Tests basés sur la chimiluminescence pour la détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés à partir de l’autoxidation et des composés nitrosés

Résumé

Nous présentons ici des protocoles de détection de l’oxyde nitrique et de ses dérivés biologiquement pertinents à l’aide de tests basés sur la chimiluminescence avec une sensibilité élevée.

Résumé

L’activité de l’oxyde nitrique (NO) in vivo est le résultat combiné de ses effets directs, de l’action de ses dérivés générés par l’autoxidation du NO et des effets des composés nitrosés. La mesure des métabolites du NO est essentielle pour étudier l’activité du NO à la fois au niveau vasculaire et dans d’autres tissus, en particulier dans les milieux expérimentaux où le NO exogène est administré. Les tests de chimiluminescence à base d’ozone permettent de mesurer avec précision les métabolites du NO et du NO dans les fluides (y compris le plasma, les homogénats tissulaires, les cultures cellulaires) et les mélanges gazeux (p. ex., l’haleine expirée). Le NO réagit avec l’ozone pour générer du dioxyde d’azote dans un état excité. L’émission de lumière qui en résulte permet la photodétection et la génération d’un signal électrique reflétant la teneur en NO de l’échantillon. Les aliquotes du même échantillon peuvent être utilisées pour mesurer des métabolites spécifiques du NO, tels que le nitrate, le nitrite, les S-nitrosothiols et les complexes fer-nitrosyle. En outre, le NO consommé par l’hémoglobine sans cellules est également quantifié avec une analyse de chimiluminescence. Une illustration de toutes ces techniques est fournie.

Introduction

Depuis que Salvador Moncada et les lauréats du prix Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro et Ferid Murad ont identifié l’oxyde nitrique (NO) comme le facteur de relaxation dérivé de l’endothélium (EDRF) précédemment connu, le rôle central du NO a été établi dans plusieurs mécanismes clés couvrant la biologie vasculaire, les neurosciences, le métabolisme et la réponse de l’hôte 1,2,3,4,5,6,7 . L’administration exogène de gaz NO est devenue un traitement établi pour l’insuffisance respiratoire due à l’hypertension pulmonaire chez le nouveau-né⁸. Le gaz d’oxyde nitrique a également été étudié pour le traitement de l’infection par le virus respiratoire syncytial (VRS), du paludisme et d’autres maladies infectieuses, des lésions d’ischémie-reperfusion et pour la prévention des lésions rénales aiguës chez les patients subissant une chirurgie cardiaque ^9,10,11,12. La nécessité de techniques de mesure précises pour évaluer les niveaux de NO, ses métabolites et ceux de ses protéines et composés cibles découle d’études mécanistes et interventionnelles.

En raison de sa forte réactivité, le NO peut subir des réactions différentes selon la matrice biologique dans laquelle il est produit et/ou libéré. En l’absence d’hémoglobine (Hb) ou d’autres oxy-hémoprotéines, le NO est oxydé presque complètement en nitrite (NO₂^-).

2NO + O₂ → 2NO₂

NO₂ + NO → N₂O₃

N₂O₃ + H₂O → NO₂^- + H⁺

Le NO subit d’abord une autoxidation avec de l’oxygène moléculaire (_O2) pour produire du dioxyde d’azote (NO₂) et réagit avec le NO₂ lui-même pour générer du trioxyde de diazote (N_2O3). Une molécule de_N2O3réagit avec l’eau (_H2O) pour former deux molécules de NO₂^- et un proton (H⁺)¹³. Dans le sang total^14,15, le NO et le NO₂^- sont rapidement convertis en nitrate (NO₃^-) car ces molécules réagissent avidement avec les groupes hémiques oxydés de Hb [Hb-Fe²⁺-_O2 ou oxyhémoglobine (oxyHb)] pour donner no₃^-. Cette réaction est couplée à la transition du groupe hème à l’état ferrique [Hb-Fe³⁺ ou méthémoglobine (metHb)]:

Hb-Fe²⁺-O₂ + NO → Hb-Fe³⁺ + NO₃^-

La barrière des globules rouges (GR) et l’espace immédiatement adjacent à l’endothélium sont les principaux facteurs limitant cette réaction et permettant à une petite partie du NO libéré par l’endothélium d’agir comme EDRF^16,17. En fait, l’Hb sans cellules dans la circulation est connue pour perturber la vasodilatation dans les contextes expérimentaux et cliniques^17,18. Dans les globules rouges, en fonction de l’oxygénation et de ^{la concentration de} NO₂,, une portion de NO réagit avec la désoxyhémoglobine (Hb-Fe²⁺) pour former du fer-nitrosyl Hb (Hb-Fe²⁺-NO ou HbNO) :

Hb-Fe²⁺ + NO → Hb-Fe²⁺-NO

Dans le RBC^15,17, le NO 2^- peut former de l’Hb-Fe³⁺ en réduisant l’Hb-Fe²⁺ conduisant à la libération de NO, qui à son tour lie Hb-Fe²⁺-_O2 (préférentiellement) ou Hb-Fe²⁺.

La génération de dérivés du NO ne doit pas être considérée comme strictement unidirectionnelle, car le NO peut être régénéré à partir du NO₂ ^et du NO₃ ^dans divers tissus et par différentes enzymes (par exemple, par des bactéries intestinales ou dans les mitochondries, en particulier dans des conditions hypoxiques)^19,20.

Une quantité variable de NO produite (ou administrée) conduit à la génération en aval de S-nitrosothiols, principalement par transnitrosation de thiol à partir de_N2O3 en présence d’un nucléophile créant un intermédiaire donneur de NO⁺ (Nuc-NO⁺-NO₂^-) :

N₂O₃ + RS^- → RS-NO + NO₂^-

Une autre possibilité pour la génération de S-nitrosothiols est la nitrosylation des thiols oxydés (NO réagissant avec un thiol oxydé):

RS• + PAS de → RS-NO

Ce mécanisme et l’oxydation directe du thiol par le NO₂ pourraient n’être possibles que dans des conditions très spécifiques qui sont décrites ailleurs²¹. Les S-nitrosothiols vont des molécules légères comme le S-nitrosoglutathion aux grandes protéines contenant du thiol. La S-nitrosohémoglobine (S-NO-Hb) est formée par nitrosation d’un groupe thiol d’un résidu de cystéine conservé dans la chaîne β (β93C)²².

La génération et le métabolisme des S-nitrosothiols font partie d’importants mécanismes de régulation. Les exemples incluent la régulation du glutathion, des caspases, du N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et des récepteurs de la ryanodine 23,24,25,26,27,28. Auparavant considérée comme un médiateur majeur de la biologie du NO in vivo, l’albumine nitrosée (S-nitroso-albumine) semble être un transporteur de NO/NO⁺ sans activité biologique supplémentaire spécifique²⁹.

Lors de la mesure de la concentration de NO et de ses dérivés à partir d’un échantillon biologique spécifique dans une matrice biologique, il est important de prendre en compte des caractéristiques telles que l’acidité, l’oxygénation, la température et la présence de réactifs. Les exemples incluent les donneurs de NO exogènes administrés et, dans le cadre d’une inflammationaiguë, le peroxyde d’hydrogène (_{H2O 2}) réagissant avec le NO₂ conduisant à la génération d’une concentration surnormale de radicaux libres comme le peroxynitrite (ONOO^-)²¹. En plus de la méthode analytique utilisée, la phase préanalytique de la préparation et du stockage des échantillons est fondamentale. Les réactions en aval qui ne représentent pas l’activité in vivo du NO doivent être prédites, prises en compte et bloquées. Un exemple valable est l’instabilité du S-NO-Hb, nécessitant un traitement dédié des échantillons de sang lorsqu’il est ciblé pour la mesure²².

Les tests basés sur la chimiluminescence sont la référence absolue pour détecter les niveaux de NO et de ses principaux métabolites [NO₂^-, NO₃^-, S-NO et complexes fer-nitrosyle (Fe-NO)] dans tout fluide biologique, y compris les homogénats tissulaires^30,31. Ces méthodes s’appuient sur le détecteur de chimiluminescence (CLD), un dispositif qui abrite la réaction du NO avec l’ozone (O₃), générant le NO₂ à l’état excité (NO₂•). La relaxation du NO₂• provoque l’émission d’un photon de lumière détecté par un tube photomultiplicateur, générant un signal électrique directement proportionnel à la teneur en NO du mélange gazeux échantillonné³². Un schéma simplifié du CLD est représenté.

Figure 1 : Schéma simplifié d’un détecteur de chimiluminescence pour le gaz d’oxyde nitrique. La détection d’oxyde nitrique (NO) basée sur la chimiluminescence est la génération stœchiométrique d’un photon par molécule de gaz NO introduite dans le détecteur de chimiluminescence (CLD). La réaction de chimiluminescence est obtenue dans une chambre désignée alimentée en ozone (O3) à partir d’un générateur interne, qui est maintenu à pression négative par connexion avec une pompe externe, permettant un afflux continu et constant de gaz d’échantillonnage. La génération d’O₃ nécessite de l’oxygène diatomique (_O2) qui est alimenté par un réservoir O₂ dédié connecté au CLD (d’autres fabricants fournissent des CLD fonctionnant avec de l’air ambiant). Dans la chambre de réaction, chaque molécule de GAZ NO contenue dans le gaz échantillonné réagit avec l’oxygène pour produire une molécule de dioxyde d’azote à l’état activé (NO₂*). En revenant à son état fondamental, chaque molécule de NO₂* émet un photon qui est détecté par un tube photomultiplicateur (PMT) situé à côté de la chambre de réaction. Le PMT avec l’amplificateur associé et l’unité centrale de traitement produit un signal proportionnel au nombre de photons et au nombre de molécules de NO dans la chambre de réaction. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’entrée d’échantillon du CLD peut être connectée à un système de verrerie contenant une chambre de réaction pour les échantillons liquides. Le système est continuellement purgé avec un gaz inerte tel que l’azote, l’hélium ou l’argon, transférant le NO de la chambre de réaction au CLD. Des échantillons en phase liquide sont injectés à travers une membrane dédiée dans le récipient de purge.

Figure 2 : Structure d’un récipient de purge pour la détection par chimiluminescence du gaz d’oxyde nitrique Le récipient de purge (à droite) permet la détection du gaz d’oxyde nitrique (NO) ou de tout autre composé qui peut être facilement converti en gaz NO lorsqu’il est libéré d’un réactif en phase liquide. L’entrée de gaz inerte est reliée à une source (réservoir) d’un gaz inerte tel que l’argon, le xeon ou l’azote diatomique (N₂). La valve à aiguille (s’ouvre à gauche) est utilisée pour le contrôle de la pression dans le récipient de purge et peut être complètement retirée pour nettoyer le récipient. L’orifice d’injection est recouvert d’un capuchon avec un septum membranaire pour l’injection d’échantillons. La membrane doit être remplacée souvent. Une veste chauffante entoure la chambre de réaction et est reliée à un bain d’eau chaude pour effectuer le test VCl₃ en HCl. La sortie du récipient de purge est connectée au détecteur de chimiluminescence (CLD) ou au piège NaOH (requis pour VCl₃ dans les tests HCl). Pour drainer le contenu de la chambre de réaction, fermez d’abord les robinets d’arrêt à l’entrée de gaz inerte et à la sortie du récipient de purge, fermez la vanne à aiguille, retirez le bouchon à l’orifice d’injection et enfin ouvrez le robinet d’arrêt au niveau du drain. Le piège NaOH (à gauche) doit être placé en ligne entre le récipient de purge et le CLD si le test VCl₃ dans HCl est effectué en raison de la corrosivité du HCl. La connexion au CLD nécessite toujours qu’un filtre diélectrique à champ intense (IFD) soit placé entre le CLD et la sortie du récipient de purge (ou du piège NaOH, le cas échéant). Le filtre IFD élimine les particules en suspension dans l’air et empêche le liquide de passer à travers le récipient de purge. PTFE = polytétrafluoroéthylène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En conséquence, tout composé pouvant être converti en NO par une réaction chimique spécifique et contrôlée peut être détecté avec une sensibilité élevée dans tout fluide biologique et homogénat tissulaire²⁴. La mesure directe du NO en phase gazeuse par chimiluminescence est effectuée dans des contextes expérimentaux et cliniques. Ces techniques sont largement décrites ailleurs 33,34,35. La mesure du NO₂^-, des S-nitrosothiols, des protéines S-nitrosées et des Fe-NO peut être effectuée en ajoutant des échantillons dans un mélange réactionnel avec du triiodure (_I3^-), qui libère stœchiométriquement du GAZ NO de tous ces composés:

I₃^- → I₂ + I^-

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO + I₂ +2H₂O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

tandis que I₃^- ne réagit pas avec NO ^3-15. Des mesures précises de chaque composé sont rendues possibles par le prétraitement des aliquotes d’échantillons avec du sulfanilamide acidifié (AS) avec ou sans chlorure mercurique (HgCl₂). Plus précisément, le prétraitement avec AS élimine toute la_teneur ^{en NO} 2. En conséquence, la teneur en NO mesurée par le CLD ne reflète que la somme des concentrations de S-NO et de Fe-NOs. L’injection de HgCl₂ dans une aliquote d’échantillon avant l’injection de SA provoque la libération de NO₂^- par S-NO. Le traitement par AS (conduisant à ^{l’élimination du} NO₂) garantit que la teneur en NO mesurée ne reflète que la concentration de Fe-NO. Une série de soustractions entre les évaluations permet de calculer la concentration précise des trois dérivés du NO²².

Figure 3 : Étapes de préparation de l’échantillon pour le test de chimiluminescence de l’acide acétique_I3^- dans l’acide acétique. Les étapes séquentielles de préparation du test de chimiluminescence de l’acide_I3^- dans l’acide acétique sont illustrées. L’utilisation de tubes centrifuges protégés contre la lumière est requise. Les tubes 1, 2 et 3 sont ceux utilisés pour préparer le test. Une autre aliquote d’échantillon (tube 4) est nécessaire pour le test VCl₃ dans HCl si la mesure du nitrate (NO₃^-) est requise. Les étapes sont indiquées par des chiffres en rouge. Préremplir (étape 1) comme indiqué avec une solution saline tampon phosphate (PBS) ou HgCl₂ avant d’ajouter le volume de l’échantillon. Ajouter le volume de l’échantillon (2) comme indiqué, vortex, et incuber pendant 2 min à température ambiante (RT). Ajouter (3) pbS ou sulfanilamide (AS) acidifié comme indiqué, vortex, et incuber pendant 3 min à TA. Exécuter le test (4). La concentration mesurée par le dosage est la somme de la concentration des composés rapportée sous chaque tube. Le tube numéro 1 permettra de mesurer les nitrites (NO₂^-), les S-nitrosothiols (S-NO) et les complexes fer-nitrosyle (Fe-NO) en un seul signal. Pour la mesure des nitrates (NO₃^-), les échantillons doivent être traités avec à la fois_I3^- dans l’acide acétique et VCl3 dans les dosages HCl, et la valeur obtenue à partir du tube 1 doit être soustraite de celle obtenue à partir du tube 4. *quantités suggérées à utiliser pour l’analyse de l’Hb pour la détermination du NO ^2-résiduel, de la S-nitrosomémoglobine et de l’hémoglobine fer-nitrosyl. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour ^{la mesure du} NO₃, le chlorure de vanadium (III) (VCl₃) dans l’acide chlorhydrique (HCl) est utilisé pour la conversion du NO₃^- en NO dans le récipient de purge afin de mesurer le NO₃^- stœchiométriquement avec le CLD:

2 NO₃^-+ 3V⁺³ + 2H₂O → 2NO + 3VO₂⁺ + 4H⁺

Pour obtenir une conversion suffisamment rapide, la réaction doit être effectuée à 90-95 °C. La réduction de NO₃^- à NO₂^- est couplée à une réduction de NO₂^- à NO par HCl. Le vanadium métal réduit également les S-NO libérant leur fraction NO^22,36. La concentration finale obtenue par CLD avec_VCl3 dans HCl reflète la concentration globale de NO₃^-, NO₂ et d’autres composés nitrosés. La soustraction de cette dernière valeur de la concentration obtenue avec CLD avec I₃^- permet de calculer la concentration de NO₃^{- 36,37} (Figure 3).

Dans le test de consommation de NO, la libération continue de NO dans le récipient de purge par des donneurs de NO comme (Z)-1-[2-(2-aminoéthyl)-N-(2-ammonioéthyl)amino]diazène-1-ium-1,2-diolate (DETA-NONOate) génère un signal stable permettant de quantifier l’oxyHb sans cellule dans les échantillons injectés. La quantité de NO consommée dans le récipient de purge est en relation stœchiométrique avec la quantité d’oxyHb dans l’échantillon³⁸.

Les protocoles de mesure des NO₂^, NO₃^, S-nitrosothiols, des complexes fer-nitrosyle et de LA CONSOMMATION DE NO par Hb sans cellules dans des échantillons de plasma sont illustrés. Les études sur le NO dans l’environnement RBC nécessitent un traitement spécifique de l’échantillon suivi d’une chromatographie d’exclusion pour mesurer les S-NO-Hb et Hb-NO extrêmement fragiles couplés à la détermination de la concentration totale ^{d’Hb 15,22}. La préparation des échantillons joue un rôle déterminant dans la correction de la mesure. La préexistence du NO₂^- dans_H2Oet la libération du NO₂^- pendant le test peuvent conduire à la mesure de concentrations artificiellement plus élevées de dérivés du NO tels que le S-NO-Hb^14,39. Des aspects importants de la préparation des échantillons sont également présentés.

Protocole

Les procédures indiquées dans ce protocole sont conformes au comité d’examen du Massachusetts General Hospital. Les échantillons de sang utilisés avaient été prélevés lors d’une étude précédente et ont été anonymisés aux fins actuelles¹⁸.

REMARQUE: Voir les instructions du fabricant pour des conseils spécifiques concernant les connexions optimales entre les tubes et la verrerie constituant le récipient de purge, le lavage et l’entretien général. Les connexions doivent être fermes et soigneusement faites pour ne pas endommager la verrerie. Identifier les composants de la cuve de purge en verre : conduite d’entrée de gaz, cuve de purge avec enveloppe chauffante et condenseur, piège à bulles de gaz à hydroxyde de sodium (NaOH), ligne de connexion entre la cuve de purge et le barboteur, conduite de gaz de sortie de la cuve de purge (vers CLD) dotée d’un filtre diélectrique à champ intense (IFD). Une ligne de filtre IFD entre le récipient de purge et l’entrée de l’échantillon du CLD doit être en place chaque fois que l’ON mesure des métabolites sous forme liquide (plasma, cultures cellulaires, homogénats tissulaires) (tous les essais présentés dans le protocole). La préparation de l’échantillon dépend du liquide ou du tissu analysé et des composés d’intérêt. Des aspects importants de la phase préanalytique sont abordés dans les sections 1 et 2. Des étapes de préparation spécifiques pour des essais spécifiques sont incluses dans les sections 3 à 5. Les articles 6 à 8 s’appliquent à tous les essais.

1. Préparation de réactifs dédiés

NOTE: Pour plus de détails, reportez-vous aux publications^{précédentes 15,22}.

1. Préparer une solution de sulfanilamide (AS) acidifiée à 5 % (290 mM) pour l’élimination du NO₂^- en dissolvant 500 mg de sulfanilamide dans 10 mL de 1N HCl. Cette solution est stable pendant des mois.
2. Préparer une solution de chlorure mercurique (HgCl₂) de 50 mM pour la libération de NO₂ ^par les S-NO O.- en dissolvant 67,9 mg de HgCl2 dans 5 mL de PBS. Protégez la solution mère de la lumière.
3. Préparer la ^{solution bloquant le} NO₂ avec 800 mM de ferricyanure [_K3Fe(CN)₆] pour oxyder l’Hb avec 100 mM de N-éthylmaléimide (NEM) pour bloquer les groupes thiol et (FACULTATIF) une solution de nonylphényl-polyéthylène glycol à 10 % (Nonidet p-40) pour solubiliser les membranes des globules rouges.
   1. Ajouter K₃Fe(CN)₆ à l’eau désionisée et distillée (ddH₂O, 263,5 g de poudre par litre) pour obtenir une concentration finale de 800 mM.
   2. Ajouter nem à la solution de 800 mM K₃Fe(CN)₆ dans ddH₂O (12,5 g de poudre par litre pour avoir une concentration de 100 mM) et mélanger la solution pour dissoudre tous les cristaux.
   3. Ajouter une partie de NP-40 à 10 % à neuf parties de la solution NEM K₃Fe(CN)₆ 100 mM neM de 800 mM (111 mL par litre) et bien mélanger (étape obligatoire pour l’analyse du sang total).
4. Préparer la solution de stabilisation S-NO-Hb contenant 12 mM_K3Fe(CN)₆, 10 mM NEM, 100 μM d’acide diéthylènetriaminepentaacétique (DTPA, pour la chélation des métaux) et 1 % de détergent Nonidet p-40 à partir de leurs solutions mères.
   1. Préparer une solution de NEM de 200 mM en ajoutant des cristaux de NEM au PBS (25 mg/mL, par exemple 250 mg dans 10 mL de PBS) et mélanger la solution jusqu’à ce que tous les cristaux soient dissous (à fabriquer le jour de l’expérience).
   2. Préparer une solution de 800 mM_K3Fe(CN)₆ en ajoutant_K3Fe(CN)₆ à ddH₂O (263,5 mg/mL par exemple 1,32 g dans 5 mL de ddH₂O pour obtenir une concentration finale de 800 mM) (à réaliser le jour de l’expérience).
   3. Préparer une solution mère de DTPA de 10 mM en ajoutant 786 mg de DTPA à 200 mL de ddH₂O et ajuster le pH à 7,0 avec 5N NaOH pour solubiliser complètement le DTPA.
   4. Ajouter 5 mL de solution NEM de 200 mM, 1,5 mL de solution_K3Fe(CN)₆ de 800 mM et 1 mL de solution mère de DTPA à 81,5 mL de PBS à 7,2 pH, et enfin, ajouter enfin 11 mL de NP-40 à 10 % pour porter le volume final à 100 mL.

2. Prélèvement d’échantillons

REMARQUE: Pour plus de détails sur la collecte d’échantillons, reportez-vous aux travaux précédemment publiés 15,22,40.

1. Prélever du sang total
   1. Prélever le sang dans des tubes recouverts d’héparine préférant les veines aux vaisseaux artériels (sauf si cela est spécifiquement nécessaire) et préférant la mise en place d’un cathéter plutôt que la ponction veineuse (si possible) avec un cathéter ou un alésage d’aiguille d’au moins 20 G ou plus pour minimiser l’hémolyse.
   2. Ajouter immédiatement la solution bloquant le NO₂⁽ 1 partie de la solution à 4 parties de sang total), traiter (rubriques 3 ou 4), ou congeler et conserver à -80 °C.
2. Recueillir du plasma et des globules rouges (GLOBULES ROUGES)
   1. Prélever le sang dans des tubes enduits d’héparine préférant le sang veineux au sang artériel (sauf si cela est spécifiquement nécessaire) et des aiguilles d’au moins 20 G ou plus pour minimiser l’hémolyse et centrifuger immédiatement pendant 5 min à 4000 x g à 4 °C.
   2. Mélanger le surnageant (plasma) avec la solution bloquant le NO₂ ⁽1 partie de la solution à 4 parties du surnageant) dans un nouveau tube et procédé (sections 3 ou 4), ou congeler et conserver à -80 °C.
      REMARQUE: Pour le test de consommation de NO, la solution de blocage du NO₂ ^ne peut pas être utilisée. Le test peut être effectué sans prétraitement plasmatique.
   3. Remettre en suspension la pastille RBC du fond dans un nouveau tube prérempli avec une solution de stabilisation S-NO (voir étape 1.4) (1 mL de pastille à 9 mL de solution) et incuber pendant 5 min.
   4. Passer le lysat RBC dans une colonne de calibrage avec du polymère G-25 Sephadex qui a été préalablement rincé avec du ddH₂O pour la chromatographie d’exclusion
   5. Recueillir la fraction d’Hb pour la traiter (section 4) et mesurer la concentration d’Hb à l’aide du réactif de Drabkin (pour la mesure de l’Hb, se référer aux travaux publiés précédemment²²).
      REMARQUE: Pour préparer et échantillonner un tissu / organe spécifique, identifier son hile et l’isoler chirurgicalement. Inciser la veine, percer l’artère et injecter une solution saline héparinisée (10 U /mL) via l’artère. Excisez le tissu lorsque la solution saline commence à refluer au niveau de l’incision veineuse. Homogénéiser le tissu avec un homogénéisateur mécanique tout en ajoutant 1 partie de solution bloquant le NO₂ ^à 4 parties de tissu homogénéisé.

3. VCl₃ dans la préparation du test HCl

REMARQUE: Pour plus de détails sur VCl₃ dans la préparation du test HCl, reportez-vous aux travaux publiés précédemment^37,41.

ATTENTION : Le CLD sera endommagé si le piège NaOH n’est pas correctement en place lors de l’exécution de ce test. Cela est dû à la corrosivité du HCl.

1. Préparer des solutions étalons de NO₃^- pour la courbe standard
   1. Dissoudre 85 mg de NaNO₃ dans 10 mL de ddH2 Opour obtenir 0,1 M de NaNO₃^- (cette solution reste stable pendant quelques semaines).
   2. Utiliser la solution mère pour préparer des étalons par dilution dans ddH₂O afin d’obtenir des concentrations de 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO₃ afin d’effectuer une courbe d’étalonnage pour les échantillons de plasma ou d’urine (utilisez des concentrations plus faibles si vous travaillez avec des cultures cellulaires).
2. Préparer la solution saturée VCl₃ (chlorure de vanadium) pour la réduction du NO₃ ^dans le récipient de purge
   ATTENTION : La réaction de l’eau et du VCl₃ est exothermique. Faites attention à la température élevée de la verrerie lors de l’ajout d’acide et lors du rinçage de la verrerie à la fin de l’expérience.
   1. Dissoudre 1,6 g de VCl₃ dans 200 mL de 1 M HCl en ajoutant d’abord VCl₃ dans une fiole propre puis en ajoutant 200 mL de 1 M HCl.
   2. Filtrer la solution sous vide à travers du papier filtre (comme du papier filtre de 11 μm, mais n’importe quel papier filtre peut être utilisé).
      REMARQUE: La solution filtrée doit virer au bleu clair, tandis que la solution VCl₃ non filtrée est brune à cause des particules non dissoutes.
   3. Gardez la solution saturée recouverte de papier d’aluminium ou de ruban de polytétrafluoroéthylène (PTFE) car le composé est sensible à la lumière.
3. Préparer le bain-marie circulant
   1. Connectez un dispositif de bain d’eau circulant à la veste d’eau du récipient de purge. Assurez-vous que les lignes sont sèches avant l’amorçage.
   2. Commencez le bain-marie à 95 °C et vérifiez l’absence de fuites sur les conduites d’eau en appliquant des serviettes en papier (non adhérentes) autour des lignes.
4. Installez le piège à bulles de gaz
   1. Vérifiez que le manchon en PTFE du barboteur est en place et qu’il n’est pas endommagé.
   2. Ouvrez le barboteur à gaz et injectez 15 mL de NaOH de 1 M dans la base du barboteur.
   3. Repositionnez le barboteur à gaz et scellez hermétiquement la connexion en appuyant sur le bas vers le haut et en tordant légèrement les deux parties. L’impossibilité de tourner le haut du barboteur sans appliquer de force indique un joint correct.
   4. Connectez la sortie du récipient de purge à l’entrée du piège à bulles de gaz.

4. I₃^- dans la préparation de dosage de l’acide acétique

REMARQUE: Pour plus de détails sur I₃^- dans la préparation de dosage de l’acide acétique, se référer aux travaux précédemment publiés 15,22,38,41,42.

1. Préparer la courbe standard pour NO₂^-
   1. Préparer une solution mère en dissolvant 69 mg de nitrite de sodium (NaNO₂) dans 10 mL de ddH₂O pour obtenir une solution de 100 mM. Cette solution est stable si elle est stockée dans un récipient hermétique, réfrigérée et protégée de la lumière.
   2. Diluer en série la solution mère dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL prérempli de 900 μL de ddH₂O : Ajouter 100 μL de la solution mère au premier tube de centrifugeuse, mélanger, étiqueter et utiliser 100 μL du tube pour le deuxième tube, puis répéter pour obtenir 10 mM, 1 mM, puis 100 μM.
   3. Diluer davantage avec ddH₂O pour obtenir 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM et 500 nM NaNO₂ aliquotes à utiliser dans la courbe d’étalonnage.
2. Préparer l’acide acétique I₃^- dans le récipient de purge (peut être conservé à température ambiante (RT) pendant 1 semaine)²²
   1. Ajouter 2 g d’iodure de potassium (KI) et 1,3 g d’iode (_I2) à 40 mL de ddH₂O et 140 mL d’acide acétique.
   2. Bien mélanger en remuant le mélange pendant au moins 30 min.
3. Préparer les échantillons pour la détermination différentielle des complexes NO₂^-, S-nitrosothiols (S-NO-Hb, si Hb est prélevé) et fer-nitrosyle (Hb-NO si Hb est collecté) (Figure 3)
   1. Diviser chaque échantillon en 3 aliquotes de 270 μL (900 μL d’Hb si l’on mesure S-NO-Hb et Hb-NO) dans des tubes de microcentrifugation à protection contre la lumière, 2 d’entre eux préremplis de 30 μL de 1x PBS (100 μL si mesure S-NO-Hb et Hb-NO) et le troisième tube avec 30 μL de HgCl₂ (100 μL si l’on mesure S-NO-Hb et Hb-NO), vortex et incubation à RT pendant 2 min (Figure 3).
   2. Ajouter 30 μL de 5 % AS à l’échantillon avec HgCl₂ pour mesurer les Fe-NOs, (100 μL pour Hb-NO) et à un avec PBS ajouté pour mesurer les S-NOs et Fe-NOs (100 μL pour S-NO-Hb et Hb-NO) et ajouter 30 μL de PBS au troisième déjà pré-rempli avec 1x PBS pour mesurer NO₂^-, S-NOs et Fe-NOs (100 μL pour le NO₂^- résiduel de la collecte hb, S-NO et Hb-NO). Vortex et incubation à RT pendant 3 min (Figure 3).

5. AUCUNE consommation par configuration Hb sans cellule

REMARQUE: Pour plus de détails, reportez-vous à l’ouvrage³⁸ publié précédemment.

1. Préparer des solutions d’oxyHb standard à partir d’une solution mère purifiée d’Hb avec une concentration connue
   1. Diluer en série la solution mère dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL par addition de ddH₂O pour obtenir les solutions qui seront utilisées pour la courbe d’étalonnage : 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
2. Préparer la solution DETA-NONOate
   1. Ajouter 10 mg de DETA-NONOate à 610 μL de 10 μM de NaOH dans un pH de 7,4 PBS pour générer 100 mM de DETA-NONOate et le maintenir sur la glace.

6. Démarrez le détecteur de chimiluminescence (CLD) et préparez le récipient de purge

REMARQUE: Pour la préparation du récipient de purge, reportez-vous à l’ouvrage⁴³ publié précédemment.

1. Vérifiez les connexions principales vers et depuis le CLD
   1. Connectez la conduite d’oxygène au CLD et ouvrez le réservoir d’oxygène à une pression convenue avec le fabricant du CLD.
   2. Assurez-vous que la ligne de filtre diélectrique à champ intense (IFD) est connectée au CLD, mais pas au récipient de purge ou au piège NaOH
2. Démarrer le CLD
   1. Sur l’interface CLD, commencez à exécuter le programme de détection pour les tests en phase liquide.
   2. Vérifiez que l’apport en oxygène est adéquat. Si tel est le cas, le CLD commencera avec succès l’échantillonnage à partir de son entrée et indiquera la détection par un signal en millivolts (0-5 mV). Sinon, le CLD déclenchera un signal de diagnostic négatif.
3. Préparer le récipient de purge
   1. Fermez le récipient de purge sur les trois orifices: vissez complètement la vanne à aiguille vers la droite, fermez les robinets d’arrêt d’entrée et de sortie.
   2. Retirer le bouchon du récipient de purge et ajouter une quantité suffisante du réactif spécifique au dosage prévu dans la chambre de réaction (tableau 1) afin que l’aiguille de la seringue utilisée pour injecter les échantillons puisse atteindre la colonne de liquide.
   3. Vérifiez la présence d’une valeur de référence souhaitée stable (tableau 1).
4. Démarrer le flux de gaz de purge
   1. Assurez-vous que le réservoir de gaz inerte (p. ex., N₂) est équipé d’un régulateur à deux étages et reliez le réservoir de gaz inerte à l’entrée de gaz du navire.
   2. Ouvrez le gaz avec une pression de sortie au régulateur de 1 à 5 psi, ouvrez l’entrée du récipient de purge et ouvrez lentement la vanne à aiguille du récipient de purge pour permettre l’entrée de gaz. Vérifiez le bouillonnement dans le récipient de purge.
5. Ajuster le débit de gaz
   1. Enregistrez la pression de cellule mesurée par le CLD avec la ligne de filtre IFD en échantillonnant l’air ambiant.
   2. Repositionnez le bouchon sur le récipient de purge, connectez la conduite de filtre IFD au récipient de purge (ou au piège NaOH dans le test VCl₃ dans HCl) et ouvrez la sortie du récipient de purge.
   3. Utilisez la vanne à aiguille pour atteindre la même pression de cellule au niveau CLD que celle enregistrée dans l’air ambiant.

7. Expérience

REMARQUE: Pour plus de détails concernant l’expérience, reportez-vous à l’ouvrage⁴³ publié précédemment.

1. Démarrer le programme d’acquisition du signal de chimiluminescence
   1. Connectez le port série du CLD au port série de l’ordinateur sur lequel le programme d’acquisition a été installé.
   2. Exécutez le programme d’analyse.
   3. Cliquez sur Acquérir, sélectionnez le dossier pour enregistrer le fichier .data, tapez le nom du fichier et cliquez sur Enregistrer.
      REMARQUE: Remarquez le temps d’exécution prédéfini à l’écran, car l’enregistrement s’arrête automatiquement lorsque le temps prédéfini s’écoule. Si nécessaire, la durée d’exécution prédéfinie peut être augmentée.
2. Se préparer à des injections répétées d’échantillons
   1. Ajustez l’échelle de tension à l’écran pour avoir le contrôle sur la ligne de base ciblée en cliquant sur les boutons Minimum et/ou Maximum , puis en entrant la valeur souhaitée.
   2. Avoir un tube de 20 ou 50 mL rempli de ddH₂O pour rincer la seringue entre les échantillons.
   3. Ayez une boîte de lingettes de tâches délicates facilement disponibles.
3. Injection d’échantillons
   REMARQUE: Commencez par les solutions étalons pour la courbe d’étalonnage (injectez des échantillons les moins concentrés aux échantillons les plus concentrés), puis passez aux échantillons expérimentaux (envisagez de le faire en double ou en trois exemplaires).
   1. Rincez la seringue au moins deux fois ou plus avec du ddH₂O avant de prélever chaque échantillon (et après chaque injection) et vérifiez chaque fois l’éjection d’eau non obstruée sur une lingette de travail.
   2. Insérez la seringue dans le tube d’échantillonnage tout en tenant la seringue et le tube à une distance rapprochée, tirez le piston jusqu’au volume souhaité tout en vous assurant qu’aucune bulle d’air et/ou pièces solides non homogénéisées ne sont piégées.
   3. Nettoyez l’extrémité de la seringue à l’aide d’un essuie-glace, puis insérez la seringue dans le capuchon septa à l’orifice d’injection et injectez après avoir vérifié que l’extrémité de la seringue se trouve dans la phase liquide dans la chambre de réaction.
4. Marquez l’injection dans le logiciel et attendez
   1. Vérifiez que l’injection provoque un changement vers le haut du signal (figure supplémentaire 1) (vers le bas dans la consommation de NO par essai Hb sans cellule) et tapez le nom de l’échantillon en cliquant sur la case grise sous Noms des échantillons, puis cliquez sur Marquer l’injection.
      REMARQUE: Suspicion d’obstruction de la seringue si l’injection de l’échantillon ne génère pas de signal.
   2. Attendez que le signal électrique atteigne à nouveau la ligne de base (cela prend généralement 3-4 min). Ce temps peut être utilisé pour effectuer l’étape 7.3.1.
5. Répétez toutes les étapes indiquées aux étapes 7.3 et 7.4 pendant et après chaque injection jusqu’à la fin de l’expérience. N’oubliez pas d’exécuter un échantillon de la solution de conservation (si elle est utilisée)
6. Arrêter l’expérience
   1. Cliquez sur STOP pour interrompre l’acquisition du signal, arrêtez le CLD et éteignez le bain-marie (si le NO₃^- est mesuré).
   2. Interrompez le flux de gaz, ouvrez la vanne à aiguille, retirez le bouchon du récipient de purge, placez un conteneur à déchets sous le drain et ouvrez le robinet d’arrêt de vidange.
      REMARQUE: Si l’expérience nécessite une acquisition de données de plus de 60 minutes, il est nécessaire de redémarrer l’acquisition après 60 minutes d’exécution (répétez l’étape 7.1.3) et de créer un nouveau fichier.

8. Mesures et calculs

REMARQUE: Les mesures et les calculs sont effectués hors ligne et peuvent être effectués à un moment différent.

1. Démarrer le programme d’acquisition de chimiluminescence pour l’analyse de données hors ligne
   1. Démarrez le programme et cliquez sur Processus.
   2. Sélectionnez le fichier d’expérience, puis cliquez sur Ouvrir.
2. Calculer l’aire sous la courbe pour chaque administration
   1. Le logiciel affiche automatiquement à l’écran la ligne de base (figure supplémentaire 2A, ligne jaune horizontale) et l’axe de crête de chaque onde générée par chaque administration d’échantillon (lignes jaunes verticales) : vérifiez leur position correcte (ou ajustez-la en cliquant sur chaque ligne et en la déplaçant avec la souris ou les flèches) et cliquez sur Seuil OK (figure supplémentaire 2B).
      REMARQUE: Dans le test de mesure de la consommation de NO par Hb sans cellule, le logiciel ne parvient généralement pas à capturer correctement la forme d’onde générée par l’injection d’échantillon. En zoomant sur chaque forme d’onde, l’opérateur peut facilement assister le logiciel dans le calcul de la surface (Figure supplémentaire 2).
   2. Le logiciel trace automatiquement le début (ligne verte verticale) et la fin (ligne rouge verticale) de chaque pic causé par chaque administration d’échantillon: vérifiez leur position correcte (ou ajustez en cliquant sur chaque ligne et en la déplaçant avec la souris ou les flèches) et cliquez sur Intégrer (Figure supplémentaire 2C).
      REMARQUE: Certaines zones de la trace peuvent être définies à tort comme des injections à ce stade, et certains pics peuvent être automatiquement comptés deux fois. Les deux erreurs peuvent être réidentifiées et supprimées à l’étape 8.2.2
   3. Le logiciel fait automatiquement correspondre chaque zone de signal suite à une injection marquée pendant l’expérience et son nom attribué : naviguez dans chaque pic (indiqué par une ligne verticale jaune) avec le nom attribué en cliquant sur Pic suivant et Pic précédent, puis cliquez sur le bouton Tout OK pour enfin obtenir le calcul pour toutes les zones à l’écran.
   4. Afin de corriger toutes les erreurs de dénomination ou de correspondance commises par l’utilisateur ou par le programme, utilisez au besoin les boutons indiqués dans le fichier supplémentaire 1.
3. Transférer les valeurs de la courbe d’étalonnage dans une feuille de calcul et générer une équation de régression linéaire (figure supplémentaire 3)
   1. Transférez les données du programme CLD vers une nouvelle feuille de calcul par copier-coller. Organisez les deux colonnes de la feuille de données en tant que Concentration d’échantillon et Aire sous la courbe, puis ajoutez une valeur correspondante de zéro sur les deux colonnes.
   2. Sélectionnez les deux colonnes, cliquez sur Insérer > Scatter, puis sous le menu Création de graphique , sélectionnez Ajouter un élément de graphique > courbe de tendance > linéaire.
   3. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur la courbe de tendance générée, cliquez sur Format de la courbe de tendance, puis cliquez sur les options Afficher les équations sur le graphique et Afficher la valeur R au carré sur le graphique dans le menu Format de la courbe de tendance pour obtenir une équation d’étalonnage linéaire simple.
4. Transférer la surface calculée de chaque échantillon pour calculer sa concentration (figure supplémentaire 3)
   1. Signalez chaque valeur sur la feuille de calcul. Dans la colonne suivante, appliquez l’équation obtenue à partir de l’étape 8.3.3 pour obtenir la concentration de chaque échantillon injecté, où y est la concentration (valeur de la nouvelle colonne) et x est l’aire sous la courbe mesurée après injection.
      NOTE: N’oubliez pas de prendre en compte la concentration mesurée dans la solution de conservation (si elle est utilisée) et de soustraire les valeurs en conséquence.

Résultats

La consommation de NO par dosage de l’Hb sans cellules a été utilisée dans des échantillons contenant des concentrations connues d’oxyHb sans cellules (figure 4). Comme un hème d’oxyHb libère stœchiométriquement une molécule de NO dans le test, l’oxyHb purifié sans cellule est utilisé pour construire la courbe d’étalonnage pour le test (figure supplémentaire 3).

La relation dose-réponse entre l’Hb sans cellules (mesurée ...

Discussion

En raison de la sensibilité élevée, les tests à base de chimiluminescence pour la détermination du NO et des composés apparentés présentent un risque élevé ^{de contamination par} le NO₂. Chaque réactif (en particulier la ^{solution bloquant le} NO₂) et chaque diluant (y compris le ddH₂O) utilisé dans l’expérience doivent être testés pour sa teneur en NO₂^- afin de corriger le signal de fond. Le nitrite est extrêmement réactif avec u...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL - liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL - liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g - solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g - crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g - solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155