Ensaios baseados em chemiluminescência para detecção de óxido nítrico e seus derivados de Autoxidação e Compostos Nitrosated

Resumo

Aqui, apresentamos protocolos para detectar óxido nítrico e seus derivados biologicamente relevantes usando ensaios baseados em chemiluminescência com alta sensibilidade.

Resumo

A atividade de óxido nítrico (NO) in vivo é o resultado combinado de seus efeitos diretos, a ação de seus derivados gerados a partir da autoxidação no no, e os efeitos dos compostos nitrosos. Medir metabólitos NO é essencial para estudar nenhuma atividade tanto em níveis vasculares quanto em outros tecidos, especialmente nos ambientes experimentais onde o NO exógeno é administrado. Os ensaios de chemiluminescência à base de ozônio permitem medições precisas de metabólitos NO e NO em ambos os fluidos (incluindo plasma, homogeneizadores de tecido, culturas celulares) e misturas de gás (por exemplo, respiração exalada). NÃO reage com ozônio para gerar dióxido de nitrogênio em um estado animado. A consequente emissão de luz permite a fotodetecção e a geração de um sinal elétrico refletindo o teor NO da amostra. Alíquotas da mesma amostra podem ser usadas para medir metabólitos não específicos, como nitrato, nitrito, S-nitrosothiols e complexos ferro-nitrosilo. Além disso, o NO consumido pela hemoglobina livre de células também é quantificado com a análise de quimiluminescência. Uma ilustração de todas essas técnicas é fornecida.

Introdução

Desde que Os ganhadores do Salvador Moncada e do Nobel Robert Furchgott, Louis Ignarro e Ferid Murad identificaram o óxido nítrico (NO) como o anteriormente conhecido fator de relaxamento derivado da endotelia (EDRF), o papel central do NO foi estabelecido em vários mecanismos-chave que abrangem toda a biologia vascular, neurociências, metabolismo e resposta ao hospedeiro 1,2,3,4,5,6,7 . A administração exógena do GÁS NO tornou-se um tratamento estabelecido para insuficiência respiratória devido à hipertensão pulmonar no recém-nascido⁸. O gás óxido nítrico também tem sido investigado para o tratamento da infecção pelo vírus sincicial respiratório (RSV), malária e outras doenças infecciosas, lesão de isquemia-reperfusão e para prevenção de lesão renal aguda em pacientes submetidos à cirurgia cardíaca 9,10,11,12. A necessidade de técnicas precisas de medição para avaliar os níveis de NO, seus metabólitos e os de suas proteínas e compostos-alvo surge tanto de estudos mecanicistas quanto intervencionistas.

Devido à sua alta reatividade, a NO pode sofrer reações diferentes dependendo da matriz biológica em que é produzida e/ou liberada. Na ausência de hemoglobina (Hb) ou outras hemoproteínas de oxi, a NO é oxidada quase completamente ao nitrito (NO₂^-).

2NO + O₂ → 2NO₂

NO₂ + NO → N₂O₃

N₂O₃ + H₂O → NO₂^- + H⁺

O NO primeiro sofre autoxidação com oxigênio molecular (O₂) para produzir dióxido de nitrogênio (NO₂) e reage com o próprio NO₂ para gerar trióxido de dinitrogen (N₂O₃). Uma molécula de N₂O₃ reage com água (H₂O) para formar duas moléculas de NO₂^- e um próton (H⁺)¹³. Dentro de sangue inteiro^14,15, NO e NO₂^- são rapidamente convertidos em nitrato (NO₃^-) como essas moléculas reagem avidamente com os grupos de heme oxidado de Hb [Hb-Fe²⁺-O₂ ou oximosoglobina (oxicodona)] para produzir NO₃^-. Esta reação é associada à transição do grupo heme para o estado férrico [Hb-Fe³⁺ ou methemoglobina (metHb)]:

HB-Fe²⁺-O₂ + NO → Hb-Fe³⁺ + NO₃^-

A barreira das células vermelhas do sangue (RBC) e o espaço imediatamente adjacente ao endotélio são os principais fatores que limitam essa reação e permitem que uma pequena porção do NO liberada pelo endotélio atue como EDRF^16,17. Na verdade, o Hb livre de células na circulação é conhecido por interromper a vasodilatação em ambientes experimentais e clínicos^17,18. Dentro da RBC, dependendo da oxigenação ^{e da concentração} NO₂, uma porção de NO reage com desoxihemoglobina (Hb-Fe²⁺) para formar ferro-nitrosol Hb (Hb-Fe²⁺-NO ou HbNO):

HB-Fe²⁺ + NO → Hb-Fe²⁺-NO

Na RBC^15,17, o NO₂^- pode formar o Hb-Fe³⁺ reduzindo o Hb-Fe²⁺ levando ao lançamento do NO, que por sua vez liga o Hb-Fe²⁺-O₂ (preferencialmente) ou o Hb-Fe²⁺.

A geração de no-derivados não deve ser considerada estritamente unidirecional, pois o NO pode ser regenerado a partir de NO₂^- e NO₃^- em vários tecidos e por diferentes enzimas (por exemplo, por bactérias intestinais ou dentro das mitocôndrias, particularmente sob condições hipoxicas)^19,20.

Uma quantidade variável de NO produzido (ou administrado) leva à geração a jusante de S-nitrosothiols, principalmente por transinrose de thiol a partir de N₂O₃ na presença de um nucleófilo criando um intermediário doador NO⁺ (Nuc-NO⁺-NO₂^-):

N₂O₃ + RS^- → RS-NO + NO₂^-

Outra possibilidade para a geração de S-nitrosothiols é a nitrosiagem de tiais oxidados (NÃO reage com um tiol oxidado):

RS• + NO → RS-NO

Este mecanismo e oxidação direta de thiol pelo NO₂ só podem ser possíveis em condições muito específicas que são descritas em outros lugares²¹. Os s-nitrosothiols variam de moléculas leves como S-nitrosoglutathione a grandes proteínas que contêm tiol. A s-nitrosohemoglobina (S-NO-Hb) é formada por nitrosão de um grupo de tiol de um resíduo de cisteína conservado na cadeia de β (β93C)²².

A geração e o metabolismo dos S-nitrosothiols fazem parte de importantes mecanismos regulatórios. Exemplos incluem regulação de glutathione, caspases, N-metil-D-Aspartato (NMDA) e receptores de ryanodo 23,24,25,26,27,28. Anteriormente considerado como um grande mediador da NO biology in vivo, a albumina nitrosa (S-nitroso-albumina) parece ser um transportador NO/NO⁺ sem qualquer atividade biológica adicional específica²⁹.

Ao medir a concentração de NO e seus derivados de uma amostra biológica específica dentro de uma matriz biológica, é importante considerar características como acidez, oxigenação, temperatura e presença de reagentes. Exemplos incluem doadores exógenos administrados NO e, no cenário de inflamação aguda, peróxido de hidrogênio (H₂O₂) reagindo com o NO₂ levando à geração de concentração supernormal de radicais livres como a peroxitorita (ONOO^-)²¹. Além do método analítico que é empregado, a fase pré-analítica da preparação e armazenamento da amostra é fundamental. Reações a jusante que não representam a atividade in vivo NO devem ser previstas, consideradas e bloqueadas. Um exemplo válido é a instabilidade do S-NO-Hb, que exige um tratamento dedicado de amostras de sangue quando é direcionado para a medição²².

Ensaios baseados em chemiluminescência são o padrão-ouro para detectar os níveis de NO e seus principais metabólitos [NO₂^-, NO₃^-, S-NO e complexos ferro-nitrosol (Fe-NO)] em qualquer fluido biológico, incluindo homogeneiza tecidos^30,31. Esses métodos dependem do detector de chemiluminescência (CLD), um dispositivo que abriga a reação de NO com ozônio (O₃), gerando o Nº₂ em estado animado (NO₂•). Relaxamento do NO₂• causa emissão de um fóton de luz detectado por um tubo fotomultiplier, gerando um sinal elétrico diretamente proporcional ao teor NO da mistura de gás amostrado³². Um esquema simplificado do CLD está representado.

Figura 1: Esquema simplificado de um detector de quimiluminescência para gás óxido nítrico. A detecção baseada em óxido nítrico (NO) é a geração estequiométrica de uma molécula de gás NO que é introduzida no detector de quimiominascência (CID). A reação de chemiluminescência é obtida em uma câmara designada fornecida com ozônio (O3) de um gerador interno, que é mantida em pressão negativa por conexão com uma bomba externa, permitindo entrada contínua e constante de gás amostral. A geração de O₃ requer oxigênio diatômico (O₂) que é fornecido por um tanque O₂ dedicado conectado com o CLD (outros fabricantes fornecem CLDs operando com ar ambiente). Dentro da câmara de reação, cada molécula de gás NO contido no gás amostrado reage com oxigênio para produzir uma molécula de dióxido de nitrogênio no estado ativado (NO₂*). Ao retornar ao seu estado terrestre, cada molécula NO₂* emite um fóton que é detectado por um tubo fotomultiplier (PMT) localizado ao lado da câmara de reação. O TPM com o amplificador associado e unidade de processamento central produz um sinal proporcional à contagem de fótons e ao número de nenhuma molécula na câmara de reação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A entrada amostral do CLD pode ser conectada a um sistema de vidro contendo uma câmara de reação para amostras líquidas. O sistema é continuamente purgado com um gás inerte como nitrogênio, hélio ou argônio, transferindo NÃO da câmara de reação para o CLD. Amostras de fase líquida são injetadas através de uma membrana dedicada no vaso de purga.

Figura 2: Estrutura de um vaso de purga para detecção baseada em óxido nítrico à base de quimiotrica O vaso de purga (à direita) permite a detecção de gás óxido nítrico (NO) ou qualquer outro composto que possa ser facilmente convertido em nenhum gás quando liberado de um reagente de fase líquida. A entrada de gás inerte está conectada a uma fonte (tanque) de um gás inerte como Argon, Xeon ou nitrogênio diatômico (N₂). A válvula da agulha (abre à esquerda) é usada para controle de pressão dentro do vaso de purga e pode ser completamente removida para limpar o vaso. A porta de injeção é coberta por uma tampa com um septo de membrana para injeção de amostra. A membrana deve ser substituída com frequência. Uma jaqueta aquecida envolve a câmara de reação e é conectada a um banho de água quente para realizar o teste VCl₃ em HCl. A saída do vaso de purgação está conectada ao detector de quimiominascência (CLD) ou à armadilha NaOH (necessária para vcl₃ em ensaios HCl). Para drenar o conteúdo da câmara de reação, primeiro feche as torneiras na entrada de gás inerte e a saída do vaso de purga, feche a válvula da agulha, remova a tampa no porta de injeção e, finalmente, abra a torneira no ralo. A armadilha NaOH (esquerda) é necessária para ser colocada em linha entre o vaso de purga e o CLD se o ensaio VCl₃ em HCl for realizado devido à corrosão do HCL. A conexão com o CLD sempre requer um filtro de campo intenso (IFD) a ser colocado entre o CLD e a saída do vaso de purga (ou a armadilha NaOH, se usado). O filtro IFD remove partículas aéreas e impede que o líquido passe pelo vaso de purga. PTFE = politetrafluoroetileno. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como consequência, qualquer composto que possa ser convertido em NÃO através de uma reação química específica e controlada pode ser detectado com alta sensibilidade em qualquer fluido biológico e homogeneizar tecido²⁴. A medição direta da fase de gás NO através da chemiluminescência é realizada tanto em ambientes experimentais quanto clínicos. Essas técnicas são amplamente descritas em outros lugares 33,34,35. A medição de NO₂^-, S-nitrosothiols, proteínas S-nitrosated e Fe-NOs pode ser realizada adicionando amostras em uma mistura de reação com triiodeto (I₃^-), que não libera gás estelioetricamente de todos esses compostos:

I₃^- → I₂ + I^-

2NO₂⁻ +2I⁻ +4H⁺ → 2NO + I₂ +2H₂O

I₃⁻ + 2RS-NO → 3I⁻ + RSSR + 2NO⁺

2NO⁺ + 2I⁻ → 2NO + I₂

enquanto eu₃^- não reage com o NO ^3-15. Medições precisas de cada composto são possíveis pelo pré-tratamento de alíquotas amostrais com sulfanilamida acidificada (AS) com ou sem cloreto mercúrico (HgCl₂). Especificamente, o pré-tratamento com AS remove todo ^{o conteúdo NO} ₂. Como consequência, o conteúdo NO medido pelo CLD reflete apenas a soma da concentração de S-NOs e Fe-NOs. A injeção de HgCl₂ em uma alíquota de amostra antes da injeção de AS faz com que o NO₂^- seja liberado pelo S-NO. O tratamento com AS (levando ^{à remoção} nº₂) garante que o teor de NÃO medido só reflete a concentração de Fe-NOs. Uma série de subtrações entre as avaliações permitem calcular a concentração precisa dos três derivados NO²².

Figura 3: Etapas na preparação da amostra para o ensaio i₃^- em ácido acético quemiluminescence. Os passos sequenciais para a preparação do ensaio i₃^- em ácido acético chemiluminescence são ilustrados. É necessário o uso de tubos de centrífuga protegidos pela luz. Os tubos 1, 2 e 3 são os usados para se preparar para o ensaio. Outra alíquota de amostra (tubo 4) é necessária para o ensaio VCl₃ em HCl se for necessária a medição do nitrato (NO₃^-). As etapas são indicadas por números em vermelho. Pré-preenchimento (Passo 1) conforme indicado com soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) ou HgCl₂ antes de adicionar o volume amostral. Adicione o volume amostral (2) conforme indicado, vórtice e incubar por 2 minutos à temperatura ambiente (RT). Adicionar (3) PBS ou sulfanilamida acidificada (AS) conforme indicado,vórtice e incubar por 3 min no RT. Execute o ensaio (4). A concentração medida pelo ensaio é a soma da concentração dos compostos relatados sob cada tubo. O tubo número 1 permitirá medições de nitrito (NO₂^-), S-nitrosothiols (S-NO) e complexos ferro-nitrosilo (Fe-NOs) como um único sinal. Para a medição do nitrato (NO₃^-), as amostras devem ser executadas com i₃^- em ácido acético e VCl₃ em ensaios de HCl, e o valor obtido a partir do tubo 1 deve ser subtraído do obtido do tubo 4. *Quantidades sugeridas a serem utilizadas para análise de Hb para determinação de resíduos NO₂^-, S-nitrosohemoglobina e ferro-nitrosibina-hemoglobina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para ^{a medição} Nº₃, o cloreto de vanádio (III) (VCl₃) em ácido clorídrico (HCl) é usado para conversão de NO₃^- a NO no vaso de purga, a fim de medir o nº₃^- estequiometricalmente com o CLD:

2 NO₃^-+ 3V⁺³ + 2H₂O → 2NO + 3VO₂⁺ + 4H⁺

Para conseguir uma conversão suficientemente rápida, a reação precisa ser realizada a 90-95 °C. A redução de NO₃^- para NO₂^- é associada à redução de NO₂^- para NO por HCl. O metal vanadium também reduz os S-NOs liberando seu NO moiety^22,36. A concentração final obtida pelo CLD com VCl₃ em HCl reflete a concentração agregada de NO₃^-, NO₂ e outros compostos nitrosados. A subtração do último valor da concentração rendeda com CLD com I₃^- permite o cálculo de Nº₃^- concentração^36,37 (Figura 3).

No ensaio de consumo NO, a liberação contínua de NÃO no recipiente de purga por NENHUM doador como (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-N-(2-ammonioethyl)amino]diazen-1-ium-1,2-diolato (DETA-NONOato) gera um sinal estável permitindo quantificar oxiHb sem células nas amostras injetadas. A quantidade de NÃO consumida no vaso de purga está em uma relação estequiométrica com a quantidade de oxicodona na amostra³⁸.

Protocolos para medição de NO₂^-, NO₃^-, S-nitrosothiols, complexos ferro-nitrosilo e NO consumo por Hb livre de células em amostras de plasma são ilustrados. Estudos sobre NÃO no ambiente RBC requerem tratamento amostral específico seguido de cromatografia de exclusão para medir s-no-hb e hb-no extremamente frágeis, juntamente com a determinação da concentração total de Hb^15,22. A preparação da amostra é fundamental na correção da medição. A pré-existência do NO₂^- em H₂O e liberação do Nº₂^- durante o ensaio pode levar à medição de concentrações artificialmente maiores de nenhum derivado, como o S-NO-Hb^14,39. Aspectos importantes da preparação da amostra também são apresentados.

Protocolo

Os procedimentos indicados neste protocolo estão de acordo com o conselho de revisão do Hospital Geral de Massachusetts. As amostras de sangue utilizadas foram coletadas durante um estudo anterior e foram desidentifidas para a finalidade atual¹⁸.

NOTA: Consulte as instruções do fabricante para obter orientações específicas sobre as conexões ideais entre tubos e vidros que constituem o vaso de purga, a lavagem e a manutenção geral. As conexões precisam ser firmes e cuidadosamente feitas para não danificar os vidros. Identifique os componentes do vaso de purga de vidro: linha de entrada de gás, vaso de purga com jaqueta de aquecimento e condensador, armadilha de bolha de gás de hidróxido de sódio (NaOH), linha de conexão entre o vaso de purga e o borbulhador, linha de gás de saída de purga (para CLD) dotada de um filtro dieletrico de campo intenso (IFD). Uma linha de filtro IFD entre o vaso de purga e a entrada amostral do CLD deve estar no lugar toda vez que não metabólitos em forma líquida (plasma, culturas celulares, homogeneizadores teciduais) (todos os ensaios apresentados no protocolo). A preparação da amostra depende do fluido ou tecido analisado e dos compostos de interesse. Aspectos importantes da fase pré-analítica são abordados nas seções 1 e 2. As etapas específicas de preparação para ensaios específicos estão incluídas nas seções 3-5. As seções 6-8 aplicam-se a todos os ensaios.

1. Preparação de reagentes dedicados

NOTA: Para mais detalhes, consulte as publicações anteriores^15,22.

1. Prepare 5% (290 mM) solução de sulfanilamida acidificada (AS) ^{para remoção} nº₂, dissolvendo 500 mg de sulfanilamida em 10 mL de 1N HCl. Esta solução está estável há meses.
2. Prepare a solução de cloreto mercurico de 50 mM (HgCl₂) para o NO₂^- liberação de S-NOs dissolvendo 67,9 mgs de HgCl₂ em 5 mL de PBS. Proteja a solução de estoque da luz.
3. Prepare a solução ^{de bloqueio NO} ₂ com ferricyanida de 800 mM [K₃Fe(CN)₆] para oxidar hb juntamente com 100 mM N-ethylmaleimida (NEM) para bloquear grupos de tiol e (OPCIONAL) solução glicol não-fenil-polietileno (Nonidet p-40) para solubilizar membranas celulares vermelhas.
   1. Adicione K₃Fe(CN)₆ à água desionizada e destilada (ddH₂O, 263,5 g de pó por litro) para obter uma concentração final de 800 mM.
   2. Adicione NEM aos 800 mM K₃Fe(CN)₆ na solução ddH₂O (12,5 g de pó por litro para ter concentração de 100 mM) e misture a solução para dissolver todos os cristais.
   3. Adicione uma parte de 10% NP-40 a nove partes da solução NEM K₃Fe(CN) ₆ 100 mM NEM (111 mL por litro) e misture bem (passo obrigatório para análise de sangue integral).
4. Prepare a solução de estabilização S-NO-Hb contendo 12 mM K₃Fe(CN)₆, 10 mM NEM, 100 μM de ácido dietilenetriaminepentaactic (DTPA, para quelação metálica) e 1% de detergente nãoidet p-40 de suas soluções de estoque.
   1. Prepare uma solução NEM de 200 mM adicionando cristais NEM ao PBS (25 mg/mL, por exemplo, 250 mgs em PBS de 10 mL) e misture a solução até que todos os cristais sejam dissolvidos (a ser feito no dia do experimento).
   2. Prepare uma solução de 800 mM K₃Fe(CN)₆ adicionando K₃Fe(CN)₆ a ddH₂O (263,5 mg/mL, por exemplo, 1,32 g em 5 mL de ddH₂O para obter concentração final de 800 mM) (a ser feita no dia do experimento).
   3. Prepare uma solução de estoque DTPA de 10 mM adicionando 786 mg de DTPA a 200 mL de ddH₂O e ajuste pH para 7.0 com 5N NaOH para solubilizar totalmente o DTPA.
   4. Adicione 5 mL de solução NEM de 200 mM, 1,5 mL de solução 800 mM K₃Fe(CN)₆ e 1 mL de solução de estoque DTPA para 81,5 mL de PBS a 7,2 pH e, finalmente, adicione 11 mL de 10% NP-40 finalmente para trazer volume final a 7,2 mL.

2. Coleta de amostras

NOTA: Para obter mais detalhes sobre a coleta de amostras, consulte as obras publicadas anteriormente 15,22,40.

1. Coletar sangue inteiro
   1. Coletar sangue em tubos revestidos de heparina preferindo venoso sobre vaso arterial (a menos que especificamente necessário) e preferindo a colocação do cateter em vez de venipuntura (se possível) com cateter ou furo de agulha de pelo menos 20 G ou maior para minimizar a hemólise.
   2. Adicione imediatamente a solução ^{de bloqueio NO} ₂ (1 parte da solução para 4 partes de sangue inteiro), processe (seções 3 ou 4) ou congele e armazene a -80 °C.
2. Coletar plasma e glóbulos vermelhos (RBCs)
   1. Coletar sangue em tubos revestidos de heparina que preferem sangue venoso em vez de sangue arterial (a menos que especificamente necessário) e agulhas de pelo menos 20 G ou maiores para minimizar a hemolise e centrífuga imediatamente por 5 min a 4000 x g a 4 °C.
   2. Misture o supernatante (plasma) com a solução ^{de bloqueio NO} ₂ (1 parte da solução para 4 partes do supernatante) em um novo tubo e processo (seções 3 ou 4), ou congele e armazene a -80 °C.
      NOTA: Para o ensaio de não consumo, a solução ^{de bloqueio NO} ₂ não pode ser utilizada. O ensaio pode ser realizado sem pré-tratamento de plasma.
   3. Resuspende a pelota RBC de baixo para um novo tubo pré-preenchido com solução de estabilização S-NO (ver passo 1.4) (1 mL de pelota a 9 mL de solução) e incubar por 5 min.
   4. Passe o lise RBC em uma coluna de dimensionamento com polímero sephadex G-25 que foi previamente enxaguado com ddH₂O para cromatografia de exclusão
   5. Colete a fração hb para processar (seção 4) e para medir a concentração de Hb usando o reagente de Drabkin (para medição de Hb, consulte o trabalho publicado anteriormente²²).
      NOTA: Para preparar e provar um tecido/órgão específico, identifique seu hilum e isole-o cirurgicamente. Incisar a veia, perfurar a artéria e injetar soro fisiológico heparinizado (10 U/mL) através da artéria. Extirpara o tecido quando a solução salina começar a retrofluir na incisão venosa. Homogeneize o tecido com um homogeneizador mecânico ao adicionar 1 parte da solução ^{de bloqueio NO} ₂ a 4 partes do tecido homogeneizado.

3. VCl₃ na preparação do ensaio HCl

NOTA: Para obter mais detalhes sobre a preparação do ensaio de VCl₃ no HCl, consulte os trabalhos publicados anteriormente^37,41.

ATENÇÃO: O CLD será danificado se a armadilha NaOH não estiver corretamente no lugar ao realizar este ensaio. Isso é devido à corrosão do HCL.

1. Prepare soluções padrão de NO₃^- para curva padrão
   1. Dissolver 85 mg de NaNO₃ em 10 mL de ddH₂O para obter 0,1 M NaNO₃^- (esta solução permanece estável por algumas semanas).
   2. Use a solução de estoque para preparar padrões por diluição em ddH₂O para obter concentrações de 5 μM, 10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM NaNO₃ para realizar uma curva de calibração para amostras de plasma ou urina (use concentrações mais baixas se trabalhar com culturas celulares).
2. Prepare a solução saturada VCl₃ (cloreto de vanádio) ^{para a} redução no_3º no vaso de purga
   ATENÇÃO: A reação da água e do VCl₃ é exotérmica. Preste atenção à alta temperatura do vidro ao adicionar ácido e ao enxaguar os vidros no final do experimento.
   1. Dissolva 1,6 g de VCl₃ em 200 mL de 1 M HCl adicionando primeiro VCl₃ em um frasco limpo e adicionando 200 mL de 1 M HCl.
   2. Filtro de vácuo a solução através de papel filtro (como papel filtro de 11 μm, mas qualquer papel filtro pode ser usado).
      NOTA: A solução filtrada deve tornar-se azul claro, enquanto a solução VCl₃ não filtrada é marrom devido a partículas não resolvidas.
   3. Mantenha a solução saturada coberta com papel alumínio ou fita de politetrafluoroetileno (PTFE), pois o composto é sensível à luz.
3. Prepare o banho de água circulante
   1. Conecte um dispositivo de banho de água circulante à capa de água do vaso de purga. Certifique-se de que as linhas estão secas antes de escorar.
   2. Inicie o banho de água a 95 °C e verifique a ausência de vazamentos nas linhas de água aplicando toalhas de papel (não adesivas) ao redor das linhas.
4. Configure a armadilha do bubbler de gás
   1. Verifique se a manga PTFE do bolha está no lugar e se ela não está danificada.
   2. Abra o bolha de gás e injete 15 mL de 1 M NaOH na base do borbulhante.
   3. Reposicione o bolha de gás e sele firmemente a conexão pressionando a parte inferior em direção ao topo e torcendo ligeiramente as duas partes. A impossibilidade de girar a parte superior do borbulhante sem aplicar força indica um selo correto.
   4. Conecte a saída do recipiente de purga à entrada da armadilha do borbulhante de gás.

4. I₃^- na preparação do ensaio de ácido acético

NOTA: Para mais detalhes sobre i₃^- na preparação do ensaio de ácido acético, consulte os trabalhos publicados anteriormente 15,22,38,41,42.

1. Prepare a curva padrão para o NO₂^-
   1. Prepare uma solução de estoque dissolvendo 69 mg de nitrito de sódio (NaNO₂) em 10 mL de ddH₂O para obter solução de 100 mM. Esta solução é estável se armazenada em um recipiente hermético, refrigerado e protegido contra a luz.
   2. Diluir a solução de estoque em tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL pré-preenchido com 900 μL de ddH₂O: Adicionar 100 μL da solução de estoque ao primeiro tubo de centrífugas, misturar, rotular e usar 100 μL do tubo para o segundo tubo, em seguida, repetir resultando em 10 mM, 1 mM, em seguida, 100 μM.
   3. Diluir ainda mais com alíquotas ddH₂O para obter 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM e 500 nM NaNO₂ alíquotas a serem utilizadas na curva de calibração.
2. Prepare o i₃^- em ácido acético para o vaso de purga (pode ser armazenado à temperatura ambiente (RT) por 1 semana)²²
   1. Adicione 2 g de iodeto de potássio (KI) e 1,3 g de iodo (I₂) a 40 mL de ddH₂O e 140 mL de ácido acético.
   2. Misture bem mexendo a mistura por pelo menos 30 min.
3. Prepare as amostras para a determinação diferencial de no₂^-, S-nitrosothiols (S-NO-Hb, se Hb for coletado) e complexos ferro-nitrosol (Hb-NO se Hb for coletado) (Figura 3)
   1. Divida cada amostra em 3 alíquotas de 270 μL (900 μL de Hb se medir S-NO-Hb e Hb-NO) em tubos de microcentrifuuge protegidos pela luz, 2 deles pré-preenchidos com 30 μL de 1x PBS (100 μL se medir S-NO-Hb e Hb-NO) e o terceiro tubo com 30 μL de HgCl₂ (100 μL se medir S-NO-Hb e Hb-NO), vórtice e incubação em RT por 2 min (Figura 3).
   2. Adicione 30 μL de 5% de AS à amostra com HgCl₂ para medir Fe-NOs, (100 μL para Hb-NO) e para um com PBS adicionado para medir S-NOs e Fe-NOs (100 μL para S-NO-Hb e Hb-NO) e adicionar 30 μL de PBS ao terceiro já pré-preenchido com PBS 1x para medir o NO₂^-, S-NOs e Fe-NOs (100 μL para resíduos NO₂^- da coleção Hb, S-NO e Hb-NO). Vórtice e incubação em RT por 3 min (Figura 3).

5. NO consumo por configuração hb sem células

NOTA: Para mais detalhes, consulte o trabalho publicado anteriormente³⁸.

1. Prepare soluções padrão de oxiHb a partir de uma solução Hb de estoque purificado com uma concentração conhecida
   1. Diluir a solução de estoque em tubos de microcentrífugo de 1,5 mL por adição de ddH₂O para obter as soluções que serão utilizadas para a curva de calibração: 62 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM, 6,25 μM, 3,125 μM, 1,56 μM.
2. Prepare a solução DETA-NONOate
   1. Adicione 10 mg de DETA-NONOate a 610 μL de 10 μM NaOH em pH 7.4 PBS para gerar 100 mM de DETA-NONOate e mantê-lo no gelo.

6. Inicie o detector de quimiluminescência (CLD) e prepare o vaso de purga

NOTA: Para a preparação do vaso de purga, consulte o trabalho publicado anteriormente⁴³.

1. Verifique as principais conexões de e para o CLD
   1. Conecte a linha de oxigênio ao CLD e abra o tanque de oxigênio a uma pressão que esteja de acordo com o fabricante do CLD.
   2. Certifique-se de que a linha de filtro Dielectric intense field (IFD) esteja conectada ao CLD, mas não ao vaso de purga ou à armadilha NaOH
2. Inicie o CLD
   1. Na interface CLD, comece a executar o programa de detecção para ensaios de fase líquida.
   2. Verifique se o suprimento de oxigênio é adequado. Se este for o caso, o CLD começará com sucesso a amostragem a partir de sua entrada e indicará a detecção por um sinal em milivolts (0-5 mV). Caso contrário, o CLD solicitará um sinal de diagnóstico negativo.
3. Prepare o vaso de purga
   1. Feche o recipiente de purga nas três portas: enrosque totalmente a válvula da agulha à direita, feche as torneiras de entrada e saída.
   2. Remova a tampa do vaso de purga e adicione uma quantidade suficiente do reagente específico ao ensaio planejado à câmara de reação (Tabela 1) para que a agulha de seringa usada para injetar as amostras possa atingir a coluna de fluido.
   3. Verifique a presença de uma linha de base estável desejada (Tabela 1).
4. Inicie o fluxo de gás de purga
   1. Certifique-se de que o tanque de gás inerte (por exemplo, N₂) esteja equipado com um regulador de dois estágios e conecte o tanque de gás inerte com a entrada de gás do navio.
   2. Abra o gás com uma pressão de saída no regulador de 1-5 psi, abra a entrada do vaso de purga e abra lentamente a válvula de agulha do vaso de purga para permitir a entrada de gás. Verifique borbulhar dentro do vaso de purga.
5. Ajuste o fluxo de gás
   1. Registre a pressão celular medida pelo CLD com a linha de filtro IFD amostrando ar ambiente.
   2. Reposicione a tampa no vaso de purga, conecte a linha do filtro IFD ao vaso de purga (ou à armadilha NaOH no ensaio VCl₃ em HCl) e abra a saída do vaso de purga.
   3. Use a válvula da agulha para atingir a mesma pressão celular no nível cld que é registrado no ar ambiente.

7. Experimento

NOTA: Para obter mais detalhes sobre o experimento, consulte o trabalho publicado anteriormente⁴³.

1. Inicie o programa de aquisição de sinal de chemiluminescence
   1. Conecte a porta serial do CLD à porta serial do computador na qual o programa de aquisição foi instalado.
   2. Execute o programa de análise.
   3. Clique em Adquirir, selecione a pasta para salvar o arquivo .data, digite o nome do arquivo e clique em Salvar.
      NOTA: Observe o tempo de execução predefinido na tela, pois a gravação pára automaticamente quando o tempo predefinido decorre. Se necessário, o tempo de execução predefinido pode ser aumentado.
2. Prepare-se para repetidas injeções de amostra
   1. Ajuste a escala de tensão na tela para ter controle sobre a linha de base direcionada clicando nos botões Mínimo e/ou Máximo e, em seguida, digitando o valor desejado.
   2. Tenha um tubo de 20 ou 50 mL preenchido com ddH₂O para enxaguar a seringa entre as amostras.
   3. Tenha uma caixa de limpezas de tarefas delicadas prontamente disponíveis.
3. Injeção de amostra
   NOTA: Comece a partir das soluções padrão para a curva de calibração (injetar das amostras menos concentradas para as mais concentradas), em seguida, proceda às amostras de experimento (considere fazê-lo em duplicatas ou triplicados).
   1. Enxágüe a seringa pelo menos duas ou mais vezes com ddH₂O antes de retirar cada amostra (e após cada injeção) e verifique cada vez que a ejeção de água desobstruída em uma limpeza de tarefa.
   2. Insira a seringa no tubo de amostra enquanto segura a seringa e o tubo a uma distância próxima, puxe o êmbolo para o volume desejado, garantindo que nenhuma bolha de ar e/ou partes sólidas não homogeneizadas fiquem presas.
   3. Limpe a ponta da seringa com um limpador de tarefas, depois insira a seringa na tampa de septa na porta de injeção e injete depois de verificar se a ponta da seringa está dentro da fase líquida na câmara de reação.
4. Marque a injeção no programa de software e espere
   1. Verifique se a injeção causa uma mudança para cima no sinal (Figura Suplementar 1) (para baixo no consumo NO por ensaio hb livre de células) e digite o nome da amostra clicando na caixa cinza em Nomes de Amostra, em seguida, clique em Mark Injection.
      NOTA: Obstrução da seringa suspeita se a injeção de amostra não gerar um sinal.
   2. Aguarde o sinal elétrico para chegar novamente à linha de base (isso geralmente leva de 3 a 4 minutos). Este tempo pode ser usado para realizar a etapa 7.3.1.
5. Repita todas as etapas indicadas nas etapas 7.3 e 7.4 durante e após cada injeção até o final do experimento. Lembre-se de executar uma amostra da solução de preservação (se usado)
6. Pare o experimento
   1. Clique em STOP para interromper a aquisição do sinal, pare o CLD e desligue o banho de água (se o NO₃^- for medido).
   2. Interrompa o fluxo de gás, abra a válvula da agulha, remova a tampa do recipiente de purga, coloque um recipiente de lixo sob o ralo e abra a torneira de drenagem.
      NOTA: Se o experimento exigir aquisição de dados por mais de 60 minutos, é necessário reiniciar a aquisição após 60 minutos de tempo de execução (repetir a etapa 7.1.3) e fazer um novo arquivo.

8. Medições e cálculos

NOTA: As medições e os cálculos são feitos offline e podem ser realizados em um momento diferente.

1. Inicie o programa de aquisição de chemiluminescence para análise de dados offline
   1. Inicie o programa e clique em Process.
   2. Selecione o arquivo de experimento e clique em Abrir.
2. Calcule a área sob a curva para cada administração
   1. O softwaregrafa automaticamente na tela a linha de base (Figura Suplementar 2A, linha amarela horizontal) e o eixo máximo de cada onda gerada por cada administração de amostra (linhas amarelas verticais): verificar sua posição correta (ou ajustar clicando em cada linha e movendo-a com o mouse ou as setas) e clique em Threshold OK (Figura Suplementar 2B).
      NOTA: No ensaio de medição de HB sem células, o software normalmente não consegue capturar corretamente a forma de onda gerada pela injeção de amostra. Ao ampliar cada forma de onda, o operador pode facilmente auxiliar o software no cálculo da área (Figura Suplementar 2).
   2. O softwaregrafa automaticamente o início (linha verde vertical) e a extremidade (linha vermelha vertical) de cada pico causado por cada administração de amostra: verifique sua posição correta (ou ajuste clicando em cada linha e movendo-a com o mouse ou as setas) e clique em Integrar (Figura Suplementar 2C).
      NOTA: Algumas áreas do rastreamento podem ser equivocadamente definidas como injeções neste momento, e alguns picos podem ser contados automaticamente duas vezes. Ambos os erros podem ser reidentifiquem e removidos durante a etapa 8.2.2
   3. O software corresponde automaticamente a cada área de sinal após uma injeção marcada durante o experimento e seu nome atribuído: navegue por cada pico (indicado por uma linha vertical amarela) com o nome atribuído clicando no Next Peak e no Anterior Peak, em seguida, clique no botão Tudo OK para finalmente obter o cálculo para todas as áreas na tela.
   4. Para corrigir todos os erros de nomeação ou correspondência cometidos pelo usuário ou pelo programa, use conforme necessário os botões indicados no Arquivo Suplementar 1.
3. Transfira os valores da curva de calibração para uma planilha e gere uma equação de regressão linear (Figura Suplementar 3)
   1. Transfira os dados do programa CLD para uma nova planilha através de pasta de cópia. Organize as duas colunas na folha de dados como Concentração de Amostra e Área Sob a Curva, e adicione um valor combinado de zero em ambas as colunas.
   2. Selecione as duas colunas, clique em Inserir > Dispersão e, em seguida, no menu Chart Design , selecione Adicionar elemento gráfico > linha de tendência > Linear.
   3. Clique com o botão direito do mouse na linha de tendência gerada, clique em Format Trendline e clique nas opções Exibir Equações no Gráfico e Exibir valor R-quadrado no gráfico no menu Format Trendline para obter uma simples equação de calibração linear.
4. Transfira a área calculada de cada amostra para calcular sua concentração (Figura Suplementar 3)
   1. Informe todos os valores da planilha. Na coluna seguinte, aplique a equação obtida a partir da etapa 8.3.3 para obter a concentração de cada amostra injetada, onde y é a concentração (valor da nova coluna) e x é a área sob a curva medida após a injeção.
      NOTA: Lembre-se de levar em conta a concentração medida na solução de preservação (se utilizada) e subtrair os valores em conformidade.

Resultados

O ensaio de Não-consumo por Hb livre de células foi utilizado em amostras contendo concentrações conhecidas de oxicodona livre de células (Figura 4). Como um heme de oxyHb stoichiometricamente libera uma molécula NO no ensaio, o oxyHb purificado sem células é usado para construir a curva de calibração para o ensaio (Figura Suplementar 3).

A relação dose-resposta entre hb livre de células (medida com um assiiz colorimétrico) e NO cons...

Discussão

Devido à alta sensibilidade, ensaios baseados em chemiluminescência para a determinação de NO e compostos relacionados têm alto risco ^{de contaminação} nº₂. Cada reagente (especialmente a solução ^{de bloqueio NO} ₂) e dilutante (incluindo ddH₂O) usado no experimento devem ser testados para ^{seu conteúdo NO} ₂ para corrigir o sinal de fundo. O nitrito é extremamente reativo com meia-vida em sangue inteiro em torno de 10 minutos e rapidament...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic Acid	Sigma	45754	500 mL - liquid
Antifoam B Emulsion	Sigma	A5757	250 mL - liquid
DETA NONOate	Cayman	82120	10 mg
Gibco DPBS (1x) no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190144	500 mL
Hydroochloric Acid 37% (1 M)	Sigma	258148	500 mL - liquid
Iodine	SAFC	207772	100 g - solid
Kimwipes	Kimtech	34155
Mercury (II) Chloride ACS reagent> 99.5%	Sigma	215465	100 g - solid (dissolve in water)
Mili-Q Water Purification System	Millipore
Model 705 RN 50 μL syringe	Hamilton	80530	Microliter syringe
Model 802 N 25 μL Syringe	Hamilton	84854	Microliter syringe
N-ethylmaleimide	Sigma	4260	25 g - crystalline
Nitric Oxide Analyzer + Bundle Software - Purge Vessel	Zysense	NOA 280i	Chemiluminescence Detector
Nonidet p-40  (NP-40)	ThermoFisher	85125	10% - 500 mL
Potassium hexacyanoferrate (III) ACS reagent≥ 99%	Sigma	244023	100 g - powder
Potassium Iodide ACS reagent> 99%	Sigma	221945	100 g - solid
Potassium Nitrite cryst. For analysis EMSURE ACS	Supelco	105067	250 g - crystalline
PowerGen 125	Fisher Scientific	14-359-251	Mechanic Homogenizer
RV3 Two Stage Rotary Vane Pump	Edwards	A65201906	Vacuum Pump - Bundled with analyzer
Sodium Heparin - BD Hemogard Clo	BD Biosciences	BD367871	75 USP Units
Sodium hydroxide anhydrous ACS reagent ≥ 97%	Sigma	795429	1 kg - pelletts
Sodium Nitrate ACS reagent ≥ 99%	Sigma	221341	500 g - powder
Sodium nitrite ≥ 99%	Sigma	S2252	500 g - crystalline
Sulfanilamide ≥ 98%	Sigma	S9251	100 g - solid
Vanadium (III) Chloride	Sigma	112393	25 g - solid - Caution (exothermic)
Whatman 1 Filter Paper	Sigma	WHA10010155