Sectionnement optique et visualisation du disque intervertébral du développement embryonnaire à la dégénérescence

Résumé

Nous présentons une méthode pour étudier l’organisation spatiale des chondrocytes dans l’anulus fibrose du disque intervertébral en utilisant une méthode de sectionnement optique.

Résumé

La dégénérescence du disque intervertébral (DIV) est l’une des principales causes de lombalgie et entraîne un degré élevé de déficience pour les personnes touchées. Pour décoder la dégénérescence discale et pouvoir développer des approches régénératives, une compréhension approfondie de la biologie cellulaire de l’IVD est essentielle. Un aspect de cette biologie qui reste encore sans réponse est la question de savoir comment les cellules sont disposées spatialement dans un état physiologique et pendant la dégénérescence. Les propriétés biologiques du DIV et sa disponibilité rendent ce tissu difficile à analyser. La présente étude étudie l’organisation spatiale des chondrocytes dans l’anulus fibreux depuis le début du développement embryonnaire jusqu’à la dégénérescence terminale. Une méthode de sectionnement optique (Apotome) est appliquée pour effectuer des analyses de coloration à haute résolution en utilisant du tissu embryonnaire bovin comme modèle animal et du tissu discale humain obtenu à partir de patients subissant une chirurgie de la colonne vertébrale. À partir d’une densité de chondrocytes très élevée dans le disque bovin embryonnaire précoce, le nombre de cellules diminue pendant la gestation, la croissance et la maturation. Dans les disques humains, une augmentation de la densité cellulaire a accompagné la progression de la dégénérescence tissulaire. Comme cela avait déjà été démontré dans le cartilage articulaire, la formation de grappes représente une caractéristique de la dégénérescence discale avancée.

Introduction

Le disque intervertébral (DIV) est une structure à base de cartilage qui, biochimiquement et par rapport à l’architecture cellulaire, à première vue, ressemble à bien des égards au cartilage articulaire^1. En effet, la dégénérescence DIV et l’arthrose (OA) du cartilage articulaire sont caractérisées par un rétrécissement de l’espace articulaire dû à l’usure du cartilage, à la formation de kystes sous-chondriques et d’ostéophytes, et à la sclérose sous-chondrale^2,3. Malgré ces similitudes apparentes, l’architecture et le rôle fonctionnel des deux tissus diffèrent. Alors que la matrice du cartilage articulaire est principalement formée d’un réseau de collagène de type II formant des arcades, le DIV se compose de trois types de tissus différents: le noyau pulpeux riche en collagène de type II au centre prend des charges axiales et les transmet à un anneau englobant de fibres de collagène circulaires de type I densément emballées appelées anulus fibrosus. Leur fonction est d’absorber les pressions axiales traduites reçues par le noyau riche en protéoglycanes et en eau avec leur résistance à la fibre longitudinale à la traction. En haut et en bas de chaque noyau et anulus, une plaque d’extrémité cartilagineuse hyaline forme la jonction avec les vertèbres^{adjacentes 4} (Figure 1).

Dans le cartilage articulaire, quatre modèles de chondrocytes spatiaux distincts peuvent être trouvés: paires, cordes, cordes doubles, petits ou grands amas^5,6,7 ( Figure2). Les changements dans ce schéma sont associés à l’apparition et à la progression de^{l’arthrose 8,9}. L’organisation spatiale des chondrocytes est également révélatrice d’une propriété fonctionnelle directe du cartilage, à savoir sa rigidité, soulignant la pertinence fonctionnelle de cette approche de classement basée sur l’image^10,11. Ces modèles peuvent en outre être identifiés avec la technologie cliniquement disponible déjà existante¹². En raison des similitudes entre le DIV et le cartilage articulaire, on peut émettre l’hypothèse que des modèles chondrocytes caractéristiques sont également présents dans le DIV. La formation d’amas est un phénomène également observé dans l’IVD^{dégénérée 13,14.}

Lorsque vous essayez d’analyser l’organisation cellulaire spatiale dans le DIV, il est nécessaire de surmonter plusieurs difficultés techniques qui ne sont pas présentes lors de l’étude du cartilage articulaire:

Tout d’abord, le traitement du tissu lui-même est beaucoup plus difficile qu’avec le cartilage hyalin homogène qui est en grande partie composé de collagène de type II. Le principal composant fibreux de l’IVD est le collagène de type I, ce qui rend beaucoup plus difficile la génération de fines sections histologiques. Alors que dans le cartilage articulaire hyalin, même les sections épaisses peuvent facilement être analysées en raison de la nature « vitreuse » du tissu, le réseau de collagène de type I du DIV est optiquement très impénétrable. Pour cette raison, un fort bruit de fond est un problème courant dans l’histologie de l’IVD. Un moyen rapide et peu coûteux de pénétrer dans ce tissu optiquement dense est l’utilisation d’un dispositif de sectionnement optique, par exemple au moyen d’un apotome. Dans un tel Apotome, une grille est insérée dans la voie d’éclairage d’un microscope à fluorescence conventionnel. Devant la grille, une plaque de verre plane-parallèle est placée. Cela s’incline d’avant en arrière, projetant ainsi la grille dans l’image dans trois positions différentes. Pour chaque position z, trois images brutes avec la grille projetée sont créées et superposées. Au moyen d’un logiciel spécial, la lumière floue peut être calculée. Le principe sous-jacent est que, si la grille est visible, cette information est au centre de l’attention, sinon elle est considérée comme floue. Avec cette technique, des images bien focalisées et haute résolution peuvent être acquises dans un délai raisonnable.

Deuxièmement, le tissu est difficile à trouver à partir de donneurs humains. Lors d’une arthroplastie totale du genou, toute la surface de l’articulation peut être obtenue pour une analyse plus approfondie pendant la chirurgie. Bien que l’arthrose d’une articulation diarthroïale soit également une maladie de l’articulation entière, il existe néanmoins de fortes différences focales dans la qualité du cartilage, généralement certaines zones de l’articulation étant encore intactes, par exemple en raison d’une charge réduite dans cette zone. Cette situation est différente dans le DIV, où la chirurgie n’est généralement effectuée que lorsque le disque est globalement détruit. Lors de l’obtention de tissus de donneurs humains dans la salle d’opération, le tissu est également très fragmenté et il est nécessaire d’attribuer correctement le tissu à l’un des trois types de cartilage du DIV avant de procéder à d’autres analyses. Pour permettre des analyses plus détaillées de coupes de tissus également plus grandes et pour examiner le développement embryonnaire de l’IVD, le choix d’un organisme modèle animal est donc nécessaire.

Lors du choix d’un tel organisme modèle, il est important d’avoir un système comparable au disque humain en ce qui concerne son anatomie et ses dimensions, sa charge mécanique, la population cellulaire actuelle ainsi que sa composition tissulaire. Aux fins de la technique présentée ici, nous suggérons l’utilisation de tissu discale lombaire bovin: Une propriété critique du disque humain entraînant son faible potentiel de régénération est la perte de cellules notochordales pendant la maturation dans le noyau. Cependant, dans de nombreux organismes modèles, les cellules notochordales peuvent être détectées toute leur durée de vie. La plupart des rares animaux qui perdent leurs cellules notochordales tels que les moutons, les chèvres ou les chiens chondrodystrophig ont un DIV beaucoup plus petit que les disques humains. Seuls les disques bovins lombaires présents ont un diamètre de disque sagittal comparable à celui des DIV humains¹⁵.

Un facteur clé conduisant à la dégénérescence précoce du disque est la charge mécanique excessive. Les pressions intradiscales d’une vache debout dans la colonne lombaire sont d’environ 0,8 MPa avec la colonne vertébrale alignée horizontalement. Étonnamment, ces pressions sont comparables aux pressions intradiscales lombaires rapportées pour la colonne vertébrale humaine en érection (0,5 MPa)^15,16. De plus, la quantité d’eau et de protéoglycanes dans les disques bovins est comparable à celle de l’IVD des jeunes humains¹⁷. Par conséquent, bien que le schéma de mouvement réel des segments de mouvement puisse différer chez les animaux quadrupèdes de l’humain bipède, en ce qui concerne la charge totale et les caractéristiques du disque, la vache est beaucoup plus proche de la biologie humaine que d’autres modèles animaux établis pour l’IVD tels que les moutons et les chiens.

Dans ce protocole, nous présentons une technique permettant d’analyser les changements dans le DIV du point de vue de l’organisation spatiale des chondrocytes, du développement embryonnaire précoce à la dégénérescence terminale.

Protocole

Pour l’analyse du développement et de la maturation embryonnaires, des disques bovins ont été utilisés. Pour évaluer la dégénérescence de l’IDIV, des échantillons humains ont été analysés.

Le tissu DIV humain a été obtenu chez des patients subissant une intervention chirurgicale pour une dégénérescence discale lombaire, un prolapsus discale ou un traumatisme de la colonne vertébrale dans le département de chirurgie orthopédique de l’hôpital universitaire de Tübingen et le centre de traumatologie BG de Tübingen. L’approbation complète du comité d’éthique a été obtenue avant le début de l’étude (numéro de projet 244/2013BO2). Le consentement éclairé écrit a été reçu de tous les patients avant leur participation. Les méthodes ont été réalisées conformément aux directives approuvées.

Le tissu bovin a été obtenu auprès de l’Office bavarois de la santé et de la sécurité alimentaire/Oberschleißheim et d’une usine d’équarrissage à Warthausen (Allemagne). L’approbation des autorités locales et vétérinaires a été reçue pour les tissus d’animaux morts.

1. Récolte d’échantillons

1. Tissu DIV humain : Placer immédiatement les échantillons de DIV obtenus en peropératoire dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 2 % (v/v) de pénicilline-streptomycine et 1,2 % (v/v) d’amphotéricine B. Conserver à 4 °C jusqu’à la suite du traitement. Traiter le tissu dans les 48 heures. Alternativement, conservez les tissus à -20 °C pendant plusieurs semaines.
2. Tissu DIV bovin : Assurez-vous de prélever le tissu sur les animaux dans les 24 heures suivant la mort.
   Réséquez les disques bovins avec les vertèbres environnantes des animaux morts en bloc. Transporter les tissus congelés sur de la glace carbonique et les conserver à -20 °C jusqu’à la suite du traitement.
   REMARQUE: Si seules des analyses de fluorescence sont prévues et qu’aucune autre méthode de quantification biochimique telle que ELISA ou PCR n’est prévue, effectuez la fixation tissulaire comme expliqué ci-dessous. Cela permet de conserver le tissu plus longtemps dans le stockage avant qu’il n’ait besoin d’être traité. Pour éviter la détérioration de la matrice tissulaire, effectuez la fixation dans les 48 heures suivant la récolte, sauf si le tissu est congelé directement.

2. Préparation de l’échantillon

1. Décongeler les tissus congelés à température ambiante. Traitez le tissu dès qu’aucun cristal de glace ne peut plus être ressenti lors de la compression numérique douce du tissu.
   REMARQUE: Effectuer la préparation du tissu dans le DMEM dans une boîte de Pétri.
2. Identifier l’origine du tissu DIV humain (anulus fibreux, zone intermédiaire, noyau pulpeux ou plaque terminale cartilagineuse) en fonction des propriétés macroscopiques telles que la densité et l’orientation du collagène.
3. Prenez le segment de mouvement constitué du disque DIV bovin avec ses deux vertèbres adjacentes et disséquez le disque dans son ensemble de l’os sous-chondral à l’aide d’une lame chirurgicale (lame numéro 15).
   1. Utilisez deux pinces anatomiques pour retourner le disque afin d’atteindre des zones plus centrées. Effectuez la dissection. Assurez-vous de réséquer le noyau pulpeux en dernier car il est beaucoup plus mince que l’anulus, sujet à la déchirure, et il ne se détache pas facilement d’une manière définie.
   2. Identifier les différentes zones du cartilage.
   3. Découpez la zone d’intérêt de l’ensemble du disque à l’aide d’une lame chirurgicale (lame numéro 20 ou 22). Vous pouvez également utiliser une lame de cryotome.
      REMARQUE: Comme les disques bovins viennent en bloc comme une partie de la colonne vertébrale, les disques peuvent être préparés in-toto. Cela rend l’identification correcte des différents types de cartilage beaucoup plus facile. Lors de la dissection du disque de la manière décrite ci-dessus, la plaque d’extrémité cartilagineuse reste sur les vertèbres. Si cette zone doit être étudiée, il est préférable de la retirer de l’os sous-jacent à l’aide d’un ciseau fonctionnant dans une direction tangentielle légèrement courbée.
4. Dans le cas où les embryons sont d’une longueur couronne-croupe inférieure à 20 cm, assurez-vous de traiter les embryons en toto pour préserver l’architecture tissulaire du DIV. N’effectuez aucune dissection des vertèbres dans ces cas.
5. Une fois le disque réséqué in-toto, identifiez les différentes zones du cartilage.
   1. Effectuer la décalcification dans l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (20% (p/v); pH = 7,4) à température ambiante. Choisissez le volume en fonction de la taille de l’échantillon - l’ensemble du tissu doit être bien recouvert d’EDTA.
   2. Changez la solution de décalcification quotidiennement, ce qui peut durer jusqu’à 5 jours en fonction de la taille du tissu.
   3. Vérifiez que la décalcification est réussie avec une aiguille de calibre 20 qui pénètre dans les vertèbres sans résistance notable.
      REMARQUE: Le changement quotidien de la solution de décalcification est important pour empêcher le liant chélate EDTA de saturation pour maintenir l’efficacité de la réaction. Il empêche également la colonisation bactérienne.

3. Classement de l’âge, de l’intégrité et de la dégénérescence de l’échantillon

1. Classez le tissu discale humain dans l’une des cinq catégories suivantes à l’aide d’informations cliniques ainsi que d’imagerie par rayons X et par résonance magnétique¹⁸ (Figure 3).
   REMARQUE: Catégorie I: Pour servir d’échantillon presque sain, utilisez anulus sans aucun signe radiologique de dégénérescence DIV dérivée d’un traumatisme aigu de la colonne vertébrale.
   Catégorie II: Pour illustrer une situation d’inflammation aiguë avec début de dégénérescence, utilisez du tissu de la zone intermédiaire de patients présentant des symptômes cliniques d’une durée inférieure à 4 semaines.
   Catégorie III: Décrire une situation où la réaction inflammatoire avait déjà eu le temps d’affecter les tissus et les cellules prélèvent des tissus de patients opérés pour un prolapsus nucléaire mais avec une durée de symptôme supérieure à 4 semaines.
   Catégorie IV: Pour la dégénérescence discale modérée, sélectionnez l’anulus obtenu par chirurgie avec fusion intercorporelle pour la discopathie dégénérative avec un score de Pfirrmann de 3 ou 4 en imagerie par résonance magnétique¹⁹.
   Catégorie V: Pour le processus de dégénérescence en phase terminale anulus obtenu par chirurgie avec fusion intercorporelle pour la discopathie dégénérative avec un score de Pfirrmann de 5.
2. Classer le tissu bovin en fonction du stade de développement ou de l’âge de l’animal dans l’une des huit catégories, comme le montre le tableau 1.
   1. Calculez l’âge de gestation sur la longueur couronne-croupe des embryons en fonction de la formule suggérée par Keller:
      Âge de gestation en mois =
      NOTE: Les animaux dans les 4 premières semaines de gestation présentent une longueur couronne-croupion de 0,8-2,2 cm²⁰.

4. Fixation des tissus

1. Fixer les échantillons dans 10x le volume de l’échantillon de solution de formaldéhyde à 4% (p/v) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant la nuit à 4 °C.
   REMARQUE: La solution de formaldéhyde pénètre dans les tissus à une vitesse d’environ 1 mm / heure de chaque direction. Pour les très petits ou très gros échantillons, un ajustement du temps d’exposition pourrait être nécessaire.
2. Conserver le tissu dans du PBS à 4 °C jusqu’à la suite du traitement.

5. Sectionnement histologique

1. Incorporer les échantillons dans un milieu d’incorporation soluble dans l’eau sur le bouton du cryotome.
   1. Placez le tissu sur le bouton de manière à ce qu’un plan axial soit généré, soit un plan qui coupe les lamelles de collagène de type I perpendiculairement (par exemple, un plan de section sagittal médian).
      REMARQUE: Le tissu doit être entièrement recouvert par le support d’encastrement.
2. Découper le tissu incorporé à une épaisseur de 70 μm dans des échantillons humains et de 40 μm dans des échantillons de bovins à l’aide d’un cryotome standard.
   REMARQUE: La différence d’épaisseur de section est due à la différence d’intégrité tissulaire entre le disque bovin intact et le tissu humain hautement dégénéré.
3. Rassemblez les sections sur une lame de verre.
   1. Entourez les sections de tissus avec un stylo hydrophobe.
   2. Rincez les sections 3 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le milieu d’incorporation soluble dans l’eau.

6. Coloration par fluorescence

1. Ajouter 60 μL de 1 % (v/v) de DAPI (Exmax 358 nm, Emmax 461 nm) ainsi que 1 % (v/v) de coloration Actin Tracking (Exmax 540 nm, Emmax 565 nm) dans PBS et incuber pendant 5 min à température ambiante.
   REMARQUE: Le protocole de coloration décrit ici consiste à visualiser le noyau à l’aide d’une coloration nucléaire DAPI (bleu) et le cytoplasme à l’aide d’Actin Tracking Stain (rouge). Le DIV a une forte autofluorescence due aux fibres de collagène dans le canal vert. La quantité de fluide ajoutée aux sections dans ce protocole est destinée aux sections d’une taille d’environ 5 mm x 5 mm. Pour les sections plus grandes, ce montant doit être augmenté en conséquence. Effectuez tous les travaux dans des pièces sans exposition directe au soleil et avec des lumières tamisées pour éviter le blanchiment du colorant.
2. Retirez le liquide de coloration avec une pipette et lavez trois fois avec 60 μL de PBS à chaque fois.
3. Ajoutez un support de montage approprié et couvrez les sections avec un couvercle.
   REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air piégées lors de l’ajout du couvercle. Pour ce faire, il est préférable de commencer le contact du glissement avec la glissière sur une jante, puis de laisser le glissement descendre lentement.

7. Imagerie et traitement microscopiques

1. Placez une lame avec une section colorée sur le porte-échantillon du microscope.
   REMARQUE: En raison du réseau dense de collagène de type I de l’IVD, la lumière diffusée rend le tissu difficile à visualiser à l’aide de la microscopie à fluorescence conventionnelle. Une façon de résoudre ce problème consiste à effectuer un sectionnement optique à l’aide d’un éclairage structuré. Cela permet également de rendre une projection tridimensionnelle de l’échantillon entier dans les deux canaux (bleu et rouge). Il est préférable d’utiliser le réglage d’éclairage structuré et le mode Mosaïque avec un objectif de grossissement 10x pour obtenir une vue d’ensemble de l’échantillon ainsi que des reconstructions 3D de motifs individuels.
2. Démarrez le dispositif d’éclairage structuré.
   1. Effectuez une imagerie à champ de vision unique avec un microscope à fluorescence approprié, des filtres à fluorescence et un éclairage adéquat.
      REMARQUE: Ajustez le temps d’exposition pour tous les filtres utilisés afin de normaliser l’acquisition d’imagerie. Pour obtenir une représentation précise de l’échantillon à une image de résolution plus élevée, les sections avec un grossissement plus élevé (par exemple, objectif 20x).
   2. Post-traitez les images en optimisant l’intensité et la luminosité à l’aide d’un logiciel d’optimisation d’image compatible avec le microscope à fluorescence.
3. Pour visualiser la section dans son ensemble, utilisez la technique d’imagerie en mosaïque
   1. Ouvrez les paramètres d’acquisition (appuyez sur 6D- Acquisition) dans le panneau de la barre d’outils.
   2. Ajustez les paramètres de mosaïque (dans MosaiX Register)et définissez le nombre de colonnes et de lignes d’images de champ de vision qui seront ensuite fusionnées en une seule image de vue d’ensemble.
   3. Appuyez sur Configuration et réglez la correction de mise au point de chaque vignette.
      REMARQUE: Il est presque impossible pour une grande section de tissu d’avoir toute la surface du tissu dans un seul plan de mise au point. Les tuiles d’image à différents niveaux focaux peuvent être prises par 'MosaiX Acquisition'.
   4. Pour démarrer l’acquisition des vignettes d’image, appuyezsur Démarrer .
   5. Assemblez les tuiles imagées à l’aide de la fonction d’assemblage (boutonCouture) avec un chevauchement de 20% incorporé dans le logiciel.
   6. Post-traitez les images en optimisant l’intensité et la luminosité à l’aide d’un logiciel d’optimisation d’image compatible avec le microscope à fluorescence.
4. Pour analyser l’organisation spatiale des chondrocytes, utilisez la fonction 3D incorporée dans le logiciel.
   1. Ajustez les paramètres z-stack. Définissez les paramètres de numérisation : définissez les positions de départ et d’arrêt sur l’axe z et la distance de la tranche en activant le bouton Démarrer/Arrêter.
      REMARQUE: Le logiciel calcule automatiquement le nombre de tranches.
   2. Pour lancer l’acquisition des z-stacks d’images, appuyezsur Démarrer .
   3. Post-traitez les images en optimisant l’intensité et la luminosité à l’aide d’un logiciel d’optimisation d’image compatible avec le microscope à fluorescence.
5. Exportez les images avec un format de fichier compatible avec le logiciel de traitement d’image.
   REMARQUE: Exportez les reconstructions 3D sous forme d’images individuelles et / et en tant que modèle 3D interactif ou dans un format vidéo.

8. Identification du profil cellulaire et évaluation de la densité

1. Ouvrez les images en mosaïque exportées de toute la section de tissu dans un programme de traitement d’image approprié.
2. Définissez les zones soumises à l’évaluation de la densité cellulaire en définissant des régions d’intérêt de 500 μm x 500 μm dans les images.
   REMARQUE : Toutes les tuiles qui n’ont pas une qualité d’image adéquate sont exclues de l’analyse.
3. Identifiez les modèles cellulaires individuels.
   REMARQUE: Les cellules individuelles sont définies comme des cellules individuelles - entièrement encapsulées dans la matrice adjacente. Les paires sont définies comme deux cellules adjacentes à proximité (<25 μm) où les cellules sont interconnectées à travers leurs matrices (voir figure 2). Les formations de cordes sont au moins trois chondrocytes alignés en ligne (à partir du milieu des noyaux <25 μm). Ces cellules sont entourées d’une matrice intacte et des interconnexions matricielles peuvent être vues entre chaque cellule. Les amas représentent plusieurs cellules situées à proximité directe les unes des autres (<25 μm) et sont encapsulées dans une grande lacune dépourvue de matrice.
4. Utilisez un plug-in de comptage cellulaire pour l’analyse quantitative des modèles cellulaires.
   REMARQUE: La coloration du cytoplasme représente une méthode de vérification pour identifier les différents modèles spatiaux.
5. Calculez la densité cellulaire en divisant les cellules comptées par la taille de la région d’intérêt choisie.

Résultats

En utilisant des images en mosaïque, l’architecture de l’IVD avec son réseau dense de fibres de collagène dans l’anulus et le noyau plus mou peut être clairement reconnue (Figure 4). Une diminution continue de la densité cellulaire peut être observée au cours du développement embryonnaire (Figure 5). Alors qu’aux premiers stades du développement de l’IDIV, on peut trouver une densité cellulaire de 11 435 cellules/mm² dans l’anulus fibreux ...

Discussion

En utilisant la microscopie à fluorescence augmentée par l’imagerie en mosaïque et la section optique, nous avons évalué la disposition spatiale des chondrocytes dans l’anulus du DIV lombaire tout au long du développement, de la maturation et de la dégénérescence. Alors que le tissu dégénératif pouvait être prélevé sur des patients recevant une chirurgie de la colonne vertébrale pour une dégénérescence discale, l’analyse de la période embryonnaire et de la phase de maturation nécessitait l’ut...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck KGaA,  Germany	A2942
Adhesion Microscope Slides SuperFrost Plus	R. Langenbrinck, Germany	03-0060
ApoTome	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	462000115
AxioVision Rel. 4.8 with Modul MosaiX	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany
CellMask Actin Tracking Stain	Thermo Fischer Scientific, US	A57249
Cryostat	Leica Biosystems, US	CM3050S
DAPI	Thermo Fischer Scientific, US	D1306
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Germany	41966052
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich, US	60004
Fluorescence Miscoscope - Axio Observer Z1 with Axio Cam MR3 and Colibri	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	3834000604
Formaldehyde	Merck KGaA,  Germany	104002
Image J 1.53a, with Cell counter plugin	National Insittute of Health (NIH), US
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin	Thermo Fischer Scientific, US	A12380
Microscopic Cover Glasses	R. Langenbrinck, Germany	01-1818/1
PAP Pen Liquid Blocker	Science Sevices  GmbH, Germany	N71310
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, US	P4333
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich,US	P5119
Scalpel	pf medical AG, Germany	2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Netherlands	SA6255012