Ce protocole fournit une technique rigoureuse et reproductible pour l’extraction et l’isolement des petites vésicules extracellulaires provenant de spécimens de tissus entiers pour les analyses ex vivo en aval. Avec parmi les niveaux les plus élevés de pureté actuellement réalisables, cette méthode facilite la caractérisation directe morphologique, immunophéotypique et profonde des vésicules interstitielles sécrétées en divers spécimens de tissus, y compris les tumeurs. Ici, nous démontrons l’isolement des VE de tissu des spécimens de tumeur de cerveau et de poumon.
Cependant, cette technique peut être appliquée aux études utilisant divers spécimens bénins, ou d’autres tumeurs aussi bien. Pour commencer, préparez 10 millilitres de tampon de dissociation dans le milieu Hibernate-E pour chaque 0,4 à 1,0 gramme de tissu. Ajouter les tissus entiers frais ou congelés au tampon dans un tube de 50 millilitres et incuber dans un bain d’eau chaude à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Après cela, ajouter des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase pour une concentration finale de 1 x dans le tampon de dissociation. Versez la solution avec le tissu dans un ajustement lâche vers le bas homogénéiseur. Utilisez environ 30 coups lents par échantillon pour dissocier doucement le tissu.
Ensuite, transférez le tissu dissocié et la solution tampon dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugeuse à 500x g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour pelleter les cellules et les fibres restantes ou des fragments de tissu cohésif. Transférer le supernatant dans un tube conique propre de 50 millilitres, et la centrifugeuse à 2000x g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter et jeter les gros débris cellulaires.
Transférez ce supernatant dans un tube conique propre de 50 millilitres, et centrifugeuse à 10 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant 40 minutes pour granuler les vésicules plus grandes non désirables ou les petits corps apoptotiques. Décanter le supernatant à travers un filtre de 0,45 micromètre dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 millilitres. Ensuite, ultracentrifugez l’échantillon à 100 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant deux heures, pour pelleter les petits VE.
Décanter le supernatant et laisser les tubes d’ultracentrifugation inversés pendant cinq à dix minutes, en tapant fréquemment pour enlever tout liquide résiduel sur les côtés des tubes. Ensuite, resuspendez la pastille EV en tampon de saccharose molaire de 1,5 millilitres de 0,25. Couvrez les tubes avec Parafilm, puis vortex les VE dans la solution.
Faire basculer les tubes d’ultracentrifugeuse de 10 à 15 minutes à température ambiante. Et puis vortex une fois de plus. Centrifugez brièvement les tubes à une vitesse inférieure à 1000x g pour récupérer la suspension liquide au fond du tube.
Au besoin, conserver la suspension à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Tout d’abord, ajouter 1,5 millilitres de 60% iodixanol aux 1,5 millilitres du tampon tris saccharose qui contient les VE pour créer une solution finale contenant 30% iodixanol. Pipette de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger la solution.
Transférez cette solution au fond d’un tube d’ultracentrifugation de 5,5 millilitres. Ensuite, mélangez le stock de 60% iodixanol avec de l’eau ultra pure pour préparer au moins 1,5 millilitres d’une solution 20% et 10% iodixanol. À l’aide d’une seringue et d’une aiguille de calibre 18, mesurez 1,3 millilitres de la solution iodixanol à 20 % et superposez-la soigneusement au-dessus du gradient inférieur.
Gardez le biseau de l’aiguille en contact avec l’intérieur du tube, juste au-dessus du ménisque et ajoutez la solution goutte sage pour éviter de mélanger les couches à l’interface de densité. Ensuite, superposer 1,2 millilitres de la solution 10% iodixanol sur le dessus de la couche de 20%, en utilisant la même technique. Équilibrez soigneusement et chargez les tubes d’ultracentrifugation dans des seaux de rotor.
Réglez les vitesses d’accélération et de décélération d’un rotor de seau de balançoire aux taux minimaux, et la centrifugeuse à 268 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant 50 minutes. Pendant que l’échantillon est centrifugé, étiquetez 10 tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour chaque échantillon qui correspondront à des fractions d’un à dix du gradient de densité. Une fois la centrifugation terminée, retirez doucement les tubes des seaux du rotor et placez-les dans un support stable.
Pipette 10 fractions de série de 490 microlitres du haut du gradient dans les tubes correspondants. À l’aide d’un réfractomètre, mesurer les indices réfractifs des fractions. Ensuite, transférez chaque fraction dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 millilitres.
Ajouter cinq millilitres de 1x PBS à chaque tube et pipette de haut en bas lentement pour mélanger. Ajouter six millilitres supplémentaires de 1x PBS sur le dessus du tube, et mélanger soigneusement à nouveau. Ultracentrifugez les tubes à 100 000 x g et à quatre degrés Celsius pour re-pelleter les petites vésicules.
Décanter le supernatant et appuyez sur les tubes secs avant de lyser les vésicules pour l’analyse des protéines ou de réutiliser les VE pour l’analyse morphologique. Pour lyse les VE pour l’analyse des protéines, ajouter 40 microlitres de tampon de lyse forte contenant inhibiteur de la protéase pour les granulés EV. Placez le parafilm sur chaque tube et vortex vigoureusement.
Ensuite, faire basculer les tubes pendant 20 minutes à température ambiante et vortex à nouveau. Centrifugez brièvement l’échantillon à 1 000 x g pendant 30 à 60 secondes pour récupérer tout le volume de l’échantillon. Transférez chaque échantillon dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et rangez-le à une température comprise entre 20 et 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour un traitement ultérieur.
Pour préparer les lysates purifiés à l’analyse des immunoblots, ajoutez 5 x tampon d’échantillon laemmli aux échantillons pour une concentration finale de 1x. Faire bouillir l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Ensuite, chargez un volume égal de fractions d’un à 10 dans un gel de page SDS de 10%.
Chargez une masse égale d’homogénéité tissulaire. Effectuez l’analyse de l’électrophoresis et de la tache occidentale pour confirmer les protéines EV dans les lysates purifiés et comparer l’abondance relative d’EV en fractions. Dans cette étude, les vésicules extracellulaires sont extraites et purifiées à partir de tissus entiers.
Après l’ultracentrifugation du gradient iodixanol de 10 à 30 %, on peut voir une population de VE légers migrer jusqu’à la fraction deux, tandis qu’une population de VE denses peut être vue migrant jusqu’à la fraction cinq, selon le type de tissu. Les immunoblots représentatifs des fractions de gradient montrent la séparation et la purification efficaces des petits VE dérivés de tumeur dans la fraction cinq. Notamment, les spécimens de tumeur de poumon semblent enrichis en VE denses comparés aux VE légers qui ont été précédemment récoltés du tissu entier de cerveau.
L’analyse représentative de suivi des nanoparticules et la microscopie électronique des vésicules dérivées des tissus dans la vésicule prédominante contenant une fraction démontrent l’enrichissement et la préservation de vésicules entières. Compatible avec la taille et la structure connues des petits VE. Les VE interstitiels représentent des cibles prometteuses pour le développement de nouveaux tests diagnostiques ou pronostiques de biomarqueurs.
Cette technique fournit aux chercheurs des outils pour l’extraction et la purification des vésicules pour l’utilité en aval. Après l’extraction des VE de tissu entiers ou lysed, la caractérisation large des vésicules comprenant les analyses protéomiques, génomiques, et lipidomiques peut être exécutée. En outre, des échantillons peuvent être utilisés pour des approches plus ciblées.
Les vésicules isolées directement des échantillons de tissus peuvent fournir un aperçu supplémentaire des mécanismes de la maladie, y compris la genèse tumorale, et peuvent fournir des outils diagnostiques ou pronostiques importants à l’avenir.
