Visualisation des effets des dommages oxydatifs sur les chambres d'oeufs Drosophila à l'aide de l'imagerie en direct

Résumé

L'objectif de ce protocole est d'utiliser l'imagerie vivante pour visualiser les effets des dommages oxydatifs sur la localisation et la dynamique des structures subcellulaires dans les ovaires de Drosophila.

Résumé

L'imagerie vivante des ovaires de Drosophila melanogaster a joué un rôle déterminant dans la compréhension d'une variété de processus cellulaires de base pendant le développement, y compris le mouvement des particules ribonucléoprotéines, la localisation de l'ARNm, le mouvement des organelles et la dynamique cytosquelettique. Plusieurs méthodes d'imagerie en direct ont été mises au point. En raison du fait que chaque méthode consiste à disséquer les ovarioles individuels placés dans les médias ou l'huile d'halocarbone, des dommages cellulaires dus à l'hypoxie et/ou à la manipulation physique se produiront inévitablement au fil du temps. Un effet en aval de l'hypoxie est d'augmenter les dommages oxydatifs dans les cellules. Le but de ce protocole est d'utiliser l'imagerie en direct pour visualiser les effets des dommages oxydatifs sur la localisation et la dynamique des structures subcellulaires dans les ovaires de Drosophila après l'induction des dommages cellulaires contrôlés. Ici, nous utilisons du peroxyde d'hydrogène pour induire des dommages oxydatifs cellulaires et donner des exemples des effets de tels dommages sur deux structures subcellulaires, les mitochondries et les particules de bonheur Clu. Toutefois, cette méthode s'applique à toute structure subcellulaire. Les limites sont que le peroxyde d'hydrogène ne peut être ajouté à des médias aqueux et ne fonctionnerait pas pour l'imagerie qui utilise de l'huile d'halocarbone. Les avantages sont que le peroxyde d'hydrogène est facilement disponible et peu coûteux, agit rapidement, ses concentrations peuvent être modulées, et les dommages oxydatifs est une bonne approximation des dommages causés par l'hypoxie ainsi que les dommages généraux des tissus dus à la manipulation.

Introduction

Plusieurs facteurs de stress cellulaires différents peuvent survenir au cours de la culture expérimentale et de la manipulation des tissus ex vivo, y compris le choc thermique, le stress oxydatif, le stress osmotique, le stress nutritionnel et les conditions de toxicité. L'imagerie en direct est un outil puissant utilisé pour visualiser les changements en temps réel dans les tissus ex vivo après un traitement expérimental et une manipulation. Les dissections et la manipulation des tissus fins prennent de la pratique, et le temps entre la dissection et l'imagerie peut varier selon l'expérience. La raison d'être du développement de cette méthode est basée sur la préoccupation que la préparation des tissus à l'imagerie vivante peut causer un stress cellulaire pendant la dissection et la préparation à l'imagerie. Cela pourrait être particulièrement problématique pour les processus sensibles aux changements du métabolisme cellulaire et les niveaux d'oxygène disponibles, tels que la fonction mitochondrique. Bien qu'avoir un échantillon parallèle de type sauvage soit un contrôle important, il est toujours possible que certains ou tous les changements observés dans les structures subcellulaires puissent être dus à des dommages ou à un stress cellulaire dû à la dissection et ne reflètent pas la physiologie normale ou le traitement ou la mutation à l'étude.

Pour résoudre ce problème potentiel, nous utilisons l'ajout de peroxyde d'hydrogène pendant l'imagerie en direct afin d'induire des dommages oxydatifs^{cellulaires 1}. Le but de cette méthode est d'induire des dommages aux tissus afin de surveiller l'effet sur les structures subcellulaires. Ce protocole est utile à deux fins : 1) déterminer si les changements dans la localisation subcellulaire de la structure d'intérêt sont dus au stress causé par la dissection inexpérimentée et 2) une fois que le chercheur est confiant avec les techniques de dissection décrites pour surveiller l'effet du stress contrôlé sur la structure d'intérêt. Ici, nous montrons deux exemples de la façon dont l'augmentation des dommages oxydatifs provoque des changements dans deux structures subcellulaires, mitochondries et particules de bonheur Clu. Pour ce faire, nous utilisons l'ovaire Drosophila qui est un modèle commun pour les études d'imagerie en direct. Le premier exemple examine la localisation mitochondrique. D'après notre expérience, la localisation mitochondrique normale dans les cellules germinales femelles est très sensible aux perturbations et peut agir comme un signe avant-coureur du stress cellulaire. Les mitochondries dans les cellules germinales femelles de Drosophila sont normalement dispersées uniformément dans tout le cytoplasme^2. L'ajout de peroxyde d'hydrogène amène les organites à se délocaliser rapidement et à se regrouper de la même manière que diverses mutations^3,4,5. Le deuxième exemple sont les particules de bonheur formées par Clueless (Clu). Clu est une ribonucléoprotéine qui est diffuse dans tout le cytoplasme; cependant, il forme également des particules mitochondries-associées dans des conditions cellulaires optimales^5. Puisque la présence des particules de Clu dépend des conditions cellulaires saines, nous les avons appelées particules de « bonheur^{» 3,5,6}. L'ajout de peroxyde d'hydrogène provoque la dispersion rapide de ces particules et leur homogénéité dans le^{cytoplasme 5.} Au cours de nos études, nous avons observé des changements dans la localisation de ces deux structures subcellulaires, mais ce n'est qu'après avoir effectué des études d'imagerie en direct que nous avons pu apprécier pleinement l'effet du stress cellulaire et des dommages oxydatifs sur la localisation et la dynamique des mitochondries et des particules de bonheur.

L'utilité de ce protocole en tant qu'ajout à des méthodes déjà établies ou alternatives dépend de plusieurs facteurs. Tout d'abord, le protocole d'imagerie doit être utile à l'ajout de médicaments. Si l'échantillon est monté sous un coverslip et dans l'huile d'halocarbone, cette méthode ne serait pas possible⁷. H₂O₂ addition provoque une augmentation rapide des dommages oxydatifs, par conséquent, cette échelle de temps peut ne pas être approprié. Les dommages oxydatifs peuvent être considérés comme un proxy pour l'hypoxie ; cependant, il peut être trop dur ou trop généralisé pour fonctionner comme un contrôle approprié pour les dommages pour certains composants subcellulaires. Enfin, pour les expériences d'imagerie qui durent des heures comme celles qui suivent un processus de développement, h₂O₂ addition peut être trop forte (par exemple⁸). L'essai d'une courbe de concentration peut surmonter cette limitation.

Protocole

1. Préparation de la dissection et des supports d'imagerie

REMARQUE : Les supports les mieux adaptés à cette expérience d'imagerie en direct contiennent les supports Drosophila de Schneider contenant 15 % de sérum bovin fœtal inactivé par chaleur, 0,6 x Pen-Strep et 200 μg/mL d'insuline bovine, appelée ci-après les médias de Complete Schneider.

1. Effectuer la préparation des médias dans des conditions stériles pour s'assurer qu'il ne soit pas contaminé. Les médias ont été développés pour soutenir Drosophila ovarioles pendant de longues périodes de temps⁹.
2. Ajouter 15 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 0,6 x Pen-Strep et 200 μg/mL d'insuline bovine aux médias du Schneider.
3. Bien mélanger le contenu et le conserver à 4 °C toute la nuit.
   REMARQUE : L'insuline ne se dissout pas complètement dans les médias de Complete Schneider, et vous remarquerez qu'un précipité s'installe au fond du tube.
4. Faites des aliquots des médias, en étant sûr de quitter le précipité car il interférera avec l'imagerie.
   REMARQUE : Cette solution peut être utilisée dans un délai d'un mois si elle est stockée dans des aliquots à 4 °C.

2. Collection de Drosophile pour la dissection

REMARQUE : Des procédures détaillées de collecte et de dissection de Drosophila peuvent également être trouvées dans Weil et coll.¹⁰ et Parker et coll.¹¹.

1. Pour une imagerie optimale des cellules germinales féminines, préparez d'abord un flacon contenant des aliments standard pour la mouche de la semoule de maïs et une touche de pâte de levure humide qui est la consistance du beurre d'arachide. Cela garantit que les mouches femelles sont bien nourries et produiront tous les stades de développement des follicules pour l'imagerie.
2. Pour les mouches en parfaite santé, recueillir les femelles de 0-1 jour et transférer avec les mâles dans un flacon de nourriture mouche contenant de la pâte de levure humide.
   REMARQUE : Assurez-vous que les mouches endormies ne contactent pas la pâte de levure car elles peuvent s'y tenir.
3. Nourrir les mouches 3-7 jours, en changeant le flacon et la pâte de levure tous les jours.
   REMARQUE : Assurez-vous que la pâte de levure entre en contact avec les aliments à la mouche afin qu'ils ne se dessèchent pas.

3. Dissection de l'ovaire Drosophila

REMARQUE : Il est important de préparer les solutions multimédias fraîches parce que le peroxyde d'hydrogène est sensible à l'oxydation et que tmre se dégrade avec le temps.

1. Juste avant la dissection, dans les médias de Complete Schneider, préparez un aliquot frais de 2 μM H₂O₂ solution, un aliquot frais de 46 nM tétramethylrhodamine, ester éthylique (TMRE), et un aliquot frais d'une solution TMRE de 46 nM contenant 2 μM H₂O_2.
2. Pour la dissection des ovaires, utilisez deux paires de forceps fins et une paire d'aiguilles de tungstène électrolytiquement aiguisées¹². Pour disséquer les ovaires, remplissez 2-3 puits d'un plat de dissecting de fond de verre (verre de montre) avec le Schneider complet qui a été réchauffé à la température ambiante.
3. Anesthésier le flacon de mouches engraissées avec du dioxyde de carbone et séparer le nombre désiré de mouches femelles à disséquer. Placez une seule mouche dans les médias à l'aide de forceps.
4. Sous un microscope disséquant, saisissez doucement la mouche par le thorax à l'aide d'une paire de forceps fins. Avec l'autre paire de forceps, saisir le postérieur, et tirer doucement pour enlever les ovaires.
   REMARQUE: si les ovaires ne sortent pas en douceur en utilisant cette méthode, l'abdomen entier peut également être retiré de la mouche, et les ovaires peuvent être doucement pressés de chaque extrémité de l'abdomen à l'aide de forceps.
5. Enlevez toute cuticule ou tissu extraneous, puis transférez les ovaires à un nouveau puits contenant des médias frais. Les ovaires devraient encore se déplacer de la gaine musculaire environnante.

4. Préparation des ovarioles à l'imagerie

1. À l'aide d'aiguilles de tungstène aiguisées, taquiner délicatement les ovarioles, en prenant soin d'enlever la gaine musculaire environnante (figure 1).
2. Taquinez doucement toute gaine musculaire et fibres nerveuses attachées aux ovarioles isolés (Figure 2).
   REMARQUE : Si la gaine musculaire n'est pas enlevée, l'ovariole se contracte et se déplace, causant des problèmes d'acquisition d'image (Vidéo 1).
3. Si les structures subcellulaires d'intérêt sont étiquetées de façon endogène, passez à l'étape 4.4. Si les structures d'intérêt sont étiquetées avec un colorant fluorescent, passez à l'article 5.
4. Une fois que les ovarioles ont été disséqués proprement, à l'aide d'une micropipette, transférez-les dans une goutte de 100 μL du média d'imagerie complete Schneider dans la dépression de verre d'un plat de fond en verre. Les ovarioles individuels descendront au fond de la gouttelette.
5. Passez à la section 6 pour l'imagerie.
   REMARQUE : Pour l'imagerie des mitochondries et des particules de bonheur Clu, pas plus de cinq à dix minutes devraient s'écouler du début de la dissection à l'imagerie.

5. Coloration des mitochondries avec TMRE

REMARQUE : D'autres procédures détaillées sur la coloration vivante des mitochondries avec des colorants fluorescents peuvent être trouvées dans Parker et coll. 2017.

1. Après l'étape 4.3, transférez les ovarioles isolés dans une baisse de 100 μL de 46 nM TMRE médias dans la dépression de verre d'un plat de fond en verre. Les ovarioles individuels descendront au fond de la gouttelette.
2. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Placez le couvercle sur le plat à fond de verre et placez le plat dans une boîte couverte pendant toute la durée de l'expérience pour vous protéger de la lumière.
   REMARQUE : Après l'incubation, les échantillons peuvent être photographiés directement sans lavage.
3. Répétez les étapes 5.1-5.2 pour préparer au moins deux plats d'ovarioles étiquetés TMRE, l'un pour servir de groupe expérimental et l'autre pour servir de contrôle.

6. Acquisition d'images en direct

1. Une fois que les ovarioles sont montés, placez l'une des plats de fond en verre sur le microscope et configurez les paramètres d'imagerie au besoin. Les longueurs d'onde optimales excitation/émission pour le TMRE utilisé ici sont 549 nm/574 nm.
2. Après avoir localé le champ de vision désiré, acquérir des images fixes ou de brèves vidéos d'un ou plusieurs ovarioles comme souhaité comme un enregistrement des conditions de pré-traitement.

7. Ajout de peroxyde d'hydrogène pendant l'imagerie

1. Mettez en pause l'imagerie en direct, retirez le couvercle du plat inférieur en verre et ajoutez soigneusement 100 μL de solution H 2 O_{2 μMau} plat à l'aide d'une micropipette si l'imagerie est étiquetée de façon endogène. Si l'imagerie mitochondrie, ajouter soigneusement 100 μL de 46 nM TMRE avec 2 μM H₂O₂ solution au plat à l'aide d'une micropipette (Vidéo 2).
   1. Évitez de casser la surface de la gouttelette multimédia existante ou d'ajouter la solution trop rapidement afin de ne pas déplacer les ovarioles reposant sur le fond du plat (Vidéo 2).
2. Remplacer le couvercle du plat (couvercle de plat), déplacer et recentrer le champ de vision désiré si nécessaire, et reprendre l'imagerie (Vidéo 3, Vidéo 4, Figure 3, Figure 4).
   1. Prenez soin de reprendre l'imagerie le plus rapidement possible après_{l'ajout de}H 2 O₂ car le traitement expérimental est sensible au temps (Vidéo 5).
3. Obtenez des images fixes ou de brèves vidéos d'un ou plusieurs ovarioles comme vous le souhaitez. Cela servira d'enregistrement des conditions post-traitement.
4. Pour le contrôle, placez le deuxième plat de fond en verre sur le microscope et répétez la section 6.
5. Répétez l'étape 7.1, cette fois en ajoutant 100 μL de médias TMRE uniquement au plat. Si l'imagerie est étiquetée de façon endogène, ajoutez 100 μL de la solution multimédia de Complete Schneider.
6. Répétez les étapes 7.2 et 7.3 pour acquérir des données pour le groupe témoin.
   REMARQUE : Pour les mitochondries d'imagerie et les particules de bonheur Clu, pas plus de trois-cinq minutes devraient s'écouler de l'ajout de peroxyde d'hydrogène à l'imagerie.

Résultats

Les protocoles décrits peuvent être utilisés pour étudier les effets du peroxyde d'hydrogène lors de l'imagerie en direct des ovaires de Drosophila. Comme le montre la figure 3, la figure 4, la vidéo 3 et la vidéo 4, cette procédure fournit un moyen efficace de visualiser les changements et la dynamique des tissus après un traitement expérimental en temps réel. Fait important, ce protocole est spécifique pour l'ajout de H₂O_{2 aux} ovarioles lors de l'imagerie; cependant, il peut être adapté pour l'ajout exogène d'autres drogues ou reagents d'intérêt. De plus, les follicules peuvent être étiquetés avec des colorants fluorescents d'intérêt (p. ex., tétramethylrhodamine (TMRE), LysoTracker) avant l'imagerie (Vidéo 3). Les étapes les plus critiques pour obtenir des résultats d'imagerie clairs sont 1) la dissection et l'isolement appropriés des ovarioles simples avec tous les éléments contractiles enlevés(figure 1 et figure 2) et 2) la vitesse à laquelle l'imagerie est redémarrée après l'ajout de peroxyde d'hydrogène. La vidéo 4 est une illustration d'un follicule correctement disséqué qui reste stable tout au long de la durée de l'imagerie par rapport à la vidéo 1, qui illustre un follicule mal disséqué sortant du champ de vision pendant l'imagerie. La vidéo 5 est une illustration dans laquelle les effets H₂O₂ sur les mitochondries étiquetées TMRE ont déjà progressé avant le début de l'imagerie en raison de trop de temps écoulé. Par rapport à la vidéo 3 dans laquelle l'imagerie a été redémarrée immédiatement après l'ajout de peroxyde d'hydrogène (temps 0) et intacte, les mitochondries dispersées sont encore visibles, les mitochondries de la vidéo 5 ont déjà commencé à s'agglutiner visiblement et à perdre leur potentiel membranaire lors du redémarrage de l'imagerie. Ce problème est principalement attribué à la perturbation des positions de l'échantillon pendant_{l'ajout de}H 2 O₂ et peut être atténué en suivant la technique pour garder le média d'imagerie et la position de l'échantillon intacts (Vidéo 2). Il convient de noter que dans les expériences de contrôle réalisées sans H₂O₂ ajouté aux médias, les mitochondries dans les follicules restent correctement dispersées, et le colorant TMRE reste séquestré dans les mitochondries.

Figure 1: Isolement des ovarioles simples des ovaires de Drosophila. (A) Dessin animé indiquant une paire d'ovaires, un ovariole unique (flèche) avec le germarium à la pointe (pointe de flèche) et les deux gaines musculaires qui entourent l'ovariole (brun, épithélial) et l'ovaire (brun, péritonéal). (B) Ovaire disséqué Drosophila. (C) Séparation subséquente de l'ovaire taquiné en ovarioles individuels (flèche). Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Ablation des fibres nerveuses et des éléments contractiles des ovarioles simples. (A) Ovariole simple avec des restes de tissu nerveux et de la gaine musculaire encore attachée (flèche). (B) Enlèvement doux de tous les tissus restants attachés à l'ovariole en A (flèche). Barre d'échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: H₂O₂ provoque une mauvaise localisation mitochondriale. (A-A") Images vivantes d'un follicule clu^CA06604 (Clu:::GFP flies). L'ajout de H₂O_{2 provoque} l'agglutinage des mitochondries pendant toute la durée de l'imagerie. L'étiquetage TMRE des mitochondries indique que les mitochondries sont d'abord dispersées au moment 0 (A), et que les mitochondries commencent à s'agglutiner après h₂O₂ addition (A′) À un moment ultérieur, l'étiquetage TMRE devient inégale en raison de mitochondries perdre leur potentiel membrannaire et donc leur capacité à séquestrer le colorant (A). Blanc = TMRE (A-A"). Barres d'échelle: 10 μm in (A) pour A-A"⁵. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: H₂O₂ disperse Clu. (A-A") Images vivantes d'un follicule clu^CA06604 bien nourri. L'ajout de H₂O₂ provoque la dispersion des particules et l'homogénéité du cytoplasme pendant toute la durée de l'imagerie. Blanc = Clu::GFP (A-A"). Barre d'échelle: 40 μm in (A) pour A-A"⁵. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Vidéo 1: Follicule d'une femelle clu^CA06604. Tel que décrit dans la figure 2,l'omission d'enlever les éléments contractiles de fibre nerveuse des ovarioles simples causera la dérive et le mouvement marqués des ovarioles pendant l'imagerie et l'incapacité suivante d'analyser des données d'imagerie. Blanc = Clu::GFP. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Ajout approprié de H2O_{2à l'échantillon} de plat. Le peroxyde d'hydrogène doit être ajouté à la vaisselle de l'échantillon à l'aide d'une micropipette de taille appropriée. Distribution H₂O_{2 sans casser} la surface du média. On prend soin d'éviter de briser la surface du média d'imagerie afin de minimiser la dérive de l'échantillon lors de l'ajout de peroxyde d'hydrogène. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Ajout de H₂O₂ pendant l'imagerie des follicules étiquetés TMRE. Follicule d'un clu^CA06604 femelle souillée avec TMRE. H₂O_{2 provoque} une mauvaise localisation mitochondrique dans les follicules de Drosophila. Blanc = colorant TMRE. Imaged un cadre par 15 s pendant 20 min, et la vidéo est de 10 images par seconde⁵. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 4: H₂O₂ addition pendant l'imagerie de Clu::GFP follicules. Follicule d'une femelle clu^CA06604. H₂O₂ disperse les particules de Clu telles que décrites dans la figure 4. Blanc = Clu::GFP. Imaged un cadre par 15 s pendant 15 min, et la vidéo est de 10 images par seconde. ⁵S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo. 

Vidéo 5 : Imagerie retardée après l'ajout_{de H 2}O_2. Follicule d'une femelle clu^CA06604. L'ajout de peroxyde d'hydrogène aux follicules est un traitement sensible au temps. Le redémarrage de l'imagerie a été retardé dans cette vidéo en raison du déplacement de l'échantillon pendant_{l'ajout de H 2}O_2. Les mitochondries ont déjà commencé à s'agglutiner visiblement et à perdre leur potentiel membrannaire lors du redémarrage de l'imagerie au moment 0 (par rapport au temps 0 dans la vidéo 3). Le fait de ne pas reprendre l'imagerie rapidement après le traitement entraînera des résultats inexacts et inutilisables, car les premiers effets expérimentaux seront manqués avant l'imagerie. Blanc = TMRE. Imaged un cadre par 15 s pendant 20 min, et la vidéo est de 10 images par seconde. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Ce protocole pourrait être un ajout utile comme un contrôle pour les artefacts en raison de la dissection des ovaires et l'incubation des tissus pour toute expérience d'imagerie en direct. Les étapes critiques sont similaires à celles trouvées pour d'autres protocoles d'imagerie en direct. Apprendre à disséquer des ovaires entiers de Drosophila prend la pratique; cependant, cette compétence peut généralement être apprise assez rapidement avec les outils de dissection appropriés. Plus difficile à maîtriser est d'enlever le muscle enveloppant les ovaires et chaque ovariole¹³. Cela doit être fait pour s'assurer que les contractions musculaires n'interfèrent pas avec l'acquisition d'images. Si l'utilisation d'aiguilles de tungstène aiguisées pour ce faire ne s'avère pas réussie, le germarium à la pointe de l'ovariole peut être saisi avec des forceps et l'ovariole tiré de la gaine musculaire. Toutefois, cette technique est problématique si l'on veut examiner les premiers stades de développement parce qu'ils peuvent être endommagés. Une autre étape clé est de ne pas déloger les ovarioles reposant sur le fond du plat lors de l'ajout de H₂O₂. Un autre aspect important est partagé par toutes les images en direct : le chercheur doit s'assurer que la structure d'intérêt est bien étiquetée avant le traitement. Les plats utilisés ici (Tableau des matériaux) sont couramment utilisés pour l'imagerie en direct; cependant, n'importe quel plat ou glissière avec un coverslip en verre sur le fond ou même un grand coverslip en verre devrait fonctionner aussi longtemps que la baisse des médias peut être couverte pour empêcher l'évaporation des médias. Alors que nous utilisons un microscope particulier, tout microscope inversé avec un objectif de grossissement suffisant pour voir la structure subcellulaire en question et une caméra attachée qui a une résolution suffisante et le taux de capture d'image devrait fonctionner.

Tandis que notre laboratoire s'intéresse principalement à la fonction mitochondrique, cette méthode pourrait être utile examinant la dynamique et la localisation de n'importe quelle structure subcellulaire ou organelle, telle que le noyau, le cytosquelette ou le réticulum endoplasmique. Toutefois, cette méthode a des limites. Afin d'ajouter du peroxyde d'hydrogène, le tissu doit être dans un média aqueux. Une autre méthode pour l'imagerie vivante est d'utiliser l'huile d'halocarbone, qui a joué un rôle déterminant dans la description de nombreux processus importants dans les ovarioles Drosophila, y compris le premier exemple de mouvement dynamique de GFP dans un organisme^{modèle 7,14}. En outre, l'ajout de peroxyde d'hydrogène au média provoque des dommages oxydatifs à grande échelle qui peuvent être une insulte trop générale au tissu pour être instructif pour le processus cellulaire d'intérêt, en particulier pour les expériences plus longues examinant le développement. Bien qu'il puisse ne pas être possible d'effectuer des expériences qui nécessitent la visualisation de la cellule sur de longues périodes de temps en raison de ces dommages oxydatifs rapides, étendus et probablement irréversibles, nous avons vu que le traitement aigu au peroxyde d'hydrogène que nous avons décrit est applicable à la plupart des stades de l'oogenèse que nous sommes en mesure de voir les mêmes effets dans la plupart des étapes dans la période de temps d'imagerie. Compte tenu du faible coût et de la facilité du protocole, il peut être un contrôle utile pour les dommages et peut être utilisé comme un traitement avant la fixation et l'étiquetage des anticorps ainsi.

Dans nos mains, le traitement H₂O₂ imite les changements dans la mauvaise localisation mitochondriale et la dispersion des particules Clu bliss que nous voyons chez divers mutants drosophiles. Il imite également les résultats que nous voyons pour les nouveaux chercheurs dans les techniques de dissection d'apprentissage en laboratoire. Par conséquent, cette méthode a clairement indiqué que la préparation d'échantillon et le stress cellulaire général peuvent mener aux changements inattendus et précédemment inexpliqués à la mauvaise localisation mitochondrique et à la présence des particules de bonheur. En avançons dans cette technique, les concentrations de peroxyde d'hydrogène pourraient être modulées à l'aide d'une concentration plus ou moins élevée. Si un effet cellulaire est observé à l'aide d'une concentration plus faible, il est possible que le phénotype de stress puisse être réversible en remplaçant le média par celui de Complete Schneider. Différents facteurs de stress cellulaire tels que le carbonyl cyanure m-chlorophényle hydrazone (CCCP), arsenite ou simple choc thermique pourraient s'avérer utiles pour le stress cellulaire général pour d'autres structures subcellulaires. Puisque l'imagerie vivante des tissus ex vivo exige la manipulation manuelle et l'incubation dans différents médias, ce contrôle devrait être un ajout utile pour s'assurer que toutes les observations sont aussi proches de la physiologie normale que possible.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active dry yeast	Red Star®
CO2 gas			99.9% purity
CO2 pad
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model	Nikon
Dissecting needles - PrecisionGlide needles	BD	305165	B-D 21G1 size
Dissecting needles - PrecisionGlide syringes	BD	309657	Luer-Lok tip, 3 mL size
Dissecting needles - tungsten wire	Electron Microscopy Sciences	73800
Dumont #5 forceps (2 pairs)	Fine Science Tools	11251-10
NI-150 High Intensity Illuminator	Nikon Instruments Inc.
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Fisher Scientific	10082-147
Gibco Schneider's Drosophila Media	Sigma-Aldrich	21720-024
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O	Sigma-Aldrich	H1009
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I6634
Spinning disk microscope	Nikon		Equivalent scopes may also be used
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures	Fisher Scientific	17-602E
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm	Fisher Scientific	NC9344527
Micropipettes and tips of appropiate size	Eppendorf
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL	VWR	87003-294
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)	AnaSpec	AS-88061
w[1118]	Bloomington Drosophila Stock Center	5905	Wild-type flies
y w; clu[CA06604]		Available upon request.	Clu::GFP trap flies