L’AVC ischémique est une condition clinique caractérisée par l’hypoperfusion du tissu cérébral et entraîne une perte neuronale. De nombreuses preuves suggèrent que l’interaction entre les cellules gliales et urinoirs exercent les effets de pression après un événement ischémique. Afin d’explorer les mécanismes de protection potentiels, il est important de développer des modèles qui permettent d’étudier les interactions neurono-glia dans un environnement ischémique.
Ici, nous présentons une approche simple pour isoler les astrocytes et les neurones du cortex embryonnaire du rat, et qu’en utilisant un milieu culturel spécifique permet l’établissement de neurones ou de cultures enrichies d’astrocytes ou de cultures néo-gliales à haut rendement et reproductibilité. Pour étudier la tige croisée entre les astrocytes et les neurones, nous proposons une approche, basée sur un système de co-culture, dans lequel les neurones cultivés dans les glissements de couverture sont maintenus en contact avec un monocouche d’astrocytes plaqués dans des plaques multi-puits. Les deux cultures sont maintenues une partie par de petites sphères de paraffine.
Cette approche permet une manipulation indépendante et l’application d’un traitement spécifique à chaque type de cellule, ce qui représente un avantage dans de nombreuses études. Pour simuler ce qui se produit lors d’un AVC ischémique, les cultures sont soumises à un protocole de privation d’oxygène et de glucose. Ce protocole représente un outil utile pour étudier le rôle des interactions neurono-gliales dans les accidents vasculaires cérébraux ischémiques.
Commencez par l’isolation du cortex embryonnaire du rat. Les embryons ont été obtenus auprès d’une famille de rats à 15 jours de gestation et sont placés dans un tube falcon stérile contenant du PBS. Toujours à l’intérieur des embryons de sachet de jaune sont placés à l’intérieur d’une boîte de Pétri contenant pbs froid.
À l’aide de ciseaux et de pinces à épiler, le sac jaune est cassé, et l’embryon est enlevé et placé dans une autre boîte de Pétri contenant du PBS froid sur un sac de glace. Il est nécessaire d’être très prudent lors de la rupture du sac jaune de ne pas endommager l’embryon. Placez l’embryon sous un microscope disséquant, fixez doucement l’embryon à l’aide d’un twizzer.
L’incision initiale doit être parallèle au cortex. Veillez à ne pas décapiter l’animal. Le cuir chevelu et sont soigneusement enlevés pour ne pas endommager le tissu cérébral cortical.
Cette incision suivante sépare le cortex. Enlever les vaisseaux sanguins présents dans le tissu. Enfin, à l’aide d’une pipette, transférer le tissu cortical dans un tube Falcon avec PBS.
La suspension à cellule unique est obtenue par digestion mécanique du tissu cérébral cortical à l’aide de pointes avec un diamètre décroissant. Assurez-vous que le tissu est bien homogénéisé Après la digestion, centrifuger le matériau à 400 Gs pendant trois minutes. Jetez le supernatant et réutilisez les sédiments dans le milieu de la culture, préalablement réchauffé à 37 degrés.
Calculer le nombre total de cellules présentes dans la suspension à l’aide d’une chambre Neubauer et préparer la dilution pour la densité cellulaire adéquate. Enfin, ensemencer les cellules dans le multi-puits et incuber à 37 degrés. Afin de préparer le matériau pour le système de co-culture, chauffer la paraffine dans un bloc chauffant jusqu’à ce qu’elle devienne liquide.
Puis, à l’aide d’une pipette pasteur en verre stéréo préparer de petites sphères sur les feuillets de couverture qui ont été précédemment placés dans un multi-puits, et recouvert de Poly-D-Lysine. 24 heures avant que les deux cultures soient mises en contact, changer le milieu de culture des neurones et des astrocytes pour le compléter NBM avec ou sans chaleur inactivée FBS. Lorsque les deux cultures sont prêtes à l’emploi, transférer le neurone, assis dans le couvercle glisse avec des sphères de paraffine à des puits contenant des astrocytes à l’aide d’une pince à épiler précédemment immergé dans 70% d’éthanol.
Après avoir mis les deux types de cellules en contact, attendez de huit à 12 heures, puis commencez les différents stimuli et procédures. La privation d’oxygène et de glucose est effectuée dans une culture avec sept jours de croissance. Enlevez le milieu de culture, et lavez les cellules deux fois avec le milieu de HBSS sans supplémentation de glucose.
Assurez-vous que tout le milieu contenant du glucose est lavé. Sceller la chambre d’hypoxie et ajouter le mélange de gaz contenant 95% d’azote et 5% de dioxyde de carbone pendant quatre minutes avec un débit de 20 litres pendant quelques minutes afin de remplacer l’oxygène présent à l’intérieur de la chambre. Ensuite, arrêtez le flux et placez la chambre hypoxie dans un incubateur à 37 degrés.
Après la période de privation d’oxygène et de glucose, remplacer le milieu, HBSS sans supplémentation en glucose avec le milieu de culture approprié pour les procédures restantes et incuber les cellules à 37 degrés. Afin de caractériser le type de culture corticale, nous avons effectué l’immunohistochimie dans les trois types de cultures corticales pour évaluer le nombre de cellules qui ont exprimé GFPA ou MAP2, qui sont des marqueurs largement utilisés pour les cellules astrocytiques et neuronales respectivement. Ces analyses ont révélé que lorsque ce protocole, nous avons été en mesure d’obtenir une culture pure enrichie d’astrocytes avec environ 97% des cellules exprimant GFAP.
En ce qui concerne la culture enrichie en neurones, nous avons vérifié environ 78% des cellules exprimant MAP2. Cependant, nous identifions environ 18% des cellules négatives GFAP et MAP2. Pour la culture corticale neuron-glia, Il a été observé qu’environ 49% des cellules sont MAP2 positif.
31% sont positifs au GFAP. Et 20%, ils ne sont pas responsables du GFAP ou du MAP2. Sept jours après l’établissement cortical de culture, la culture de neurone-glia et la culture neuron-enrichie ont été soumises à une procédure d’OGD pendant 4 et 6 heures.
Après cette procédure, les cellules ont été étiquetées avec MAP2 et puis le nombre de cellules positives MAP2 ont été quantifiées à l’aide de microscopie de fluorescence. Dans la culture neuron-glia, il a été observé une diminution d’environ 30% du nombre de neurones, lorsque la culture a été soumise à une période d’OGD de 4 heures. Après une période d’OGD de 6 heures, l’extension de la lésion augmente, atteignant environ 60% de la perte neuronale.
En ce qui concerne la culture enrichie des neurones exposés à l’OGD, il a été observé environ 41% et 64% de diminution du nombre de cellules MAP2. En outre, il a été observé que dans la culture neurone-enrichie, il y avait une légère augmentation de l’extension de blessure par rapport à la culture de neurone-glia également exposée à l’OGD pendant 4 heures. En conclusion, voici un modèle in vitro pour étudier l’AVC ischémique établi d’une manière simple, rapide et coûteuse et reproductible.
En outre, la méthode décrite permet également d’implémenter des neurones et des cultures primaires enrichies d’astrocytes, mais aussi une culture neuronale-gliale. Ainsi, fournir un excellent modèle in vitro pour la modélisation de plusieurs maladies du cerveau avec un niveau plus élevé de complexité, que les lignées cellulaires immortalisées et les cultures neuronales ou gliales pures.
