<ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Préparation de la lésion fantôme (phantom préparer environ 38 à 48 heures avant la session pratique réelle de la compétence FNA (figure 1) ou utiliser prêt à utiliser &quot;AV fantôme» de la Source FNA, Etats-Unis. La lésion fantôme (stocké sous réfrigération sans congélation) peut être conservés préparés, même 3 à 4 jours avant la pratique de session. </li><li> Pratiquer FNA compétence: Bien que nous l&#39;avons démontré en utilisant la procédure de THFV Shidham (Tissue Harvester avec vanne fonctionnelle) (Source FNA, USA), tout autre système FNA peut être utilisé pour pratiquer (figure 2). </li><li> Diffusion et traitement de la ponction sur les lames de verre (figure 3). </li></ol> Matériel requis <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Effacer le caoutchouc de silicone mastic-disponibles dans de nombreux magasins d&#39;amélioration de la construction / home. De nombreuses marques sont disponibles, y compris GETM, DAP, Red Devil, White Lightning, et les marques de la chaîne locale. Nous avons utilisé en caoutchouc de silicone clair, les produits White Lightning, Cleveland, Ohio, USA, <a href="http://www.wlcaulk.com/products/all_purpose/silicone_rubber/wl09010.html">http://www.wlcaulk.com/products/all_purpose/silicone_rubber/wl09010.html</a> ) </li><li> Pistolet à calfeutrer </li><li> Un morceau de feuille de pellicule plastique (nous avons utilisé Saran Wrap Cling plus, SC Johnson &amp; Son Inc, Racine, WI, USA <a href="http://www.saranbrands.com/plastic-wrap/index.asp">http://www.saranbrands.com/plastic-wrap/index.asp</a> </li><li> Les gants en latex </li><li> La banane de grand diamètre ou de la saucisse. </li><li> Plaque de base ferme et plat (environ 6 pouces X 6 pouces) en carton épais, plaque acrylique, ou autres. </li><li> FNA performants équipements <ul><li> 25 seringues hypodermiques de calibre </li><li> Shidham de THFV (ou d&#39;autres composants pour effectuer FNA) </li><li> lames de verre </li><li> des kits de coloration </li></ul></li></ol> Étape par étape, les détails A. Préparation de la lésion fantôme (phantom préparer 1 à 2 jours avant la pratique FNA compétence (Figure 2) ou utiliser prêt à utiliser &quot;AV fantôme» de la Source FNA, USA. <ol><li> Coupez un 6 X 6 pouces de taille de soutien du conseil. </li><li> Coupez un tronçon de 2,5 pouces de long sur «noyau lésion fantôme» (banane ou de la saucisse). </li><li> Expulser 0,5 pouce d&#39;épaisseur couche de mastic sur la plaque de base. </li><li> Appuyez sur le «fantôme lésion de base» à la légère dans cette couche de mastic. </li><li> Ajouter plus de calfeutrage sur le «noyau lésion fantôme» afin qu&#39;il soit entièrement noyés dans la butte de calfeutrage, sans bulles d&#39;air. </li><li> Ajuster et la forme du produit de calfeutrage sur «noyau lésion fantôme» avec une main gantée. </li><li> Prenez une pièce de 6 X 6 pouces de taille d&#39;une pellicule de plastique et recouvrir le monticule calfeutrage et d&#39;ajuster la surface de la motte dans une configuration convexe lisse avec un linge propre, la main gantée. </li><li> Laissez la guérison monticule calfeutrer pour 6-8 heures de plus que le temps de durcissement mentionnés sous les instructions du produit, (habituellement 24 heures), dans un endroit chaud. </li><li> Après durcissement, le calfeutrage doit être ferme, et la pellicule de plastique peut être détaché facilement. </li><li> La lésion FNA fantôme est prêt à être utilisé pour pratiquer la procédure FNA après environ 8 heures lorsque le monticule entier de calfeutrage a complètement guéri au centre contenant le «noyau lésion fantôme» (banane ou de la saucisse). </li></ol> B. Pratiquer FNA compétence sur AV Phantom lésion. Toute approche dans l&#39;obtention de haute qualité, adéquate aspirats FNA avec des frottis cytologique de bonne qualité devrait directe adresse suivante points critiques- <ol style="list-style-type:upper-roman;"><li> La jauge, comme l&#39;aiguille implicites dans le titre de la procédure, les aiguilles plus fines (nombre plus élevé de calibre) avec un meilleur rendement aspirats dilution du sang minimes. Pour l&#39;équilibre critique des avantages et des limites, 22 à 25 aiguilles de calibre sont préférables pour la stabilité mécanique optimale de l&#39;aiguille sans affecter la qualité d&#39;aspiration FNA. </li><li> Contrôle de séquences appropriées en application de vide et de la libération durant la procédure de FNA-Cela est essentiel afin de faire avancer les cellules prélevées à chaque coup de l&#39;aiguille, l&#39;aiguille vers le moyeu. Toutefois, le matériel aspiré ne doit pas être autorisé à atteindre dans le domaine de l&#39;assemblage aspiration à l&#39;aiguille d&#39;une seringue. Si ce n&#39;est pas empêché, le matériau peut être difficile à récupérer pour faire des frottis (ce matériau peut toutefois être utilisé pour la préparation des blocs de cellules ou de procédés de concentration tels que Cytospin, les méthodes de filtre, ou récente des préparations liquides cytologie). </li><li> Développer des compétences appropriées dans le traitement de l&#39;échantillon aspiré, y compris la préparation du frottis direct et d&#39;évaluation adéquat sur ​​place avec triage pour des tests complémentaires comme bloc cellulaire préparation pour l&#39;immunocytochimie élective, la cytométrie en flux élective pour l&#39;immunophénotypage des lésions lymphoprolifératives, soumettant passe stériles pour la microbiologie études, et s&#39;accouplentRial pour les tests moléculaires (cytogénétique, etc.) </li></ol> Ba Performing procédure de FNA (illustré avec THFV Shidham [1] (Source FNA, USA); cependant, aucun autre système FNA peut être utilisé pour pratiquer). (Figure 3,4,5). <ol><li> Préparer l&#39;assemblée FNA avec le clapet fermé. </li><li> Localiser la lésion et d&#39;insérer l&#39;aiguille dans la lésion. </li><li> Ouvrez la vanne de connecter le vide, à travers l&#39;aiguille à sa pointe, pour aspirer représentant les composants cellulaires de la lésion à chaque coup de va et vient dans la lésion. </li><li> Maintenir les zones de vide et autre échantillon de la lésion en insérant l&#39;aiguille dans la lésion dans des directions différentes. </li><li> Fermer le robinet de débrancher l&#39;aspirateur dans la lumière de l&#39;aiguille. </li><li> Egaliser la pression avec les conditions ambiantes (par exemple en débranchant la seringue soupapes de l&#39;aiguille pour un bref moment et se reconnecter. Si le dispositif spécial avec des étapes intégré, tels que «THFV» est utilisé, ceci et d&#39;autres mesures de Ba1 à Fa6 sont concertés automatiquement par la suite les différentes étapes dans le système de valve) [1]. </li><li> Retirez l&#39;aiguille de la lésion avec la vanne fermée, afin d&#39;éviter la perte de l&#39;échantillon par capillarité dans la lésion moins qu&#39;il y ait une pression légèrement négative à la fin du moyeu. </li><li> Déloger le contenu atmosphérique sur la lame de verre pour préparer l&#39;examen direct (voir ci-dessous) (figure 6). </li></ol> Sib. Traitement de l&#39;échantillon aspiré avec triage approprié Répandre la ponction sur les lames de verre et la préparation des frottis de bonne qualité directe (figure 6) suivie d&#39;une coloration appropriée et de triage (voir la figure 7,8). <ol><li> Une goutte d&#39;aspirer délogé sur la lame de verre est propagée par une variété d&#39;approches comme le montre (figure 6) [2]. L&#39;approche habituelle est «a». Cependant, si l&#39;échantillon est du sang dilué avec quelques microfragments, l&#39;excès de sang est drainé en inclinant la lame, et la microfragments sont ensuite réparties entre cette lame et lamelle de verre seconde similaires à &quot;a&quot;. Si la ponction est principalement une suspension sans microfragments, tels que des lésions lymphoprolifératives, elle est répartie similaire à &#39;b&#39; ou &#39;c&#39;. </li><li> Le frottis peut être traitée et fixée dans une variété de façons pour les différentes méthodes de coloration lors de l&#39;évaluation adéquat sur place. Cependant, la meilleure approche consiste à sécher à l&#39;air tous les frottis. Les frottis séchés à l&#39;air peut être teint avec des colorants Romanowski (comme Difff-Quik tache, tache de Wright) après fixation du méthanol ou avec Pap tache après saline de réhydratation et de post-fixation (dans 95% d&#39;éthanol ou de préférence dans l&#39;éthanol à 95% avec 5 % d&#39;acide acétique) [3]. Élimination des interférences dues à obscurcir le sang est un avantage significatif [3]. </li><li> Selon les premières constatations cytomorphologic lors de l&#39;évaluation adéquat sur place, le triage supplémentaires (tels que le bloc de cellules élective, la microscopie électronique, les cultures en microbiologie, la cytométrie de flux, des tests moléculaires-cytogénétique etc) est recommandé comme indiqué. </li></ol> Les résultats représentatifs: <img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig1tmb.jpg" alt="Figure 1" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig1.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure 1</a> . Figure 1. Matériel requis pour la préparation AV Phantom pour pratiquer FNA compétence (* Nous utilisons une pellicule de plastique Saran qui ne colle pas à la calfeutrer à la fin, tout en retirant après le durcissement complet du produit de calfeutrage.) <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig2tmb.jpg" alt="Figure 2" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig2.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure 2.</a> Figure 2. Préparation AV Phantom lésion <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig3tmb.jpg" alt="Figure 3" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig3.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure 3.</a> Figure 3. Les étapes critiques dans la procédure de la FNA. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig4tmb.jpg" alt="Figure 4" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig4.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure 4.</a> Figure 4. EUS-FNA-Résumé des étapes critiques * (voir Fig 3) <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig5tmb.jpg" alt="Figure 5" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig5.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure 5.</a> Pièges Figure 5. Liés à des étapes critiques dans la FNA procedure. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig6tmb.jpg" alt="Figure 6" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig6.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure 6.</a> Figure 6. Préparation des frottis directs de l&#39;échantillon FNA entre deux lames. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig7tmb.jpg" alt="Figure 7" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig7.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure 7.</a> Figure 7. Wet frottis fixés par rapport séchés à l&#39;air. <hr style="border-bottom:1px dotted #999999;" /><img border="0" src="/files/ftp_upload/1404/1404fig8tmb.jpg" alt="Figure 8" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1404/1404fig8.jpg">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure 8.</a> Figure 8. Wet frottis fixés par rapport séchés à l&#39;air.

<ol>
	<li>Shidham, V. B., Pandit, A. W., Rao, R. N., Basir, Z., Shidham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Harvester+with+Functional+Valve+(THFV):+Shidham's+device+for+reproducibly+higher+specimen+yield+by+fine+needle+aspiration+biopsy+with+easy+to+perform+steps.">Tissue Harvester with Functional Valve (THFV): Shidham's device for reproducibly higher specimen yield by fine needle aspiration biopsy with easy to perform steps.</a> BMC Clinical Pathology. 7 (2), (2007).</li><li>Shidham, V. B., Epple, J., Shidham, V. B., Atkinson, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AppendiX+I:+Collection+and+processing+of+effusion+fluids+for+cytopathologic+evaluation.">AppendiX I: Collection and processing of effusion fluids for cytopathologic evaluation.</a> , 207-235 (2007).</li><li>Shidham, V., Kampalath, B., England, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+air+drying+of+all+the+smears+prepared+during+fine+needle+aspiration+and+intraoperative+cytology+studies:+An+opportunity+to+practice+a+unified+protocol,+offering+the+flexibility+of+choosing+variety+of+staining+methods.">Routine air drying of all the smears prepared during fine needle aspiration and intraoperative cytology studies: An opportunity to practice a unified protocol, offering the flexibility of choosing variety of staining methods.</a> Acta Cytologica. (45), 60-68 (2001).</li></ol>

Biopsies d&#39;aspiration à l&#39;aiguille fine (FNAB) sont largement effectuée comme une solution économique, technique mini-invasive sûre et rapide pour le diagnostic des tissus de diverses tumeurs et des lésions. Dans cette procédure d&#39;une aiguille de 18 à 27 jauge est insérée dans la lésion, allaient et venaient plusieurs fois dans différents domaines de la lésion sous vide contrôlé (aspiration) d&#39;intensité variable allant de minimes à la seule forme de l&#39;action capillaire à environ 10 ml vide dans la seringue pour récupérer du matériel de diagnostic tissulaire. Une aiguille de la jauge plus fine avec nombre plus élevé est préférable de récupérer du matériel cytologique bon de préparer les frottis directs. L&#39;aiguille de la jauge de large 18G récupère un échantillon plus adapté à bloc cellulaire, cytométrie en flux, microscopie électronique, cytogénétique, de la microbiologie des cultures etc Bien que la procédure est simple, en contrôlant les différentes étapes d&#39;application adéquate et la libération de vide à des mesures appropriées de façon concertée est extrêmement crucial pour des résultats optimaux. En raison de non-disponibilité de spécialement conçu à rendement élevé aiguilles, seringues hypodermiques traditionnelles ou leurs modifications sont utilisées pour effectuer cette procédure. Toutefois, les aiguilles hypodermiques ont de nombreuses limites conduisant à un rendement faible de l&#39;échantillon s&#39;il est utilisé de façon classique. L&#39;exigence de poignées seringue spéciale ajoute habituellement à la complexité de la procédure. Ainsi, en raison de l&#39;absence de dispositif de disponible dans le commerce aiguille adaptée FNAB, cette procédure très polyvalent souffre d&#39;un problème fréquent de la récupération spécimens inadéquats. Récemment, un dispositif d&#39;augmenter le rendement avec une reproductibilité a été rapportée [1]. De plus, il ya actuellement un manque de modèle approprié pour la pratique de la compétence dans l&#39;accomplissement de la FNAB par le personnel de santé en formation y compris les résidents et les boursiers. Nous avons eu un modèle standardisé avec un morceau de foie frais de bétail en peluche dans de gants en latex pour pratiquer la FNAB compétence. Toutefois, ce modèle est difficile à organiser dans un bref délai. Achat de foie de bovins fraîche est généralement la situation de limitation. En outre, la manipulation de foie peut introduire une contamination des facteurs liés comme un tirage significative dos. La tendance pour le gant en latex de fuite après un peu de piqûres d&#39;aiguille conduit à dégâts potentiels lors de la session de pratique. Nous rapportons et décrire un roman, mais méthode simple d&#39;intégrer un petit morceau de banane (ou saucisse) dans un calfeutrage en caoutchouc de silicone disponible dans le commerce et les autres matériaux facilement disponibles. Le fantôme FNAB conserve joint hermétique permettant ainsi l&#39;aspiration de matériel provenant de l&#39;échantillon intégré, ce qui équivaut à la procédure de la FNAB réel sur une lésion au milieu clinique. Dans cette vidéo, nous démontrons la procédure de prise de la FNAB fantôme lésion et pratiquer la procédure FNAB. Il démontre également en bref le traitement de l&#39;échantillon récupéré, y compris la préparation du frottis et coloration [2,3]. Parce que le calfeutrage prend du temps à guérir, la lésion fantôme doit être préparé à l&#39;avance d&#39;environ 24 à 48 heures avant la séance de pratique. Comparable prêt à utiliser une lésion fantôme peut être obtenu à partir d&#39;une source commerciale (Source FNA, USA). La lésion fantôme pour pratiquer la FNAB compétences peuvent être utilisées pour la formation des résidents et des boursiers avant le début de la FNAB performances sur des patients en milieu clinique.

preparation and using phantom lesions to practice fine needle aspiration biopsies

Actuellement, les travailleurs de la santé y compris les résidents et les boursiers n&#39;ont pas un modèle approprié fantôme pour la pratique de la cytoponction biopsie (FNAB) procédure. Dans le passé, nous avons standardisé un modèle composé de gant en latex contenant fraîche foie de bovins pour la pratique de la FNAB. Toutefois, ce modèle est difficile d&#39;organiser et de préparer à court préavis, avec l&#39;achat de foie de bovins fraîche étant l&#39;aspect le plus difficile. Manipulation du foie avec des problèmes de contamination liés est également un tirage significative dos. En outre, les fuites de matériaux de gants après une aiguille quelques passes, avec résultant pagaille. Nous avons établi une nouvelle méthode simple de l&#39;intégration d&#39;un petit morceau de saucisson ou de banane dans un calfeutrage en caoutchouc de silicone disponible dans le commerce. Ce modèle permet la rétention de joint vide et l&#39;aspiration de matériel provenant de l&#39;échantillon embarqués, ressemblant à une procédure FNAB réelle sur les lésions de masse clinique. Le matériel aspiré dans le manchon de l&#39;aiguille peut être traitée similaires aux échantillons prélevés lors d&#39;une procédure réelle FNAB, facilitant la compétence supplémentaire dans la préparation du frottis et coloration.

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Preparation and Using Phantom Lesions to Practice Fine Needle Aspiration Biopsies

Pratiquer des cytoponctions (FNAB) par les stagiaires est relativement difficile, en raison de l&#39;absence d&#39;un facilement disponibles, une lésion approprié. Préparation d&#39;une lésion AV fantôme pour pratiquer la procédure et de compétence FNAB mastering est relativement facile.

Préparation et utilisation des lésions Phantom à la pratique cytoponctions

Currently, health workers including residents and fellows do not have a suitable phantom model to practice the fine- needle aspiration biopsy (FNAB) ...

preparation-using-phantom-lesions-to-practice-fine-needle-aspiration

Research

JoVE Journal

Biology

17.7K vues.  University of Wisconsin - Milwaukee. Pratiquer des cytoponctions (FNAB) par les stagiaires est relativement difficile, en raison de l'absence d'un facilement disponibles, une lésion approprié. Préparation d'une lésion AV fantôme pour pratiquer la procédure et de compétence FNAB mastering est relativement facile.

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection fine et globale de l&#39;épithélium sensoriel de l&#39;oreille interne adultes poisson zèbre ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Recherche

Biologie

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: préparation d&#39;échantillons à la détection

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Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological approach to analyzing protein kinetics at DNA lesions over time or protein-protein interactions on locally microirradiated chromatin. We also show how to recognize individual phases of the cell cycle using the Fucci cellular system to study cell-cycle-dependent protein kinetics at DNA lesions. A methodological description of the use of two UV lasers (355 nm and 405 nm) to induce different types of DNA damage is also presented. Only the cells microirradiated by the 405-nm diode laser proceeded through mitosis normally and were devoid of cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs). We also show how microirradiated cells can be fixed at a given time point to perform immunodetection of the endogenous proteins of interest. For the DNA repair studies, we additionally describe the use of biophysical methods including FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) in cells with spontaneously occurring DNA damage foci. We also show an application of FLIM-FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) in experimental studies of protein-protein interactions.

Laser microirradiation is a useful tool for studies of DNA repair in living cells. A methodological approach for the use of UVA lasers to induce various DNA lesions is shown. We have optimized a method for local microirradiation that maintains the normal cell cycle; thus, irradiated cells proceed through mitosis.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.

Immunolabelling Myofiber Dégénérescence dans les biopsies musculaires

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Micro-aspiration à cellule unique comme stratégie alternative au tri cellulaire activé par fluorescence pour la séparation du mélange de virus géants

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

Évaluation du risque agrochimique pour les reines d’abeilles mellifères accouplées

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Profiling of H3K4me3 Modification in Plants using Cleavage under Targets and Tagmentation

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their recruited proteins, lead to temporal and spatial control of gene expression. Cleavage under targets and tagmentation (CUT&#38;Tag) is an enzyme-tethering method in which the specific chromatin protein is firstly recognized by its specific antibody, and then the antibody tethers a protein A-transposase (pA-Tn5) fusion protein, which cleaves the targeted chromatin in situ by the activation of magnesium ions. Here, we provide our previously published CUT&#38;Tag protocol using intact nuclei isolated from allortetraploid cotton leaves with modification. This step-by-step protocol can be used for epigenomic research in plants. In addition, substantial modifications for plant nuclei isolation are provided with critical comments.

Cleavage under targets and tagmentation (CUT&amp;Tag) is an efficient chromatin epigenomic profiling strategy. This protocol presents a refined CUT&amp;Tag strategy for the profiling of histone modifications in plants.

Profilage de la modification H3K4me3 dans les usines à l’aide du clivage sous cibles et de la marquage

Epigenomic regulation at the chromatic level, including DNA and histone modifications, behaviors of transcription factors, and non-coding RNAs with their ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward method to quickly identify the chemoattractants that could induce the chemotactic movement of rhizosphere growth-promoting bacteria on sterile glass slides via simple steps. Bacteria solution (OD600 = 0.5) and sterile chemoattractant aqueous solution were added dropwise on the glass slide at an interval of 1 cm. An inoculating loop was used to connect the chemoattractant aqueous solution to the bacterial solution. The slide was kept at room temperature for 20 min on the clean bench. Finally, the chemoattractant aqueous solution was collected for bacterial counting and microscopic observation. In this study, through multiple comparisons of experimental results, the method overcame multiple shortcomings of traditional bacterial chemotaxis methods. The method reduced the error of plate counting and shortened the experimental cycle. For the identification of chemoattractant substances, this new method can save 2-3 days compared to the traditional method. Additionally, this method allows any researcher to systematically complete a bacterial chemotaxis experiment within 1-2 days. The protocol can be considered a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Here, we present an improved chemotaxis assay protocol. The goal of this protocol is to reduce the steps and costs of traditional bacterial chemotaxis methods and to serve as a valuable resource for understanding plant-microbe interactions.

Un test de chimiotaxie amélioré pour l’identification rapide des chimioattractifs rhizobactériens dans les exsudats racinaires

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...

Comprehensive Echocardiographic Assessment of Right Ventricle Function in a Rat Model of Pulmonary Arterial Hypertension

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease caused by vasoconstriction and remodeling of the small arteries in the lungs. This remodeling leads to increased pulmonary vascular resistance, worsened right ventricular function, and premature death. Currently approved therapies for PAH largely target pulmonary vasodilator pathways; however, recent emerging therapeutic modalities are focused on other novel pathways involved in the pathogenesis of the disease, including right ventricle (RV) remodeling. Imaging techniques that allow longitudinal assessment of novel therapeutics are very useful for determining the efficacy of new drugs in preclinical studies. Noninvasive trans-thoracic echocardiography remains the standard approach to evaluating heart function and is widely used in rodent models. However, echocardiographic evaluation of the RV can be challenging due to its anatomical position and structure. In addition, standardized guidelines are lacking for echocardiography&#160;in preclinical rodent models, making it difficult to carry out a uniform assessment of RV&#160;function across studies in different laboratories. In preclinical studies, the monocrotaline (MCT) injury model in rats is widely used to evaluate drug efficacy for treating PAH. This protocol describes the echocardiographic evaluation of the RV in na&#239;ve and MCT-induced PAH rats.

The present protocol describes the echocardiographic characterization of right ventricular morphology and function in a rat model of pulmonary arterial hypertension.

Évaluation échocardiographique complète de la fonction du ventricule droit dans un modèle d’hypertension artérielle pulmonaire chez le rat

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive disease caused by vasoconstriction and remodeling of the small arteries in the lungs. This ...

Utilisation de biopsies cutanées pour générer des podocytes dérivés de patients

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the glomerulus. Mutations in podocyte-specific genes can cause focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), and podocytes are also affected in many other primary and secondary nephropathies. Due to their differentiated nature, primary cell culture models are limited for podocytes.&#160;Therefore, commonly conditionally immortalized cells are used. However, these conditionally immortalized podocytes (ciPodocytes) have several limitations: the cells can dedifferentiate in culture, especially when they reach confluency, and several podocyte-specific markers are either only slightly or not expressed at all. This brings the use of ciPodocytes and their applicability for physiological, pathophysiological, and clinical reach into question. Here, we describe a protocol for the generation of human podocytes-including patient-specific podocytes-from a skin punch biopsy by episomal reprogramming of dermal fibroblasts into hiPSCs and subsequent differentiation into podocytes. These podocytes resemble in vivo podocytes much better in terms of morphological characteristics, like the development of foot processes and the expression of the podocyte-specific marker. Finally, yet importantly, these cells maintain patients&#39; mutations, resulting in an improved ex vivo model to study podocyte diseases and potential therapeutic substances in an individualized approach.

Pleins feux sur l’auteur : Génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées  

This manuscript describes a two-step protocol to generate patient-specific podocytes from dermal fibroblasts via episomal reprogramming into human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and subsequent differentiation into podocytes.

Génération de podocytes dérivés de patients à partir de biopsies cutanées

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...