Surveillance dynamique de la séroconversion à l’aide d’un test d’immunobilles multianalytes pour le Covid-19

Résumé

Cet article décrit une méthode pratique pour surveiller les changements dynamiques dans les titres d’anticorps pour deux isotypes d’immunoglobulines simultanément (IgA, IgM ou IgG) résultant d’une réponse immunitaire à l’infection ou à la vaccination contre le SRAS-CoV-2. Ce « panel de réponse immunitaire Covid-19 multianalyte » utilise trois immunoessais indirects construits sur des microsphères codées qui sont lues à l’aide d’un lecteur multiplex basé sur le flux avec une capacité « double canal ».

Résumé

Les technologies multiplexes permettant d’interroger de concert de multiples biomarqueurs existent depuis plusieurs décennies; cependant, les méthodes d’évaluation de plusieurs épitopes sur le même analyte restent limitées. Ce rapport décrit le développement et l’optimisation d’un test d’immunobilles multiplexées pour les tests sérologiques des isotypes d’immunoglobulines courants (par exemple, IgA, IgM et IgG) associés à une réponse immunitaire à l’infection ou à la vaccination contre le SRAS-CoV-2. Les essais ont été réalisés à l’aide d’un lecteur fluorescent multiplex basé sur le débit avec une capacité à deux canaux. Optimisations axées sur le temps de capture de l’analyte, la concentration d’anticorps de détection et le temps d’incubation des anticorps de détection. Les caractéristiques de performance des essais analytiques (p. ex., la plage d’essai (y compris les limites inférieure et supérieure de quantification); et la précision intra et inter-essais) ont été établies pour la combinaison de sérotypes IgG/IgM ou IgA/IgM en tandem à l’aide du mode « double canal ». Les temps de capture de l’analyte de 30 min pour les IgG, 60 min pour les IgM et 120 min pour les IgA convenaient à la plupart des applications, offrant un équilibre entre les performances et le débit des tests. Des incubations optimales d’anticorps de détection à 4 μg/mL pendant 30 min ont été observées et sont recommandées pour des applications générales, compte tenu de l’excellente précision globale (coefficient de variance en pourcentage (%CV) ≤ 20%) et des valeurs de sensibilité observées. La plage dynamique de l’isotype IgG s’étendait sur plusieurs ordres de grandeur pour chaque essai (Spike S1, nucléocapside et glycoprotéines membranaires), ce qui permet des évaluations robustes du titre à un facteur de dilution de 1:500 pour les applications cliniques. Enfin, le protocole optimisé a été appliqué à la surveillance de la séroconversion Spike S1 chez les sujets (n = 4) qui ont terminé un schéma vaccinal contre le SRAS-CoV-2. Au sein de cette cohorte, on a observé que les taux d’IgG Spike S1 atteignaient des titres maximaux 14 jours après l’administration de la deuxième dose, à une intensité de signal beaucoup plus élevée (~ 40 fois) que les isotypes IgM ou IgA. Fait intéressant, nous avons observé des taux de désintégration du titre Spike S1 IgG très variables qui dépendaient en grande partie du sujet, ce qui fera l’objet d’études futures.

Introduction

La mesure simultanée de plusieurs biomarqueurs liés à la maladie dans des échantillons biologiques permet d’obtenir des informations descriptives et prédictives sur les processus pathologiques. Bien que les procédures immunologiques conventionnelles à analyte unique, telles que les tests immuno-enzymatiques (ELISA), aient été la pierre angulaire des analyses quantitatives dans les contextes cliniques et de recherche, ces techniques peuvent avoir des limites substantielles en ce qui concerne le débit, la quantité d’échantillon requise pour chaque mesure et la rentabilité qui limitent considérablement l’étude de multiples éléments biologiques qui sont souvent entrelacés tout au long de l’évolution de la maladie¹ . La technologie de multiplexage basée sur la microsphère est devenue une plate-forme indispensable pour les installations de diagnostic et de recherche pour sa capacité à combiner des essais pour améliorer le débit en laboratoire, atténuer la rareté des échantillons et réduire les tests répétitifs afin de maximiser les économies de coûts ^1,2,3,4. Récemment, une nouvelle augmentation de cette puissance de multiplexage a été introduite avec des instruments dotés de capacités de double rapporteur. La fonction à double rapporteur implémente deux canaux fluorescents pour la détection, fournissant une autre dimension du multiplexage, permettant la détection de plusieurs épitopes sur le même analyte.

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) est l’agent pathogène responsable de la pandémie actuelle de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19)⁵. Bien que le test RT-PCR soit crucial pour la confirmation de l’infection au début de l’évolution de la maladie, les examens sérologiques des titres d’anticorps se sont révélés impératifs pour la critique précise et complète des individus concernant une exposition ou un rétablissement antérieur; une réponse à la vaccination; et/ou une évaluation de l’efficacité de la vaccination contre le Covid-19 ^6,7.

Ce rapport décrit les méthodes d’évaluation de la séroconversion pour plusieurs antigènes viraux du SRAS-CoV-2 qui utilisent un système de double rapport à lecteur multiplex basé sur le flux. Plus précisément, la détection simultanée de deux sous-types d’anticorps (configurés comme IgG/IgM ou IgA/IgM) pour un panel d’antigènes SARS-CoV-2 à 3 plex qui comprend des tests pour spike S1, nucléocapside et glycoprotéines membranaires (aka Matrix), est décrite. Cette approche fournit une entreprise idéale pour la capture de la séroconversion longitudinale et fournit un outil précieux dans l’arsenal contre la pandémie de Covid-19.

Protocole

Tous les sujets ont été inscrits avec un consentement éclairé écrit avec l’approbation complète du Conseil d’examen institutionnel (IRB) du Rush University Medical Center en vertu du protocole ORA 20101207 avec toutes les directives institutionnelles pour la conduite de la recherche éthique observée. Le sang a été recueilli par phlébotomie conventionnelle dans des vacutainers de lavande (K₂EDTA) et traité avec les protocoles recommandés. Le plasma résultant a été archivé à -80 °C jusqu’à ce que des évaluations soient effectuées.

1. Préparation de microsphères conjuguées à l’antigène

1. Sélectionnez trois flacons différents de microsphères magnétiques avec des régions de perles uniques, en enregistrant l’ID de perle et les informations de lot pour chaque flacon utilisé.
   REMARQUE: Les étapes suivantes seront suivies pour chaque région de microsphère distincte. Les microsphères sont sensibles à la lumière et doivent être protégées d’une exposition prolongée à la lumière. Lors des étapes de lavage, veillez à ne pas déranger les microsphères. En cas de perturbation, prévoyez une deuxième séparation de 60 s.
2. Vortex le stock de microsphère pendant 60 s et sonicate pendant 5 min avant utilisation pour dissocier les billes agrégées.
3. Transférer 1,0 x 10⁶ billes dans des tubes de microcentrifugation à faible teneur en protéines de 1,5 mL.
4. Insérez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 s. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de perle.
5. Retirez le tube du séparateur magnétique, remettez en suspension les billes avec 100 μL d’eau de qualité HPLC et vortex pendant 30 s. Replacez le tube dans le séparateur magnétique pendant 60 s, puis retirez le surnageant. Répétez ce protocole de lavage deux fois.
6. Retirer le tube du séparateur magnétique et remettre en suspension les microsphères lavées dans 90 μL de phosphate de sodium monobasique de 100 mM, pH 6,2 (tampon d’activation) par vortex pendant 30 s.
7. Ajouter 10 μL de 50 mg/mL de Sulfo-NHS (dilué avec un tampon d’activation) aux microsphères et vortex doucement pendant 10 s. Ajouter 10 μL de solution d’EDC à 50 mg/mL (diluée avec un tampon d’activation) et vortex doucement pendant 10 s. Incuber des microsphères pendant 20 min à température ambiante (RT) avec un léger vortex toutes les 10 min.
8. Répétez les étapes de lavage 1,4 à 1,5 avec 50 mM MES, pH 5,0 (tampon de couplage) au lieu d’eau de qualité LC / MS pour un total de deux lavages.
9. Retirez le tube du séparateur magnétique et remettez en suspension les billes avec 100 μL de tampon de couplage par vortex pendant 30 s suivi immédiatement de l’ajout de la quantité de protéine souhaitée.
10. Porter le volume total à 150 μL avec le tampon de couplage. Mélanger la réaction de couplage par vortex pendant 30 s et incuber pendant 2 h par rotation à RT.
    NOTE: Pour les essais définis ici, des conjugaisons ont été effectuées avec les concentrations de protéines suivantes: Spike S1: 5 μg; Nucléocapside: 5 μg; Membrane : 12,5 μg.
11. Répétez l’étape de lavage 1.4 avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)-1 % d’albumine sérique de chèvre, 0,01 % de polysorbate-20 (tampon de trempe) au lieu d’eau de qualité LC/MS pour un total de deux lavages. Remettre en suspension les microsphères lavées dans 100 μL de tampon de trempe contenant 0,05 % d’azoture de sodium par vortex pendant 30 s.
    REMARQUE: Laissez les perles se tremper complètement pendant au moins 6 heures avant de procéder à toute autre procédure.
12. Comptez le nombre de microsphères récupérées à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre. Notez la concentration de billes observée.
13. Réfrigérer les microsphères couplées à 4 °C dans l’obscurité.

2. Procédures

1. Performances du test (protocole de base)
   1. Resuspendez les microsphères couplées par vortex pendant 30 s et soniquez pendant ~60-90 s.
   2. Retirez la quantité requise de chaque colloïde de bille du tube respectif et combinez les colloïdes de perles dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
   3. Insérez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 secondes. Avec le tube toujours dans le séparateur magnétique, retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de perle.
   4. Retirez les billes du séparateur, remettez en suspension les perles avec 100 μL d’albumine sérique bovine PBS-1%, 0,01% de polysorbate-20 (tampon d’essai) et vortex pendant 30 s. Placez le tube dans un séparateur magnétique et laissez la séparation se produire pendant 60 s. Répétez ce protocole de lavage (c.-à-d. les étapes 2.1.3 à 2.1.4) deux fois.
   5. Ajuster la concentration du mélange de microsphères de travail 3-plex en ajoutant un volume approprié de tampon d’essai pour générer une concentration finale de 100 microsphères par 1 μL pour chaque cible.
   6. Aliquote 12,5 μL du mélange de microsphère préparé à l’étape 2.1.5 dans chaque puits d’une plaque de 384 puits ou 25 μL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits.
   7. Diluer les échantillons de plasma/sérum 500 fois dans le tampon d’essai. Préparer les spécimens standard selon le titrage souhaité.
   8. Ajouter 12,5 μL de tampon d’essai comme échantillon à blanc et ajouter chacun de l’échantillon dilué ou de l’étalon dans chaque puits désigné d’une plaque d’échantillon de 384 puits ou 25 μL de l’échantillon ou de l’étalon à blanc dilué dans chaque puits d’une plaque d’échantillon de 96 puits.
   9. Couvrir la plaque avec un joint ou une feuille d’aluminium et incuber pendant 1 h à RT sur un agitateur à plaque réglé à 700 tr/min.
      NOTE: Le schéma des courbes de dilution est fourni dans le tableau 1.
   10. Préparer une solution d’anticorps anti-détection humaine (solutions d’anticorps secondaires) à 4 μg/mL avec le tampon d’essai spécifié à l’étape 2.1.11.
   11. Préparer des IgM chèvre-anti-humaines, conjuguées avec des IgA Super Bright 436 (SB)/Chèvre-anti-humaines, des anticorps de détection de phycoérythrine (PE) à 4 μg/mL; ou IgM anti-humains, Conjugué SB/IgG anti-humains de chèvre, Conjugué PE détecte des anticorps à 4 μg/mL.
       REMARQUE : Pour un format de plaque de 384 puits, 12,5 μL/puits de la solution d’anticorps secondaire préparée sont nécessaires, et pour un format de plaque de 96 puits, 25 μL/puits sont requis.
   12. Placez la plaque sur un séparateur magnétique, lavez-la rapidement et inversez de force un récipient à risque biologique pour éliminer le liquide des puits. Avec la plaque toujours inversée, tapotez-la avec force contre une épaisse liasse de papier.
   13. Lavez chaque puits avec 100 μL de tampon d’essai et retirez le liquide par inversion forcée sur un récipient à risque biologique, comme décrit précédemment. Répétez ces étapes (2.1.12-2.1.13) pour un total de deux lavages. Jetez toutes les liasses de papier usagées dans un contenant contenant contenant un danger biologique.
   14. Ajouter 12,5 μL de la solution de travail d’anticorps secondaire à chaque puits d’une plaque de 384 puits ou 25 μL à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Couvrez la plaque avec un joint ou une feuille d’aluminium et incubez pendant 30 min à RT sur un agitateur à plaque réglé à 700 tr / min.
   15. Répétez les étapes de lavage 2.1.12-2.1.13
   16. Ajouter 75 μL de tampon d’essai dans chaque puits d’une plaque de 384 puits ou 100 μL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Couvrir la plaque avec un joint ou une feuille d’aluminium et incuber pendant 5 min à RT sur un agitateur à plaque réglé à 700 tr / min.
   17. Analysez 60 μL via l’analyseur d’instruments conformément au manuel du système.
2. Optimisation du temps d’incubation de capture d’échantillons
   1. Effectuez les étapes de la section 2.1 en utilisant des temps d’incubation de 30 min, 60 min et 120 min à l’étape 2.1.9.
      REMARQUE: Les incubations peuvent être effectuées soit avec des plaques distinctes, soit en s’arrêtant à l’étape 2.1.6 jusqu’à ce qu’il passe à l’étape 2.1.9. pour atteindre les temps d’incubation souhaités.
   2. Procéder à la lecture de plaques sur l’analyseur en utilisant 60 μL du mélange d’essai conformément aux recommandations du fabricant.
3. Optimisation de la concentration d’anticorps secondaires
   1. Effectuer cette procédure comme indiqué à la section 2.1, à l’exception des concentrations finales de réactifs dans la solution de travail d’anticorps secondaires (préparée à l’étape 2.1.10-2.1.11) modifiée comme suit:
      Anticorps de détection IgM anti-humains (ou lapins) de chèvre et de SB à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL.
      IgA de chèvre anti-humain (ou lapin), anticorps de détection conjugués PE à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL.
      Anticorps de détection IgG anti-humains (ou lapins) de chèvre et de conjugué PE à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL.
      IgG chèvre-anti-humaine (ou lapin), IgM conjuguée PE/chèvre-anti-humaine (ou lapin), anticorps de détection conjugués SB à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL.
      IgA chèvre-anti-humaine (ou lapin), IgM pe-conjuguée/chèvre-anti-humaine (ou lapin), anticorps de détection sb-conjugués à 8, 4, 2, 1 et 0,5 μg/mL.
   2. Procéder à la lecture de plaques sur l’analyseur en utilisant 60 μL du mélange d’essai conformément aux recommandations du fabricant.
4. Optimisation du temps d’incubation des anticorps secondaires
   1. Effectuez cette procédure comme indiqué à la section 2.1 avec une durée d’incubation de 15 min, 30 min, 60 min et 120 min définie à l’étape 2.1.14.
   2. Procéder à la lecture de plaques sur l’analyseur en utilisant 60 μL du mélange d’essai conformément aux recommandations du fabricant.
5. Évaluation des échantillons sujets avec des tests à double canal optimisés
   1. Prélever des échantillons de plasma chez le sujet (n = 4) aux jours -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 et +120 par rapport à la fin de l’administration du vaccin Covid-19 (c.-à-d. deuxième dose).
      REMARQUE : Le jour 0 représente le moment où la vaccination a été effectuée.
   2. Effectuer tous les tests à l’aide du protocole de base (section 2.1.) en tant que test à double canal IgG/IgM ou IgA/IgM.
   3. Normaliser les résultats à la valeur maximale observée de l’intensité fluorescente médiane (IMF) pour chaque immunoglobuline et test spécifique.

Résultats

Résultats typiques des essais et évaluations du rendement
Les tests d’immunobilles fournissent généralement une courbe sigmoïdale lorsqu’ils sont évalués sur plusieurs ordres de grandeur (logarithmiques), comme illustré dans chacun des panneaux présentés à la figure 1. L’utilisateur doit définir expérimentalement la plage de concentration optimale pour chaque analyte dans le multiplex afin de déterminer la gamme complète de quantification, en veillant à ne pas suréchantillonner les extrêmes (zones approchant la limite inférieure de quantification [LLOQ] ou la limite supérieure de quantification [ULOQ]). La plage réelle requise pour un essai est toutefois dictée par la distribution des analytes cibles dans une matrice biologique (c.-à-d. les « inconnus ») à un facteur de dilution donné. De plus, bien que les courbes standard soient généralement interprétées par régression linéaire avec un algorithme d’ajustement paramétrique à 4 ou 5, la partie linéaire d’une courbe donnée fournit généralement la plus grande confiance dans la précision quantitative avec un modèle linéaire (y = mx + b) de quantification. L’adaptation de la courbe d’étalonnage aux valeurs observées pour un facteur de dilution inconnu à un facteur de dilution donné devrait être l’objectif du développement du test quantitatif.

À cet égard, une courbe standard en 7 points basée sur une série de dilutions en série 1:5 a été évaluée pour chacun des anticorps Spike S1, Nucléocapside et Membrane qui varient entre 1 μg/mL et 0,000064 μg/mL pour Spike S1 et Nucleocapsid et 5 μg/mL et 0,00032 μg/mL pour Membrane, comme le montre la figure 1. La limite inférieure de détection (LLOD) pour chaque essai a été définie comme la concentration d’analyte la plus faible qui produisait un signal distinguable de son fond. LLOD peut être identifié par l’équation décrite précédemment ^8,9, LLOD = LoB + 1,645 (échantillon_{de faible concentration} SD). LoB est la limite inférieure du blanc, et c’est la concentration « apparente » de l’analyte qui est produite à partir du blanc lorsqu’une valeur nulle est attendue, et elle peut être déterminée à l’aide de cette équation LoB =_{Blanc moyen} + 1,645 (_blanc SD)⁸. Sur la base de cette méthode, les valeurs de l’IFM pour le test Spike S1 variaient de 134,38 à 20191,2, avec 134,38 IFM représentant 0,00024 μg/ mL et défini comme llOD. Pour le test membranaire, la plage pratique d’IFM était de 52,24 à 4764,9, avec 52,24 IFM calculé à 0,004885 μg / mL et attribué comme LLOD. La gamme d’IFM pour le test nucléocapside était de 517,9 à 19666,34, avec 517,9 spécifiés comme 0,00024 μg / mL, qui était le LLOD. La limite supérieure de détection (ULOD) est définie comme la concentration d’analyte après laquelle le changement dans l’IMF n’est plus linéaire et la réponse du signal est saturée. Il convient de noter que le caractère sigmoïdal complet de ces courbes n’est pas observable pour les étalons testés, à l’exception de la courbe nucléocapside. Cependant, étant donné que les valeurs d’IFM observées pour toutes les inconnues testées à ce jour (à une dilution de 1:500) se situent dans la plage de courbes présentée pour chaque analyte et sont facilement quantifiées à l’aide d’un ajustement paramétrique de 4 ou 5 par régression linéaire.

Précision du dosage
Précision intra-essai: Quatre répétitions d’essais ont été effectuées sur la même plaque pour évaluer la précision de l’essai, calculée comme le %CV, ou le quotient de l’écart-type et de la moyenne multipliée par 100. Les points standard 2 et 5 ont été sélectionnés pour ces totalisations, les valeurs étant cataloguées dans le tableau 2. Le seuil limite supérieur acceptable typique pour les valeurs %CV est ≤20 %, ce qui a été observé pour ces données, à l’exception de celui de la norme 2 des IgG membranaires, qui résulte probablement des niveaux de fond et peut être rectifié en éliminant les valeurs périphériques (données non présentées). Il convient de noter qu’une instabilité apparente de la valeur de lecture a été observée pour les essais membranaires où les valeurs de l’IFM étaient de <200, le plus souvent dans le cas des isotypes IgA et IgM.

Précision entre les essais : Trois lots distincts d’ensembles de billes ont été préparés pour chaque essai et testés, comme défini pour la précision intra-essai (ci-dessus et comme le montre la figure 1). La variabilité entre les essais a été évaluée en calculant le %CV à partir des résultats moyens pour chacun des trois lots, comme le montre le tableau 3. Encore une fois, le seuil limite supérieur pour un %CV acceptable est fixé à ≤20 %, qui existe pour toutes les conditions testées (avec un effet similaire avec la norme 2 des IgG membranaires, comme on l’a vu ci-dessus). Il convient de noter que la variabilité d’un lot à l’autre des valeurs nettes d’IFM est couramment observée dans plusieurs lots des mêmes immunoréacteurs au cours de l’élaboration d’essais personnalisés. L’utilisation d’une courbe d’étalonnage érigée à partir d’un anticorps anti-cible obtenu commercialement (p. ex., anti-Spike S1 de lapin) suivie d’un anticorps de détection anti-espèce peut assurer la cohérence des résultats analytiques et permettre des comparaisons entre plusieurs lots à différentes périodes de temps.

Précision inter-essais avec des échantillons humains : L’évaluation de la précision inter-essais a été répétée avec des échantillons de plasma humain (n = 5) prélevés dans le mois suivant la première notification des symptômes d’une infection par le SRAS-CoV-2; réalisé avec trois lots distincts d’essais (c.-à-d. différentes préparations des ensembles de perles). Ces résultats sont présentés dans le tableau 4 et démontrent la précision avec une valeur %CV avec la valeur limite supérieure typique de ≤20 %. Les valeurs moyennes en % CV pour les titres Spike S1, Nucleocapsid et Membrane IgG ont été calculées à 9,9 % (plage 2,6 % à 18 %), 11,0 % (plage 3,5 % à 24,4 %) et 7,6 % (plage 3,2 % à 12,9 %), respectivement. Des observations similaires ont été faites avec les titres IgM et IgA de ces trois analytes, tous fournissant des valeurs %CV <20%. La seule exception à cette règle était les titres IgM du sujet 5 pour la protéine membranaire, qui a ensuite été exclue en tant que valeur aberrante. Les valeurs de précision pour les évaluations des sujets humains sont cohérentes avec celles observées ci-dessus pour les anticorps de lapin, ce qui suggère que ces tests peuvent être facilement reconfigurés pour évaluer les titres des antigènes chez plusieurs espèces avec peu d’impact sur la précision des essais. Comme indiqué ci-dessus, il y avait une instabilité apparente des valeurs de lecture observées pour les essais membranaires où les valeurs de l’IFM étaient de <200, le plus souvent dans le cas des isotypes IgA et IgM.

Optimisation de la concentration d’anticorps primaires
Le « temps de capture » de l’analyte a été évalué avec les billes conjuguées à l’antigène, et les anticorps dans les échantillons de plasma ou dans les étalons ont été testés en modifiant la durée de l’incubation primaire (30 min, 1 h, 2 h et 4 h). La différence dans l’IFM moyenne est présentée comme le quotient d’une incubation spécifique et la durée maximale d’incubation, appelée % Max., dans la figure 2, entre une incubation de 30 minutes (durée minimale) et une incubation de 4 heures (durée maximale). Les valeurs à 120 min étaient optimales pour les titreurs d’IgG pour les anticorps Spike S1, membrane et nucléocapside, indiquant une cinétique de liaison rapide des anticorps primaires, permettant une flexibilité pour augmenter le débit du test. Cependant, une cinétique plus lente a été observée pour les isotypes IgA et IgM (données non présentées), démontrant des niveaux de capture de pointe au point de temps de 4 h, comme le montre la figure 2. Dans l’ensemble, il existe un équilibre entre l’approche de la saturation du test et l’opportunité pratique pour l’exécution de chaque test en production (pour maximiser le débit). Avec cela, des signaux appropriés à des fins quantitatives à des temps d’incubation minimaux de 30 min pour les IgG, 60 min pour les IgM et 120 min pour les IgA ont été observés dans ces résultats.

Optimisation de la concentration d’anticorps secondaires
Cinq concentrations d’anticorps secondaires (IgG anti-humaines de chèvre, conjuguées à l’EP; IgA anti-humaines de chèvre, conjuguées à l’EP; IgM anti-humaines de chèvre, conjuguées SB) ont été testées (0,5, 1, 2, 4 et 8 μg/mL). Tous les anticorps ont révélé de larges gammes de signaux, sans saturation évidente du signal dans aucune condition, assurant ainsi une mesure linéaire pour l’une des concentrations. À titre d’exemple, le signal moyen généré par le test Spike S1 utilisant des IgM anti-humaines de chèvre, conjuguées SB à 0,5 μg / mL était de 13,2% de l’IMF générée à partir du signal maximal (8 μg / mL), tandis que l’IMF générée à partir de 4 μg / mL était de 73,3% de l’IMF manifestée au signal maximal. Les détails de la gamme de signaux provenant des autres isotypes d’anticorps Spike S1, des anticorps membranaires et des anticorps nucléocapsides sont inclus dans le tableau 5 et la figure 3. En pratique, l’impact primaire entre la concentration optimale d’anticorps secondaires et la concentration d’anticorps secondaires de 4 μg/mL précédemment indiquée se reflète en termes de sensibilité au test et de coût du test. Autrement dit, une concentration d’anticorps secondaires de 8 μg/mL peut être souhaitable pour une application avec de faibles titres d’anticorps ou de faibles quantités d’échantillons précieux, mais le coût associé à ces essais serait considérablement plus élevé que l’utilisation de la concentration de 4 μg/mL précédemment définie. Inversement, les cas dans lesquels des titres d’anticorps élevés devaient être observés (comme les personnes qui ont subi des vaccinations contre le Covid-19 ou avec des quantités non limitatives de sérums) verraient un rapport coût-bénéfice par l’application de quantités plus faibles d’anticorps secondaires (par exemple, 1 μg / mL).

Optimisation de l’incubation d’anticorps secondaires
L’influence potentielle de la durée de l’incubation secondaire des anticorps a également été étudiée en modifiant la durée de l’incubation (15, 30, 60 et 120 min). En règle générale, la différence entre l’IMF moyenne présentée comme le quotient d’une incubation spécifique et la durée maximale d’incubation, appelée %Max, entre une incubation de 15 minutes (durée minimale) et une incubation de 120 minutes (durée maximale) ne dépassait pas 30 %, 55 % et 50 % pour les anticorps Spike S1, Membrane et Nucléocapside, respectivement, indiquant une étape cinétique rapide dans la liaison secondaire des anticorps et un moyen d’augmenter le débit du test. Le tableau 6 comprend des détails sur les changements de signal pour toutes les périodes d’incubation. Des illustrations des signaux observés lors de différentes incubations de cette analyse sont présentées à la figure 4.

Performances et spécificité du double canal
Pour chaque analyte, un seul format de rapporteur (IgG-PE uniquement, IgA-PE uniquement ou IgM-SB uniquement) a été comparé au signal généré pour le même analyte lorsqu’il a été exécuté dans un format à double rapporteur (par exemple, Spike S1 IgG-PE uniquement par rapport à Spike S1 IgG-PE en combinaison avec Spike S1 IgM-SB dans le format double rapporteur). La précision du dosage (exprimée en %CV) pour les signaux créés dans les deux formats a été utilisée pour analyser la relation dans les résultats de cette expérience. Les valeurs en % CV des tests Spike S1 étaient de 6,19 %, 16,4 % et 23 % pour les IgM, les IgG et les IgA, respectivement. Pour le test sur membrane, les valeurs de %CV étaient de 3,3 %, 7,9 % et 16,4 % pour les IgM, les IgG et les IgA, respectivement. Enfin, le test Nucleocapsid a fourni des valeurs de %CV à 8,7%, 10,3% et 24,2% pour les IgM, IgG et IgA, respectivement. Les valeurs de précision observées pour les isotypes IgM et IgA suggèrent qu’un temps d’incubation plus long pourrait conférer des résultats de dosage supérieurs en raison des différences cinétiques de liaison connues entre ces classes d’immunoglobulines. La figure 4 montre l’accord entre les formats des différentes concentrations d’anticorps secondaires.

Pour confirmer la spécificité des canaux de reportage, un seul canal de reportage a été testé à un moment donné tandis que l’autre canal a été affecté en blanc pour s’enquérir du signal non spécifique (effet de saignement). Ces résultats indiquent qu’il y a une contamination négligeable des signaux croisés entre les deux canaux rapporteurs, compte tenu de la grande spécificité dans l’ensemble du spectre des conditions. Ces constatations sont illustrées à la figure 5. Dans l’ensemble, nous avons observé une interférence de 6,45 % entre le canal 1 et le canal 2. Cependant, lorsque l’ampleur des signaux a été prise en compte, nous avons observé les niveaux d’interférence potentiels suivants en mode double rapporteur : Spike IgG / IgM à 71,98%, Spike IgA / IgM à 28,11%; IgG/ IgM membranaire à 7,41 %, IgA/IgM membranaire à 134,61 %; et Nucleocapsid IgG/IgM à 146,03 %, Nucleocapsid IgA/IgM à 112,13 %. Dans la configuration spécifiée, cela nécessiterait la mesure de Spike IgM en combinaison avec l’isotype IgA, l’IgM membrane avec l’isotype IgM et les mesures nucléocapsides non effectuées dans un format à double canal. Cette constatation pourrait nécessiter l’exploration de l’inversion de la stratégie d’étiquetage selon laquelle les IgA et les IgG sont mesurées dans le canal 2 et les IgM dans le canal 1.

Évaluation des événements de séroconversion suite à la vaccination contre le Covid-19
La séroconversion a été surveillée chez quatre sujets lors de l’évaluation des IgA, igM et IgG avec le test Spike S1 à des moments allant de la pré-vaccination à quatre mois après la fin de la série de vaccination Covid-19. Les mesures ont été effectuées en mode double canal (IgG / IgM et IgA / IgM, avec des valeurs d’IgM moyennes). Tous les sujets ont reçu le vaccin sous forme d’immunisation en 2 étapes, selon la pratique standard, avec un intervalle de 21 jours entre la première et la deuxième dose. Les graphiques de la réponse immunitaire de chaque sujet sont présentés à la figure 6A-C. Les valeurs de réponse immunitaire pour les antigènes nucléocapside et membranaire ont été observées à des niveaux de fond pour toutes les immunoglobulines évaluées (données non présentées), ce qui était cohérent avec le fait que les sujets n’avaient pas d’infection antérieure documentée par le SRAS-CoV-2 avant la vaccination. Dans l’ensemble, les valeurs observées des IgA et des IgM spike S1 étaient environ 40 fois inférieures aux titres d’isotype IgG, les titres de pointe atteignant leur crête dès 14 jours pour les isotypes IgM et IgG et l’isotype IgA atteignant les titres de pointe entre le moment de la deuxième dose (jour 0) et 14 jours après la deuxième dose, selon le sujet. Notamment, les titres Spike S1 IgG commencent à se décomposer au cours des quatre mois suivant la fin de la vaccination à un taux très variable, en fonction du sujet.

Figure 1 : Courbes standard représentatives de 3 plex. Courbes standard représentatives pour les trois analytes; présentée sous la forme d’une courbe de dilution en série de 1:5 en 7 points commençant à (A) 1 μg/mL pour Spike S1, (B) 5 μg/mL pour Membrane et (C) 1 μg/mL pour nucléocapside et anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Optimisation du temps d’incubation des anticorps primaires/échantillons : Le signal MFI moyen produit à partir de différents temps d’incubation d’anticorps/échantillons primaires (capture d’anticorps) allant de 30 min à 4 h pour les étalons 1 à 7 (comme indiqué dans le tableau 1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Optimisations de la concentration d’anticorps secondaires et performances à deux canaux. Les courbes illustrent l’IFM moyenne (normalisée à la valeur la plus élevée enregistrée dans la série) produite à partir de concentrations d’anticorps secondaires testées, allant de 0,5 à 8 μg/mL. Chaque instance a été réalisée à la fois comme un test à un ou deux canaux pour apprécier les différences dans le format expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Optimisation du temps d’incubation des anticorps secondaires, format double canal. Graphiques représentatifs des valeurs d’IFM observées (normalisées à la valeur la plus élevée enregistrée dans la série) en ce qui concerne le temps d’incubation avec des anticorps secondaires. Les expériences ont été réalisées sous forme de tests à double canal sous forme de combinaisons IgA/IgM (A-C) ou IgG/IgM (D-F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Évaluations de la spécificité des essais à double canal. Résultats d’essai du format d’essai à double canal avec une de chaque combinaison désignée comme blanc pour illustrer l’absence de fluorescence ou d’interférence transversal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Illustration de la séroconversion suite à la vaccination contre le Covid-19. Graphiques illustrant les titres relatifs des anticorps (A) IgG, (B) IgM et (C) IgA pour l’antigène Spike S1 au cours de la vaccination contre le Covid-19 (pré-vaccination - 4 mois après l’achèvement); le temps est indiqué en jours par rapport à l’achèvement de la série vaccinale; les points généraux de l’administration du vaccin sont indiqués (lignes rouges). Les expériences ont été réalisées en mode double canal, comme décrit dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Numéro standard	Série de dilution	Anti-Spike S1 ou N (μg/mL)	Anti-membrane (μg/mL)
Blanc	Blanc	-	-
1	STD7 1:1	1	5
2	MST6 1:5	0.2	1
3	STD5 1:25	0.04	0.2
4	MST4 1:125	0.008	0.04
5	STD3 1:625	0.0016	0.008
6	STD2 1:3125	0.00032	0.0016
7	STD1 1:15625	0.000064	0.00032

Tableau 1 : Séries de dilution pour les courbes standard : Tableau des facteurs de dilution utilisés pour les courbes standard du sérotype IgG; présenté sous la forme d’une courbe de dilution en série de 1:5 en 7 points commençant à 1 μg/mL pour α-Spike S1 et α-nucléocapside et 5 μg/mL pour les anticorps α-Membrane.

Analyte	Échantillon	Représentant 1	Représentant 2	Représentant 3	Représentant 4	Ave	Sd	%CV
Pointe S1	STD2	369.4	356.9	295.2	271.5	323.3	47.4	14.6
	MST5	3869.1	3437	3970.2	4240.7	3879.3	334	8.6
Membrane	STD2	40.6	37.7	49.9	27.8	39	9.1	23.3
	MST5	733.2	731.3	724	678.1	716.7	26	3.6
Nucléocapside	STD2	1746.7	1790.8	1577.3	1664.8	1694.9	94.2	5.6
	MST5	15598.1	14735.5	18369.5	17408.5	16527.9	1657.7	10

Tableau 2 : Précision intra-essai : Coefficient de variance en pourcentage (%CV) calculé à partir de quatre répliques de mélanges d’anticorps standard aux normes 2 (STD2) et 5 (STD5) avec un seul lot d’essai dans la même expérience. Les valeurs fournies pour les répétitions et les moyennes représentent les valeurs d’IFM observées.

Analyte	Échantillon	Lot 1	Lot 2	Lot3	Ave	Sd	%CV
Pointe S1	STD2	383.2	424.4	379.9	395.8	24.8	6.3
	MST5	5639.7	6062.5	6384.3	6028.8	373.4	6.2
Membrane	STD2	39.1	58.5	59.1	52.2	11.4	21.8
	MST5	732.3	941.4	701.1	791.6	130.7	16.5
Nucléocapside	STD2	1342.6	1621	1718.2	1560.6	195	12.5
	MST5	13543.9	14843.2	17883.4	15423.5	2227.2	14.4

Tableau 3 : Précision entre les essais avec des échantillons étalons : Coefficient de variance en pourcentage (%CV) calculé à partir de trois lots distincts de tests, évalués aux normes 2 et 5 dans la même expérience. Les valeurs fournies pour les répétitions et les moyennes représentent les valeurs d’IFM observées.

		IgG-PE		IgM-SB		IgA-PE
		Ave. IMF	%CV	Ave. IMF	%CV	Ave. IMF	%CV
Pointe S1	Sujet 1	8002.3	17.7	1949.5	1.3	2045.8	5.5
	Sujet 2	19155.8	7.3	918.6	4.1	1684.5	3.9
	Sujet 3	17865.6	18.0	549.4	3.8	961.3	8.1
	Sujet 4	11901.1	2.6	1603	4.8	8736.4	5.5
	Sujet 5	9801.8	4.0	1014.1	3.0	2747.6	9.3
Nucléocapside	Sujet 1	15097.8	11.3	1049.7	9.9	5276.5	3.9
	Sujet 2	15204.3	12.1	265.9	5.2	6761.3	11.9
	Sujet 3	18471.7	24.4	329.1	4.5	14308	2.9
	Sujet 4	16424.7	3.5	2418.1	0.1	4234.7	4.2
	Sujet 5	13344.9	3.6	225.6	10.0	13436.5	9.7
Membrane	Sujet 1	514.6	8.6	180.6	14.0	141.2	9.8
	Sujet 2	196.8	5.2	57	20.7	55.5	13.0
	Sujet 3	553.7	12.9	54.5	21.2	191.2	18.6
	Sujet 4	377.9	3.2	68.1	22.1	62	2.3
	Sujet 5	325.4	8.2	11.4	91.6	74.6	20.8

Tableau 4 : Précision entre les essais avec des échantillons humains : Coefficient de variance moyen en pourcentage (%CV) calculé à partir de trois lots de tests testés avec des échantillons de plasma (dilué 500 fois) de cinq sujets humains atteints d’infections par le SRAS-CoV-2.

		Pointe S1		Membrane		Nucléocapside
	μg/mL	Ave. IMF	% Max.	Ave. IMF	% Max.	Ave. IMF	% Max.
Igm	0.5	186	13.2	32	25.2	132.7	13.6
	1	304.2	21.6	45.8	36	194.4	19.9
	2	664.5	47.2	78.8	61.9	458.2	47
	4	1032.1	73.3	101.3	79.6	707.8	72.6
	8	1407.1	100	127.2	100	975	100
IgG	0.5	809.7	4.9	27.5	15	1355.6	6.3
	1	1696.9	10.2	40.6	22.2	2782.1	13
	2	4543.8	27.3	68.3	37.3	6661.2	31.2
	4	10003.5	60	110.7	60.5	12605.6	59
	8	16662.8	100	182.9	100	21360.6	100
IgA	0.5	797.4	19.3	31.1	47.2	2056.5	16.1
	1	1529.5	37	41.4	62.8	3869	30.4
	2	2261.3	54.7	48.6	73.3	6648.9	52.2
	4	2320.4	56.2	48.3	73.2	6548.1	51.4
	8	4132.2	100	65.9	100	12744.8	100

Tableau 5 : Optimisation de la concentration d’anticorps secondaires : Signal MFI moyen produit à partir de différentes concentrations d’anticorps secondaires allant de 0,5 μg/mL à 8 μg/mL. La valeur de chaque signal est également présentée sous forme de pourcentage du signal à 8 μg/mL (« Max. ») pour démontrer l’amplitude relative du signal.

		Pointe S1		Membrane		Nucléocapside
	Temps d’incubation (min.)	Ave. IMF	% Max.	Ave. IMF	% Max.	Ave. IMF	% Max.
Igm	15	1185	72.2	40.4	48.9	609.5	53.3
	30	1416.6	86.3	58.4	70.7	894.2	78.2
	60	1324.8	80.7	73.6	89.1	945.6	82.7
	120	1641.2	100	82.6	100	1143.2	100
IgG	15	12917.6	80.5	244.4	44.9	15429.8	80.8
	30	14915.4	92.9	434.7	79.9	18797	98.5
	60	15340.3	95.6	421.4	77.5	18694.4	97.9
	120	16050.3	100	544	100	19085.8	100
IgA	15	3141.9	78.2	75	66.8	9103	86.6
	30	3569.1	88.8	83.9	74.8	9563.8	91
	60	3539.1	88	86	76.6	9555.7	90.9
	120	4020	100	112.2	100	10512.9	100

Tableau 6 : Optimisation du temps d’incubation des anticorps secondaires : Le signal MFI moyen produit à partir de différents temps d’incubation d’anticorps secondaires allant de 15 min à 120 min. La valeur de chaque signal est également représentée en pourcentage du signal à 120 min (« Max. ») pour démontrer l’amplitude relative du signal.

Discussion

L’appréciation d’une réponse immunitaire à l’exposition au SARS-CoV-2, en conjonction avec la surveillance de l’état infectieux basée sur la RT-PCR, a été bien décrite comme une prescription pour clarifier le cours de la guérison après le Covid-19, pour servir de moyen d’identifier le plasma convalescent ayant une valeur thérapeutique potentielle et pour étudier les taux d’infection à l’échelle de la population^10,11. Différents exemples pour comprendre la séroconversion chez les sujets humains comprennent les réseaux de protéines (antigènes)¹², les immunoblots¹³, les constructions immunochromatographiques rapides¹⁴ et les tests immuno-enzymatiques (ELISA)15,16,17. Chacune de ces techniques susmentionnées peut évaluer individuellement plusieurs isotypes d’immunoglobulines avec des modifications mineures. Ces procédures, cependant, ne peuvent pas être pratiquement réutilisées pour permettre l’analyse parallèle de plusieurs isotypes, comme présenté dans ce manuscrit, rendant les facteurs de coût et de débit comme des limites pour leur administration sur une stratégie de test à l’échelle de la population. Plusieurs de ces applications offrent également la possibilité de concaténer des niveaux d’antigènes multiples en parallèle, soit tels que présentés, soit dans des formats modifiés, tels qu’un multiplex ELISA^18,19. Enfin, la plate-forme d’immunobilles offre la possibilité d’évaluer les niveaux de plusieurs antigènes en parallèle ^20,21, mais a été limitée à un seul épitope (c’est-à-dire l’isotype d’immunoglobuline) par essai, à moins toutefois que l’instrument récent doté de capacités de dosage « à double canal » ne soit utilisé.

Dans ce rapport, les protocoles qui établissent la mesure fiable de plusieurs épitopes dans un test d’immunobilles à l’aide de l’instrument en mode « double canal » sont énumérés dans une étude de cas de séroconversion d’individus vaccinés contre le Covid-19. La méthode a démontré une excellente précision (%LES VALEURS GÉNÉRALEMENT <20%) en utilisant des conceptions de tests manuels qui peuvent être améliorées avec l’intégration de systèmes automatisés de laboratoire. La sensibilité et la plage dynamique du test pour tous les analytes et épitopes sélectionnés convenaient aux évaluations de routine. Bien que l’absence d’immunoréactifs IgA et IgM anti-antigènes disponibles dans le commerce ait limité la quantification à l’isotype IgG, une telle restriction n’empêche pas la capacité d’offrir des évaluations semi-quantitatives ou des évaluations relatives à un échantillon spécifique en tant que calibrant^22,23.

Le test d’immunobilles validé a été attribué pour étudier la séroconversion dans une cohorte de personnes immunisées avec le vaccin Covid-19. Comparée à d’autres plates-formes similaires, la famille d’instrumentation permet la prospection de la séroconversion chez des centaines d’individus par jour dans un flux de travail manuel et des milliers par jour dans un schéma automatisé. Dans l’ensemble, ces résultats confirment que l’approche « à double canal » a une sensibilité appropriée pour la description de plusieurs épitopes en parallèle pour le test identique et est viable dans un contexte multianalyte. Une différence de sensibilité aux canaux 1 et 2, telles qu’elles sont réalisées avec la phycoérythrine et les fluorophores Super Bright 436, respectivement, peut justifier la conception d’une expérience spécifique pour s’assurer que des résultats analytiques viables sont acquis pour une expérience donnée. C’est-à-dire que la réservation du canal 1 pour les épitopes ou les analytes d’une prévalence plus faible peut être nécessaire pour maintenir une plage dynamique du test qui inclut les valeurs observées d’inconnues. Au-delà de cette considération, la conception des essais était évidente et devrait être facilement accessible aux laboratoires ayant des capacités d’analyse limitées. Certes, cette considération devrait être prise en compte lors de l’examen des interférences des canaux 1 à 2, comme nous l’avons noté à la figure 5, selon laquelle les interférences provenant d’isotypes d’abondance plus élevée peuvent entraîner des erreurs analytiques trompeuses pour ceux qui sont beaucoup plus en abondance lorsqu’elles sont mesurées dans un format à deux canaux. Ce potentiel d’interférence avec des situations avec des concentrations d’analyte très différentes peut représenter une limitation importante de l’approche s’il n’est pas correctement géré dans la phase de conception de l’essai.

En conclusion, une méthode pour mesurer rapidement les titres d’anticorps des principaux isotypes d’immunoglobulines associés à une réponse immunitaire à l’infection ou à la vaccination contre le Covid-19 a été présentée. L’application de cette approche de manière longitudinale pour évaluer la séroconversion peut fournir des informations qui pourraient être mieux utilisées pour gérer et / ou surveiller l’évolution de la maladie ou, alternativement, guider les programmes potentiels de vaccin de rappel Covid-19.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
384-well black side polystyrene microtiter plates	Thermo Fisher	12-565-346
Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)	Prepared in house
Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)	Prepared in house
Bovine Serum Albumin, heat shock fraction	MilliporeSigma	A-7888-50G
Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)	Prepared in house
COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)	MyBioSource	MBS8574735
Disposable pipette tips
EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)	Thermo Fisher	PIA35391
Goat Albumin, Fraction V Powder	MilliporeSigma	A2514-1G
IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal	Thermo Fisher	OB205009
IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal	Thermo Fisher	OB204009
IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal	Thermo Fisher	OB403009
IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal	Thermo Fisher	OB202009
IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4	Thermo Fisher	62999842
Instrument Analyzer	Luminex Corp.	INTELLIFLEX-RUO
Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Fisher	13-698-794
MagPlex-C Microspheres, Region XXX	Luminex Corp.	MC10XXX-01
MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)	MilliporeSigma	M2933
Microplate aluminum sealing tape	Thermo Fisher	07-200-683
Polysorbate-20	Thermo Fisher	BP337-500
Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2	Thermo Fisher	50-751-7328
Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)	Prepared in house
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)	Sino Biologicals	40588-V08B
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)	Sino Biologicals	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb	Sino Biologicals	40592-T62
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb	Sino Biologicals	40588-R0004
SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb	ProSci	10-516
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	Thermo Fisher	PIA39269
Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)	Prepared in house
Water, LC/MS grade	Thermo Fisher	W-64