архитектура и вращение 2D кластера опухолевых клеток, как визуализированы конфокальной микроскопии. Архитектура и вращение 2D-кластера. Конфокальные изображения клеточных кластеров были сделаны на 7-й день меланомы клеточной одноместной культуры. Область сканирования была определена по 10-x цели. Сканирование начинается снизу вверх у сфероида на 1 мкм z-шаг. 2D кластервращения фильм был создан с использованием программного обеспечения Фиджи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

figure-results-13208
Видео 5: Движение 3D сфероидов. 3D сфероиды были приостановлены в среде культуры и не придерживаться культуры блюдо / хорошо. Когда все еще средство в культуре клетки наилучшим образом было нарушено нежным pipetting, suspended 3D сфероиды двинули. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

figure-results-13752
Видео 6: Стойкость 2D опухолевых клеток. 2D кластер опухолевых клеток был закреплен на культурной плите и неподвижным, несмотря на нарушение культуры среды. Несколько мертвых клеток были мобильными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Обсуждение

In vitro 3D методы культуры клеток были широко использованы в течение десятилетий в исследованиях рака. По сравнению с обычными 2D-системами культуры клеток, 3D микросреда резюмирует клеточные и/или клеточные матрицы и позволяет имитировать подлинные условия, наблюдаемые в опухолевых тканях. Однако 3D-система, сформированная только раковыми клетками и гомотипическими клеточными взаимодействиями, не учитывает важность гетеротипического перекрестного разговора и может обеспечить неточные результаты в исследованиях. Недавно мы разработали новую 3D-систему, сочетающую раковые клетки и CAF, чтобы лучше имитировать неоднородную микросреду опухоли vivo и ее родную и жесткую десмопластическую реакцию.

Фибробласты являются основными компонентами опухолевой стромы. CAF участвуют в регулировании прогрессирования опухоли, вызывая растворимые факторы, ECM / ремоделирования ферментов10,11, и экзосомы. Кроме того, CAF играют определенную роль в лекарственной устойчивости и рецидиве опухоли16,17. Наша многоклеточная 3D сфероидная система может быть использована для изучения молекулярных механизмов опухолево-стромальных взаимодействий и для решения проблемы лекарственной устойчивости и рецидива опухоли. CAF в первую очередь происходит от активированных местных quiescent фибробластов и набраны циркулирующих КОСТного мозга MSC, которые проходят на месте дифференциации в CAF в опухолевой ткани37,38,39. В текущем исследовании мы использовали фибробласты кожи для создания многоклеточной 3D сфероидной модели. Тем не менее, другие типы фибробластов (например, MSC-DF), также работают очень похожи, как фибробласты кожи для регулирования образования опухолевых клеток 3D сфероидов34. MSC-DF может быть полученизована из murine костного мозга MSC, который обогащается путем культивирования моноядерных клеток костного мозга в среде культуры клеток MSC в течение примерно 10 дней с периодическими средними изменениями каждые 3 дня. Эти MSC характеризуются как CD73 /CD105/Лин-. Чтобы дифференцировать MSC в фибробласты, MSC впоследствии культивируются с полным DMEM в течение дополнительных 2 недель. MSC-DF характеризуются как «З-СМА»/Виментин /FSP-1, клетки36. MSC-DF может быть важным регуляторов опухоли. Потому что доля CAF во многих типах твердых опухолей дифференцированы от набранных циркулирующих MSC освобождены от костного мозга36, MSC-DF может быть перспективным цели лечения. Они также гораздо легче терапевтически манипулировать или целевых, прежде чем они завербованы в опухолевые ткани и дифференцированы в CAF. Таким образом, наша 3D-модель предлагает идеальную систему для изучения и тестирования не только раковых клеток, но и различных фракций или субпопуляций CAF. Метод 3D сфероидного образования прост. Критические шаги включают использование сыворотки свободной среды для сокультуры, применяя правильное соотношение фибробластов к опухолевым клеткам, и использование правильных пластин культуры для сокультуры. Потенциальным ограничением нашего метода является то, что образование 3D сфероидов в значительной степени зависит от линии раковых клеток. Наш протокол формирования сфероидов может потребовать оптимизации соотношения между фибробластами и раковыми клетками, если используются различные линии раковых клеток. Следует отметить, что мы использовали клетку меланомы человека и мышь фибробластной модели сокультуры клеток для формирования 3D сфероидов, потому что это гораздо проще создать GOF или LOF клеток в фибробласты мыши для изучения роли молекулы или сигнального пути в регулировании формирования опухоли сфероидов. Способность клеток меланомы человека и фибробластов мыши образовывать сфероиды указывает на то, что молекулы, необходимые для клеточной связи, работают кросс-видом. Недавно мы протестировали кокультуру фибробластов человека с клетками меланомы человека и обнаружили, что фибробласты человека могут также регулировать клетки меланомы человека, образуя 3D сфероиды.

Мы использовали клетки метастатической меланомы человека, C8161, в нашей многоклеточной 3D сфероидной модели. Мы также протестировали другие клетки меланомы человека, например, 1205Lu32, который несет мутации BRAFV600E, и MeWo, который выражает высокий уровень CDK4/Kit (ATCC HTB-65), и обнаружили, что они также способны формировать 3D сфероиды в кокультуре. Это указывает на то, что образование 3D сфероидов опухолевыми клетками не зависит от типов онкогенных мутаций. Хотя мы не проверяли ли другие типы немеланомы опухолевых клеток способны формирования 3D сфероидов с фибробластами, наши выводы показывают, что образование 3D сфероидов не ограничивается линией клеток меланомы и не может зависеть от конкретной линии раковых клеток.

Мы показали два примера практического применения нашей 3D сфероидной модели. Одним из примеров было выяснить внутриклеточной Нотч сигнализации пути деятельности в регулировании рака стволовых / иначины фенотипа клеток и 3D сфероид образования. Мы продемонстрировали, что внутриклеточные Нотч сигнальных путей в CAF является молекулярный переключатель контроля фенотипа рака стволовых / инициирующих клеток с помощью этой 3D сфероидной модели. Наши выводы не только раскрыть молекулярный механизм, лежащий в основе стромальной регуляции рака стволовых / инициирующих клеток и гетерогени на рак, но и подчеркнуть, что Нотч путь в CAF является критической мишенью для меланомы терапии. Этот пример указывает на то, что наша 3D-модель сфероидов очень полезна для изучения механизмов взаимодействия раковых клеток-стромальных фибробластов и выявления потенциальных терапевтических целей. Другим примером было проверить лекарственный ответ рака стволовых / инициирующих клеток в присутствии CAF. Хорошо известно, что реакция препарата раковых клеток, в том числе раковых стволовых / инициирующих клеток, варьируется в присутствии и отсутствии CAF. Присутствие CAF в этой системе in vitro делает эту модель более клинически релевантной и генерируетрезультат результатов испытаний более надежным. Кроме того, наша 3D сфероидная система является универсальной. Его можно использовать для различных целей. Например, если лекарственно устойчивые раковые клетки используются в этой 3D-модели, она может быть изменена для решения лекарственной устойчивости и, возможно, рецидива опухоли. Он также может быть изменен для тестирования или скрининга препаратов, которые в первую очередь нацелены на CAF для лечения рака. CAF в последнее время стали перспективными терапевтическими целями. Есть преимущества таргетинга на CAF. Во-первых, по сравнению с опухолевыми клетками, которые являются ненормальными (часто с генетическими изменениями) и умные (легко получить устойчивость к химио- и радиотерапии), CAF в опухолевой ткани являются нормальными клетками и генетически более стабильной, поэтому они менее склонны к развитию устойчивости к лечению. Во-вторых, таргетинг CAF не зависит от типа онкогенных мутаций в опухолевых клетках. В-третьих, таргетинг CAF может достичь нескольких эффектов попадания через фибробласты-зависимые противоопухолевые, анти-ангиогенез, и / или модулирующих иммунный ответ рака. Наша 3D-модель сфероидов является мощным инструментом для открытия различных наборов терапевтических стратегий рака.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим д-ра Омаиду К. Веласкеса (Университет Майами) за полезное сотрудничество, консультации и обсуждение; Д-р Цзе Ли (Университет Майами) за предоставление ячеек MeWo; и д-р Meenhard Херлин (Институт Вистар) для обеспечения всех других клеток меланомы. Мы также благодарим д-ра Марсию Булину (Marcia Boulina), директора аналитического центра Imaging Core, Университет Майами, за анализ изображений. Чжао-Цзюнь Лю была поддержана грантами от Программы исследований рака Бэнкхед-Коли (Award 09BN-11), Ассоциации по борьбе с раком женщин(53-й ежегодный грант) и внутренних фондов Из Университета Майами.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTACorning25-253-CI
24-well plateCorning351147Non-tissue culture treated plate, 24-well, flat bottom with low evaporation lid
Alex Fluor 488 goat anti-mouse IgGLife TechnologyA21202
CaCl2 1.5 MSigma-AldrichC5670-500G
Collagenase, Type 1ASigma-AldrichC-2674500 mg, 1 mg/mL concentration in DMEM.
DakoCytomationDakox0909
DAPI
Dispase Grade IIRoche Diagnostics165859
Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)Corning10-013-CV
Fetal Bovine SerumVMR97068-085Premium Grade
Fiji (ImageJ)NIHFree for downloading, no license needed.
IncuCyte Zoom 2016AEssen Bioscience
IncuCyte Zoom SystemEssen Bioscience
InsulinSigma-AldrichI1882
L-15 Medium (Leibovitz)Sigma-AldrichL1518
Leica SP5 Inverted Confocal MicroscopeLeica
MCDB 153 MediumSigma-AldrichM7403-10X1L
Mouse anti α-SMA (smooth muscle actin), monocloneAbcamab18640
Olympus IX51 Inverted Fluorescence MicroscopeOlympusIX51
Olymupus CellSensOlympus
PD0325901Selleckchem ChemicalsS1036
Penicillin Streptomycin SolutionCorning30-002- CI100 X
Sodium Bicarbonate 7.5%Corning25-035-CI

Ссылки

  1. Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1091-1103 (2008).
  2. Anton, K., Glod, J. Targeting the tumor stroma in cancer therapy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 10, 185-191 (2009).
  3. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  4. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  5. Allinen, M., et al. Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer. Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).
  6. Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
  7. Lynch, C. C., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication. Differentiation. 70, 561-573 (2002).
  8. Midwood, K. S., Williams, L. V., Schwarzbauer, J. E. Tissue repair and the dynamics of the extracellular matrix. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 36, 1031-1037 (2004).
  9. Olumi, A. F., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Research. 59, 5002-5011 (1999).
  10. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5, 1597-1601 (2006).
  11. Luga, V., et al. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration. Cell. 151, 1542-1556 (2012).
  12. Zhang, X. H., et al. Selection of bone metastasis seeds by mesenchymal signals in the primary tumor stroma. Cell. 154, 1060-1073 (2013).
  13. Orimo, A., et al. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
  14. Shao, H., et al. Activation of Notch1 signaling in stromal fibroblasts inhibits melanoma growth by upregulating WISP-1. Oncogene. 30, 4316(2011).
  15. Ziani, L., Chouaib, S., Thiery, J. Alteration of the Antitumor Immune Response by Cancer-Associated Fibroblasts. Frontier in Immunology. 9, 414(2018).
  16. Kraman, M., et al. Suppression of antitumor immunity by stromal cells expressing fibroblast activation protein-alpha. Science. 330, 827-830 (2010).
  17. Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
  18. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 3 (1), 1-10 (2007).
  19. Santiago-Walker, A., Li, L., Haass, N. K., Herlyn, M. Melanocytes: from morphology to application. Skin Pharmacology and Physiology. 22, 114-121 (2009).
  20. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling melanoma in vitro and in vivo. Healthcare (basel). 2, 27-46 (2013).
  21. Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and flow cytometry-based analysis of cell position and the cell cycle in 3D melanoma spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486(2015).
  22. Weiswald, L. B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17, 1-15 (2015).
  23. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14, (2017).
  24. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, 108-115 (2013).
  25. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced Drug Delivery Review. 69-70, 29-41 (2014).
  26. Bulin, A. L., Broekgaarden, M., Hasan, T. Comprehensive high-throughput image analysis for therapeutic efficacy of architecturally complex heterotypic organoids. Scientific Reports. 7, 16645(2017).
  27. Lazzari, G., et al. Multicellular spheroid based on a triple coculture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity. Acta Biomaterialia. 78, 296-307 (2018).
  28. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  29. Gu, L., Mooney, D. J. Biomaterials and emerging anticancer therapeutics: engineering the microenvironment. Nature Reviews Cancer. 16, 56-66 (2016).
  30. Tevis, K. M., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Embedded Spheroids as Models of the Cancer Microenvironment. Advanced Biosystems. 1, (2017).
  31. Welch, D. R., et al. Characterization of a highly invasive and spontaneously metastatic human malignant melanoma cell line. International Journal of Cancer. 47, 227-237 (1991).
  32. Balint, K., et al. Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression. Journal of Clinical Investigation. 115, 3166-3176 (2005).
  33. Meier, F., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. the American Journal of Pathology. 156, 193-200 (2000).
  34. Du, Y., et al. Intracellular Notch1 Signaling in Cancer-Associated Fibroblasts Dictates the Plasticity and Stemness of Melanoma Stem/Initiating Cells. Stem Cells. 37, 865-875 (2019).
  35. Shao, H., et al. Notch1 Pathway Activity Determines the Regulatory Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Melanoma Growth and Invasion. PLoS One. 10, 0142815(2015).
  36. Shao, H., et al. Notch1-WISP-1 axis determines the regulatory role of mesenchymal stem cell-derived stromal fibroblasts in melanoma metastasis. Oncotarget. 7, 79262-79273 (2016).
  37. Kalluri, R., Neilson, E. G. Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 112, 1776-1784 (2003).
  38. Price, J. E. Xenograft models in immunodeficient animals : I. Nude mice: spontaneous and experimental metastasis models. Methods in Molecular Medicine. 58, 205-213 (2001).
  39. Spaeth, E. L., et al. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS One. 4, 4992(2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1563D3DMICCAFTME

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены