Avant de commencer préparer: <ul><li> Errant yhird stade drosophile larves </li><li> HL3.1 (modification hémolymphe-like) solution de </li><li> Plaques Sylgard dissection (caoutchouc de silicone transparent) préparés dans les petites (35 x 10 mm) des boîtes de Petri en plastique en utilisant des méthodes décrites par Brent et McCabe (2008) 3. </li><li> Couper la dissection broches courtes </li><li> Stimuler les pipettes d&#39;électrode </li><li> Pipettes d&#39;enregistrement de Sharp </li></ul> HL3 Solution: <ol><li> Pendant les dissections et les expériences d&#39;électrophysiologie, de la larve sont immergés dans une solution à 2 HL3.1 qui contient (en mM): 70 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 tréhalose, le saccharose 115, et 5 HEPES, pH 7,2. </li><li> Les concentrations de CaCl 2 sont ajoutés à la solution HL3.1 pour fournir la concentration requise de Ca2 +. <ul><li> Dissections larves sont réalisées à faible teneur en Ca 2 + concentration (pour éviter la contraction musculaire) à l&#39;aide HL3.1 + 0,25 mM de CaCl2, conservés sur la glace. </li><li> Expériences électrophysiologiques sont généralement enregistrés dans HL3.1 + 1 mM de CaCl2, mais cela peut être ajusté de 0,4 à 1 mM de Ca 2 + au besoin. </li></ul></li><li> La solution est stérilisée par filtration HL3.1 avant utilisation, et conservés à 4 ˚ C. </li></ol> Préparation de la stimulation et l&#39;enregistrement des pipettes: <ol><li> Pipettes d&#39;enregistrement et de stimulation sont tirés avec une Sutter P-2000 Laser micropipette extracteur base en utilisant les paramètres suivants: chaleur = 390, Filament = 4, Vitesse = 35, Delay = 200 et Pull = 0. </li><li> Électrodes de stimulation sont préparés à partir de capillaires à paroi mince en verre borosilicate avec des extrémités larges qui ont été légèrement plus grand que la largeur de la axones moteurs coupés. Les extrémités en forme sont à Facettes pour donner une finition lisse (en utilisant une pipette Narashiga polisseuse), pour minimiser les dommages au nerf. Électrodes de stimulation sont remplis avec une solution de bain (HL3.1 + 1 mM de Ca 2 +). </li><li> Les électrodes d&#39;enregistrement sont préparés à partir de 1,2 mm de verre borosilicate, qui est tiré de former une pipette forte (30-60 mQ), et rempli de 3M KCl. </li></ol> Partie 1: Dissection des larves de drosophile <ol><li> Troisième stade larvaire errance sont disséqués afin d&#39;exposer les muscles de la paroi du corps, comme décrit précédemment 4. </li><li> Les dissections sont réalisées dans HL3.1 + 0,25 mM de Ca 2 + sur des plaques de silicone de petite taille (35 x 10 mm). HL3.1 solution doit être glacée pour les dissections afin d&#39;anesthésier la larve, et est conservé sur la glace avant et pendant les dissections. </li><li> Les larves sont disséqués en utilisant des méthodes décrites par Brent et McCabe (2008), qui est modifié pour les expériences d&#39;électrophysiologie en ajoutant 0,25 mM de Ca 2 + à la solution HL3.1 la dissection, et utilisant des goupilles de dissection courte (environ 2 mm de longueur) qui sont moins susceptible de heurter l&#39;objectif du microscope et les électrodes lors d&#39;une expérience. </li><li> Après dissection, les axones moteurs de la larve sont coupés. Cela se fait en douceur la tenue de la CNS et l&#39;élevant légèrement pour les nerfs périphériques qui innervent les muscles postérieurs au ganglion ventral peut être coupé sans endommager les muscles (figure 1). Le cerveau est alors retiré. </li><li> La préparation des larves disséquées est lavé deux fois avec HL3.1 + 1 mM de Ca 2 +. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1109/fig1.png" alt="Figure 1" /> Figure 1. Schéma montrant les étapes de la coupe du axones moteurs de larves disséquées. Le CNS est soulevé avec des pinces et des axones moteurs sont coupés à la base du cerveau. Partie 2: enregistrements intracellulaires de cellules musculaires larvaires. <ol><li> Placer la plaque sur le microscope de dissection d&#39;électrophysiologie et de submerger la préparation avec HL3.1 + 1,5 mM de Ca 2 + et de fixer l&#39;électrode de bain donc il est en contact avec la solution. </li><li> Toutes les expériences sont réalisées sur le muscle 6 dans le troisième segment abdominal (A3). Les nerfs périphériques qui innervent les muscles sont stimulés à l&#39;aide d&#39;une électrode d&#39;aspiration 5. </li><li> Position l&#39;électrode de stimulation dans le premier plat pour éviter les vibrations lorsque l&#39;électrode intracellulaire est en place. Placer l&#39;électrode de stimulation dans le voisinage proche de la motoneurones innervant les muscles 6 et appliquer l&#39;aspiration au doux jusqu&#39;à ce que le nerf coupé est à l&#39;intérieur de la pipette en verre. Soyez prudent de ne pas étirer les nerfs lorsque l&#39;aspiration est appliquée. Levez la pipette légèrement de sorte qu&#39;il ne touche pas le muscle et la position qu&#39;elle sorte qu&#39;il n&#39;est pas en tirant sur les fibres nerveuses coupées (figure 2). <img src="/files/ftp_upload/1109/fig2.png" alt="Figure 2" width="600" height="296" /> Figure 2. Un schéma de la musculature et les neurones moteurs innervant d&#39;un segment abdominal de la larve de drosophile. La position de la pipette stimulant et nerfs sectionnés et l&#39;électrode d&#39;enregistrement en position à six muscles sont illustrés. </li><li> Intraenregistrements cellulaires sont faites avec des microélectrodes forte remplie avec 3 M de KCl. Position de l&#39;électrode d&#39;enregistrement au dessus du centre de muscle 6 sur le troisième segment abdominal (A3) et régler le décalage d&#39;entrée afin qu&#39;il indique zéro pour la solution de bain. Abaisser lentement l&#39;électrode et l&#39;approche du muscle sous grossissement optique haute jusqu&#39;à ce qu&#39;elle touche la surface du muscle. Regardez l&#39;oscilloscope pour confirmer que le muscle a été pénétrée. Le potentiel de repos membranaire doit être au moins à -60 mV, ou l&#39;animal ne doit pas être utilisé. Sporadiques potentiels plaque motrice miniature doit maintenant être visible. Laisser la cellule se stabiliser pendant une minute avant de commencer à enregistrer. </li><li> Les changements dans le potentiel de membrane sont détectés avec un stade Axon tête SH-2A 2B et un amplificateur Axoclamp et enregistré avec Clampex v 8.2.0.235 (Axon Instruments). Le 2B Axoclamp est interfacée à un ordinateur qui exécute un logiciel pClamp et fonctionne en conjonction avec l&#39;interface Digidata 1322A. </li><li> Les cellules ont été enregistrées pendant 3 minutes sans aucun stimulus pour mesurer les réponses mEJP. Des traces ont été analysés en utilisant des logiciels d&#39;analyse Mini (Synaptosoft, v 6.0.3) et l&#39;amplitude et la fréquence mEJP déterminée. </li></ol> Stimulation du nerf: <ol><li> La fin coupé du neurone moteur est stimulé par une série d&#39;impulsions de tension carrée (0,3 ms) à une intensité qui est suffisant pour les deux axones moteurs, pour évoquer des réponses cohérentes dans le muscle entier. </li><li> Le stimulus est généré avec le Maître-8 générateur d&#39;impulsions, qui est programmé pour délivrer des impulsions en permanence en fonction de la durée et des intervalles de temps. </li><li> Prévoyez cinq secondes entre les stimuli pour la récupération synaptique à la JNM. </li><li> Lors de la détermination de la force du stimulus, commencez par le bas niveau et d&#39;augmenter l&#39;intensité lentement sur plusieurs essais. L&#39;intensité du stimulus minimum qui se traduit par une réponse évoquée doit être utilisé dans les expériences. </li><li> Lorsque l&#39;intensité du stimulus approprié est atteint, il devrait y avoir une EJP composé et une contraction musculaire provoquée par le stimulus. </li><li> Marquer au moins 10 des potentiels évoqués de chaque muscle et la moyenne des amplitudes. </li></ol> Partie 3: Résultats Représentant <img src="/files/ftp_upload/1109/fig3.png" alt="Figure 3" width="600" height="358" /> Figure 3. Représentant enregistrement intracellulaire du muscle 6 montrant l&#39;EJP évoqué est la réponse à une stimulation électrique du nerf segmentaire, et les potentiels sporadiques plaque motrice miniature, ou de mEJP. Amplitudes EJP dans le muscle sain 6 de type sauvage larves, comme Canton S, sont généralement autour de 40 mV et les amplitudes mEJP entre 1-3 mV.

<ol>
	<li>Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+ultrastructure+of+synaptic+terminals+on+ventral+longitudinal+abdominal+muscles+in+Drosophila+larvae.">Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 24 (8), 1008-1024 (1993).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li><li>Estes, P. S., Roos, J., van der Bliek, A., Kelly, R. B., Krishnan, K. S., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+of+dynamin+within+individual+Drosophila+synaptic+boutons+relative+to+compartment-specific+markers.">Traffic of dynamin within individual Drosophila synaptic boutons relative to compartment-specific markers.</a> J Neurosci. 16, 5443-5456 (1996).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+of+Drosophila+larvae.">Protocol for dissection of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster.">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol (Lond). 262, 189-214 (1976).</li><li>Katz, L. C., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+activity+and+the+construction+of+cortical+circuits.">Synaptic activity and the construction of cortical circuits.</a> Science. 274, 1133-1138 (1996).</li></ol>

Les méthodes décrites ici fournissent un moyen rapide et relativement large pour détecter des changements dans la fonction synaptique à la JNM. La possibilité d&#39;effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur des animaux intacts in vivo, et effectuer des manipulations génétiques ou pharmacologiques, font la drosophile un modèle animal idéal pour étudier les aspects physiologiques et génétiques de la neurotransmission. Comme les cellules musculaires sont très grandes...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Small Petri dishes (35 x 10 mm)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>1008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SYLGARD 182 Silicone Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning Corporation</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carl Zeiss</td>
<td>475002-9902</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Light for microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Schott</td>
<td>KLI500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>pClamp 9 software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>PCLAMP 9 STANDARD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissection scissors: 3mm Vannas Spring Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont SS Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11200-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thin-walled borosilicate glass capillaries, with filament (1.0 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Borosilicate glass capillaries, with filament (1.2 mm, 4 in)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
<td>1B120F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sutter P-2000 Laser Based Micropipette Puller </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Model P-2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipette polisher</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishiga</td>
<td>MF-83</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axon HS-2A head stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>Model HS-2A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Axoclamp 2B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>AXOCLAMP 2B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clampex Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axon CNS, Molecular Devices</td>
<td>v 8.2.0.235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini analysis software. v 6.0.3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Synaptosoft</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brownlee Precision Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brownlee</td>
<td>Model 410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baker</td>
<td>4058-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>p-9333 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NaHCO3</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>s6297-1kg</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trelahose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>TO167</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>bp220-212 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>h-3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MgCl-6H2O</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>m2670-1kg </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>c79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Master-8 Pulse Generator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>A.M.P.I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibration table for electrophysiology set up</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical manufacturing corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Faraday Cage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the nmj of drosophila larvae

Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes électrophysiologiques pour l&#39;enregistrement de la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire (JNM) de la larve de drosophile. Le système des larves neuromusculaire est une synapse modèle pour l&#39;étude de la physiologie synaptique et la neurotransmission, et est un précieux outil de recherche qui a défini la génétique et est accessible aux manipulations expérimentales. Les larves peuvent être disséqués pour exposer le corps mur de la musculature, système nerveux central, et les nerfs périphériques. Les muscles de la drosophile et de leur modèle d&#39;innervation sont bien caractérisés et les muscles sont faciles d&#39;accès pour l&#39;enregistrement intracellulaire. Muscles individuels peuvent être identifiés par leur localisation et l&#39;orientation dans les 8 segments abdominaux, avec chacun 30 muscles agencés selon un motif qui se répète dans des segments A2 - A7. Disséqué larves de drosophile sont des muscles minces et individuels et des faisceaux d&#39;axones des neurones moteurs peuvent être visualisés par transillumination<sup&gt; 1</sup&gt;. Les constructions transgéniques peuvent être utilisés pour marquer les cellules cibles pour l&#39;identification visuelle ou pour la manipulation des produits de gènes dans des tissus spécifiques. Dans les larves, les potentiels de jonction excitateurs (EJPs) sont générés en réponse à la libération vésiculaire de glutamate par les motoneurones dans la synapse. Dans les larves disséqué, l&#39;EJP peuvent être enregistrées dans le muscle avec une électrode intracellulaire. Les potentiels d&#39;action peuvent être artificiellement évoqué dans les neurones moteurs qui ont été coupés postérieure au ganglion ventral, aspiré dans une pipette en verre par aspiration douce et stimulée par une électrode. Ces neurones moteurs ont distinctes seuils tirs lorsqu&#39;ils sont stimulés, et quand ils le feu simultanément, ils génèrent une réponse dans le muscle. Les signaux transmis à travers la synapse JNM peuvent être enregistrées dans les muscles que les neurones moteurs innervant. Le EJPs et miniature potentiels de jonction excitateurs (mEJPs) sont considérés comme des changements dans le potentiel de membrane. Réponses électrophysiologiques sont enregistrés à température ambiante dans l&#39;hémolymphe-minimal modifié comme solution de<sup&gt; 2</sup&gt; (HL3) qui contient 5 mg mM<sup&gt; 2 +</sup&gt; Et 1,5 mM de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;. Les changements dans l&#39;amplitude de EJPs évoqués peuvent indiquer des différences dans la fonction synaptique et la structure. Enregistrements numérisés sont analysés pour EJP amplitude, la fréquence et l&#39;amplitude mEJP, et le contenu quantique.

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Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Nous décrivons ici les méthodes électrophysiologiques pour mesurer la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire de larve de drosophile. Libération évoquée est initiée artificiellement par la stimulation des axones des neurones moteurs et la transmission à travers la JNM peut être mesurée par la réponse postsynaptique évoquée dans le muscle.

Méthodes électrophysiologiques pour l&#39;enregistrement du potentiel synaptique de la JNM des larves de drosophile

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

electrophysiological-methods-for-recording-synaptic-potentials-from

Research

JoVE Journal

Biology

20.8K vues.  Columbia University College of Physicians and Surgeons. Nous décrivons ici les méthodes électrophysiologiques pour mesurer la transmission synaptique à la jonction neuromusculaire de larve de drosophile. Libération évoquée est initiée artificiellement par la stimulation des axones des neurones moteurs et la transmission à travers la JNM peut être mesurée par la réponse postsynaptique évoquée dans le muscle.

Vidéo: Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

Dissection de disques imaginaux de la 3ème Instar larves de drosophile

Recherche

Biologie

Methods for Patch Clamp Capacitance Recordings from the Calyx

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. Electrical recordings from the presynaptic terminal allow the measurement of action potentials, calcium channel currents, vesicle fusion (exocytosis) and subsequent membrane uptake (endocytosis). The fusion of vesicles containing neurotransmitter causes the vesicle membrane to be added to the cell membrane of the calyx. This increase in the amount of cell membrane is measured as an increase in capacitance. The subsequent reduction in capacitance indicates endocytosis, the process of membrane uptake or removal from the calyx membrane. Endocytosis, is necessary to maintain the structure of the calyx and it is also necessary to form vesicles that will be filled with neurotransmitter for future exocytosis events. Capacitance recordings at the calyx of Held have made it possible to directly and rapidly measure vesicular release and subsequent endocytosis in a mammalian CNS nerve terminal. In addition, the corresponding postsynaptic activity can be simultaneously measured by using paired recordings. Thus a complete picture of the presynaptic and postsynaptic electrical activity at a central nervous system synapse is achievable using this preparation. Here, the methods for slice preparation, morphological features for identification of calyces of Held, basic patch clamping techniques, and examples of capacitance recordings to measure exocytosis and endocytosis are presented.

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal.

Méthodes pour les enregistrements patch clamp Capacité du calice

We demonstrate the basic techniques for presynaptic patch clamp recording at the calyx of Held, a mammalian central nervous system nerve terminal. ...

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

Drosophile larvaire JNM Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 31 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. Immunohistochemistry can be used to clearly image the components of the NMJ. In this article, we demonstrate how to use antibody staining to visualize the Drosophila larval NMJ.

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

This protocol demonstrates how to perform immunohistochemistry on dissected Drosophila larva.

Drosophile larvaire JNM immunohistochimie

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available to evoke excitatory junctional potentials (EJPs) in this preparation involves the use of suction electrodes. In both research and teaching labs, students often have difficulty maneuvering and manipulating this type of stimulating electrode. In the present work, we show how to remotely stimulate synaptic potentials at the larval NMJ without the use of suction electrodes. By expressing channelrhodopsin2 (ChR2) 4,5,6 in Drosophila motor neurons using the GAL4-UAS system 7, and making minor changes to a basic electrophysiology rig, we were able to reliably evoke EJPs with pulses of blue light. This technique could be of particular use in neurophysiology teaching labs where student rig practice time and resources are limited.

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

This procedure uses a blue light-activated algal channel and cell-specific genetic expression tools to evoke synaptic potentials with light pulses at the neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila larvae. This technique is an inexpensive and easy-to-use alternative to suction electrode stimulation for synaptic physiology studies in research and teaching laboratories.

Channelrhodopsin2 stimulation médiée potentiels synaptiques au Drosophile Jonctions neuromusculaires

The Drosophila larval neuromuscular preparation has proven to be a useful tool for studying synaptic physiology1,2,3. Currently, the only means available ...

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

This technique exposes the Drosophila embryonic neuromusculature for immunohistochemistry or electrophysiological recording. It is useful for studying early events in neuromuscular development or performing electrophysiology in mutants that cannot hatch.

La récolte et la préparation Drosophile Les embryons destinés à l&#39;enregistrement électrophysiologique et autres procédures

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite ...

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila is a premier genetic model for the study of both embryonic development and functional neuroscience. Traditionally, these fields are quite isolated from each other, with largely independent histories and scientific communities. However, the interface between these usually disparate fields is the developmental programs underlying acquisition of functional electrical signaling properties and differentiation of functional chemical synapses during the final phases of neural circuit formation. This interface is a critically important area for investigation. In Drosophila, these phases of functional development occur during a period of &lt;8 hours (at 25&deg;C) during the last third of embryogenesis. This late developmental period was long considered intractable to investigation owing to the deposition of a tough, impermeable epidermal cuticle. A breakthrough advance was the application of water-polymerizing surgical glue that can be locally applied to the cuticle to enable controlled dissection of late-stage embryos. With a dorsal longitudinal incision, the embryo can be laid flat, exposing the ventral nerve cord and body wall musculature to experimental investigation. Whole-cell patch-clamp techniques can then be employed to record from individually-identifiable neurons and somatic muscles. These recording configurations have been used to track the appearance and maturation of ionic currents and action potential propagation in both neurons and muscles. Genetic mutants affecting these electrical properties have been characterized to reveal the molecular composition of ion channels and associated signaling complexes, and to begin exploration of the molecular mechanisms of functional differentiation. A particular focus has been the assembly of synaptic connections, both in the central nervous system and periphery. The glutamatergic neuromuscular junction (NMJ) is most accessible to a combination of optical imaging and electrophysiological recording. A glass suction electrode is used to stimulate the peripheral nerve, with excitatory junction current (EJC) recordings made in the voltage-clamped muscle. This recording configuration has been used to chart the functional differentiation of the synapse, and track the appearance and maturation of presynaptic glutamate release properties. In addition, postsynaptic properties can be assayed independently via iontophoretic or pressure application of glutamate directly to the muscle surface, to measure the appearance and maturation of the glutamate receptor fields. Thus, both pre- and postsynaptic elements can be monitored separately or in combination during embryonic synaptogenesis. This system has been heavily used to isolate and characterize genetic mutants that impair embryonic synapse formation, and thus reveal the molecular mechanisms governing the specification and differentiation of synapse connections and functional synaptic signaling properties.

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Electrophysiological recordings from Drosophila embryos allow analyses of developing muscle and neuron electrical properties, as well as characterization of functional synaptogenesis at the glutamatergic neuromuscular junction and central cholinergic and GABAergic synapses.

Enregistrement électrophysiologique dans le Drosophile Embryon

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

Voir historique et démonstration de physiologie à l&#39;JNM du muscle Opener écrevisses

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

L&#39;imagerie in vivo chez la drosophile larves Intact au sub-cellulaire Résolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...