Nous reconnaissons l&#39;appui à la recherche par le Programme de recherche intra-muros des NIBIB, NIH.

Assemblée cellule d&#39;échantillon et de couple <ol><li> Nous commençons la construction de cellules de l&#39;échantillon en mettant ensemble deux assemblées fenêtre. Placer un joint de fenêtre dans le porte-fenêtre. Positionner le revêtement fenêtre (ou il est parfois appelé un coussin fenêtre) à l&#39;intérieur du porte-fenêtre de sorte que l&#39;ouverture de la doublure est en face de la rainure du support. Avec un léger angle, placer la fenêtre dans le support alignant la marque gravée sur la fenêtre avec la manière clé de la porte-fenêtre. Appuyez doucement sur les bords mêmes sur les deux côtés de la fenêtre. </li><li> Pour assurer une bonne étanchéité et un couple précis de la cellule d&#39;échantillon, nous enduire légèrement le joint du boîtier et l&#39;anneau à vis avec un lubrifiant Spinkote. Étaler une très petite quantité de Spinkote entre votre pouce et votre index. Enduire le filetage bague de vis avec une fine pellicule invisible de Spinkote. De même, le manteau le joint du boîtier. Essuyer tout lubrifiant visible. </li><li> Commencez l&#39;assemblage de cellules de l&#39;échantillon en faisant glisser un assemblage de la fenêtre, avec la fenêtre tournée vers vous, dans le logement de pile en alignant la rainure avec la clé de logement. Aligner la rainure avec la clé de voûte de logement et le laisser tomber doucement sur le dessus de l&#39;assemblage de la fenêtre à l&#39;intérieur de la cellule. </li><li> Ne pas utiliser n&#39;importe quelle sorte d&#39;outil pour pousser la pièce maîtresse dans le boîtier de la cellule. Cela pourrait causer des dommages permanents au CP résultant de fuites au cours des expériences. Tourner l&#39;assemblage deuxième fenêtre pour que la fenêtre est orientée vers la pièce, loin de vous, aligner clavetage avec les principaux logement et faites-le glisser sur le dessus de la pièce. Placer un joint de logement sur le dessus, puis, un anneau à vis de sorte que le mot «Out» est visible. En utilisant vos doigts et un outil d&#39;alignement, la main serrer la bague à vis. Si le CP ne glisse pas facilement dans le canon de logement, d&#39;abord l&#39;aligner, alors, de placer l&#39;ensemble deuxième fenêtre sur le dessus de celui-ci. En appliquant une légère pression à la baisse sur l&#39;assemblage de la fenêtre, faites glisser la fois dans le boîtier de la cellule dans le même temps. De cette façon, nous évitons appuyant directement sur le PC. C&#39;est maintenant le bon moment pour regarder à l&#39;intérieur de la cellule pour la poussière, les peluches et les empreintes digitales. Vous remarquerez également que les anneaux de Newton indiquent qu&#39;il ya encore de l&#39;air entre le CP et les fenêtres. Celles-ci disparaissent après application d&#39;un couple. </li><li> Avec la bague à vis et le mot «out» visibles, lieu de la cellule de l&#39;échantillon tout en bas à l&#39;intérieur du couple de serrage des cellules du stand de couple. Tenir la cellule en place en appliquant une pression constante sur la poignée se couple. Dans un mouvement continu, serrer la bague à vis à entre 120 à 140 lb-po. Si vous utilisez une clé micrométrique réglable en couple, il réglé entre 120-140 po / lb et serrer la bague à vis jusqu&#39;au Clé &quot;clics&quot; en indiquant le couple réglé est atteint. Relâchez la poignée se couple et enlevez soigneusement la cellule de l&#39;échantillon sans toucher les fenêtres. </li></ol> Chargement et d&#39;étanchéité de la cellule échantillon <ol start="6"><li> Pour les expériences vitesse de sédimentation, nous avons l&#39;habitude de charger un volume de 400ul dans chaque secteur de la pièce de 12mm avec une pipette 200ul. Position de la cellule de l&#39;échantillon avec les trous de chargement sur le dessus et le mot &quot;out&quot; sur l&#39;anneau de vis apparentes. Glissez la façon la pipette moitié pointe vers le bas dans le secteur central gauche à travers les trous de chargement et lentement se dispenser 200ul de solution de référence. Répéter une fois au total 400ul. Utiliser le même embout de pipette et la même technique, soigneusement et lentement remplissez le secteur central DROITE avec 400ul de solution d&#39;échantillon. Les volumes de 150-180 ul sont utilisés pour des expériences de l&#39;équilibre de sédimentation, mais le même soin et la technique doivent être suivies. Il est impératif de correspondre aux volumes des solutions de référence et l&#39;échantillon le plus fidèlement possible. Montage de la pointe de la pipette fermement sur la pipette, lentement chargement et la distribution de solutions, en évitant les bulles de chargement et en utilisant le même embout de pipette pour les deux solutions ensemble de l&#39;aide à maintenir les volumes aussi égaux que possible. </li><li> Sceau de la cellule en plaçant deux nouveaux joints rouges prise logements parfaitement dans chaque trou de chargement en s&#39;assurant qu&#39;ils sont placés entre la pièce maîtresse et le boîtier en aluminium. Couvrir avec une fiche de chaque logement. Serrer à la main avec un tournevis à tête plate de petite taille. </li></ol> Alignement de cellules des échantillons dans Rotor <ol start="8"><li> Avant de charger le rotor, assurez-vous que le contrepoids ne dépasse pas 0,5 g de moins que la cellule d&#39;échantillon dans la position inverse, en cas que les fuites de cellules de l&#39;échantillon. Commencez avec le solde à zéro. D&#39;abord peser les cellules de l&#39;échantillon qui sera en position face à la CB. Remettre la balance à soustraire le poids de cellules de l&#39;échantillon, puis, de peser le CB. Ajouter ou soustraire le poids du trou de fixation du contrepoids. Assurez-vous que les poids ne dépassent pas du haut. Repeser pour s&#39;assurer que le poids de contrebalancer finale est dans 0,5 g de moins que la cellule d&#39;échantillon opposé. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un rotor de 4-lieu, placer le contrepoids en position 4, de sorte que la flèche blanche est visible et pointant en tIl direction de la force centrifuge. Assurez-vous que c&#39;est tout le chemin jusqu&#39;à l&#39;intérieur du rotor. Doucement fixez la vis de réglage, a trouvé au sommet de la contrebalancer juste en face de la flèche blanche, jusqu&#39;à ce que le contrepoids est bien en place, mais encore capable d&#39;être aligné. Position de la cellule échantillon équilibré avec le boîtier se branche en face du centre du rotor et le mot &quot;out&quot; sur l&#39;anneau de vis apparentes. </li><li> En regardant par-dessous le rotor, aligner la marque tracée à l&#39;intérieur (la marque la plus proche du centre du rotor) avec la marque gravée sur le contrepoids à l&#39;aide d&#39;un outil d&#39;alignement. Serrer la vis de réglage pour verrouiller contrebalancer aligné en place. De la même façon, aligner la marque tracée échantillon de cellules avec la marque tracée à l&#39;intérieur à la position 2 sur le rotor. </li></ol> Pour plus d&#39;informations, voir <a href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx</a>

<ol>
	<li>Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+protein-protein+interactions+by+sedimentation+velocity+analytical+ultracentrifugation.">Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).</li><li>Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions+by+equilibrium+sedimentation.">Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).</li><li>. Home - Workshops [Internet] Available from: <a target="_blank" href="https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx">https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx</a></li></ol>

L&#39;ensemble de la cellule appropriée, l&#39;insertion de l&#39;échantillon, et l&#39;alignement des cellules dans le rotor est critique pour haute expériences ASC qualité. Cela est vrai, en particulier, pour des expériences qui nécessitent une analyse très détaillée des données acquises sur les profils de sédimentation macromoléculaires, par exemple, lorsque l&#39;on étudie les interactions entre protéines et de déterminer les montants globaux de trace. Souvent, la qualité de l&#39;installation expérimentale est la limitation de l&#39;exactitude et la précision des résultats de l&#39;étude des AUC. Pour plus de détails sur la conception pratique et l&#39;exécution des expériences d&#39;autres AUC, voir Références 1 - 3. Ateliers pratiques couvrant l&#39;installation, la théorie et l&#39;analyse de données d&#39;expériences AUC sont détenus deux fois par an dans notre laboratoire à l&#39;Institut National de la Santé [4].

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>4-place Ti analytical rotor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361964</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Torque stand assembly</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>361318</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell alignment tool</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinkote Lubricant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306812</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Counterbalance</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>360219</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell Housing kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>334602</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window gasket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327021</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window liner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362329</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, sapphire</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>307177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window, quartz</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>301730</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Window holder</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>305037</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12mm double sector Epon centerpiece</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>306493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell plug gaskets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>327022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell housing plug	</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>362327</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell

L&#39;ultracentrifugation analytique (AUC) est un outil puissant biophysiques qui nous permet d&#39;enregistrer des profils de sédimentation macromoléculaires pendant la centrifugation à grande vitesse. Lorsqu&#39;il est correctement planifié et exécuté, une vitesse de sédimentation ou de l&#39;expérience ASC équilibre de sédimentation peut révéler beaucoup de choses sur une protéine en ce qui concerne la taille et la forme, la pureté de l&#39;échantillon, coefficient de sédimentation, les Etats oligomérisation et interactions protéine-protéine. Cette technique, cependant, exige un niveau d&#39;attention rigoureuse technique. Exemple de cellules détenir une pièce maîtresse sectorisé en sandwich entre deux assemblées fenêtre. Ils sont scellés avec une pression d&#39;environ 120-140 couple in / lbs. Tampon de référence et l&#39;échantillon sont chargés dans les secteurs central et puis après d&#39;étanchéité, les cellules sont alignées avec précision dans un rotor en titane afin que les systèmes de détection optique de balayage à la fois l&#39;échantillon et le tampon de référence dans la ligne médiane trajet radial même à travers chaque secteur central tout en tournant à des vitesses allant jusqu&#39;à 60 000 tours par minute et sous vide très poussé Non seulement est bon assemblage de cellules de l&#39;échantillon critiques, composants de la cellule de l&#39;échantillon sont très chers et doivent être correctement pris en charge afin de s&#39;assurer qu&#39;ils sont en état de marche optimal afin d&#39;éviter les fuites et les bris lors des expérimentations. Manipuler les fenêtres soigneusement, pour la moindre fissure ou éraflure peut conduire à la rupture dans la centrifugeuse. Le contact entre centre et fenêtres doivent être aussi serrée que possible, c&#39;est à dire les anneaux de Newton ne s doit être visible après une pression de couple est appliqué. La poussière, les peluches, les rayures et les huiles soit sur les fenêtres ou la pièce maîtresse tout compromis ce contact et peut très facilement conduire à des fuites de solutions d&#39;un secteur à un autre ou une fuite hors de la pièce tous ensemble. Non seulement les précieux échantillons perdus, les fuites de solutions lors d&#39;une expérience va provoquer un déséquilibre de pression dans la cellule qui conduit souvent à des vitres brisées et maîtresses. En outre, les joints et bouchons branchez le logement doit être solidement en place pour éviter les solutions étant retirée du secteur de la pièce à travers les trous de chargement par le haut vide dans la chambre de centrifugation. Doublures de fenêtres et les joints doivent être exempts de ruptures et les fissures qui pourraient causer des mouvements qui en résultent vitres brisées. Cette vidéo va montrer nos procédures d&#39;assemblage de cellules de l&#39;échantillon, le couple, le chargement et l&#39;alignement du rotor pour aider à minimiser les dommages composante, la solution de fuites et de bris lors de l&#39;expérience parfaite AUC.

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Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

L&#39;ultracentrifugation analytique (AUC) de cellules de l&#39;échantillon et le tampon de l&#39;échantillon détient référence et au cours d&#39;expériences et est exposé à vide élevé et des vitesses de rotor jusqu&#39;à 60.000 rpm. Cette vidéo va démontrer le souci du détail nécessaire pour l&#39;assemblage, le chargement et l&#39;alignement de cette composante très importante d&#39;une expérience ASC.

Assemblée, de chargement, et l&#39;alignement d&#39;une cellule échantillon ultracentrifugation analytique

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

assembly-loading-alignment-an-analytical-ultracentrifuge-sample

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K vues.  Dynamics of Macromolecular Assembly, Laboratory of Bioengineering and Physical Science. L'ultracentrifugation analytique (AUC) de cellules de l'échantillon et le tampon de l'échantillon détient référence et au cours d'expériences et est exposé à vide élevé et des vitesses de rotor jusqu'à 60.000 rpm. Cette vidéo va démontrer le souci du détail nécessaire pour l'assemblage, le chargement et l'alignement de cette composante très importante d'une expérience ASC.

Vidéo: Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

Dissection de l&#39;organisateur et explants pôle animal à partir d&#39;embryons de Xenopus laevis et de l&#39;Assemblée d&#39;un test d&#39;adhésion cellulaire

Recherche

Biologie

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

In Vitro Assemblée nucléaire utilisant fractionnée extraits d&#39;œufs de Xénope

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The apertureless near-field microscope is a light scattering-type instrument that provides infrared spectra at circa 20 nm resolution. A complete list of components and a step-by-step protocol for use is provided.  Common errors in assembly and instrument tuning are discussed.  A representative data set that shows the secondary structure of an amyloid fibril is presented.  

The assembly of a nearfield infrared microscope for imaging protein aggregates is described.

Assemblée, Tuning et utilisation d&#39;un microscope en champ proche infrarouge pour l&#39;imagerie Apertureless protéines

This paper aims to instruct the reader in the assembly and operation of an infrared near-field microscope for imaging beyond the diffraction limit.  The ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Un outil analytique qui quantifie les changements de morphologie cellulaire en trois dimensions des images de fluorescence

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Les échantillons de test pour optimiser STORM Super-Résolution Microscopie

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Préparation d’échantillons pour la microscopie à force atomique à virion unique et l’imagerie par fluorescence à super-résolution

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&#945; Promoter Using Gibson Assembly

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized plasmids for expression of exogenous genes in mouse embryonic stem cells (mESCs). Expression of exogenous genes under the control of the SV40 or human cytomegalovirus promoters diminishes quickly after transfection into mESCs. A remedy for this diminished expression is to use the human elongation factor-1 alpha (hEF1&#945;) promoter to drive gene expression. Plasmid vectors containing hEF1&#945; are not as widely available as SV40- or CMV-containing plasmids, especially those also containing N-terminal 3xFLAG-tags. The protocol described here is a rapid method to create plasmids expressing FLAG-tagged CstF-64 and CstF-64 mutant under the expressional regulation of the hEF1&#945; promoter. GA uses a blend of DNA exonuclease, DNA polymerase and DNA ligase to make cloning of overlapping ends of DNA fragments possible. Based on the template DNAs we had available, we designed our constructs to be assembled into a single sequence. Our design used four DNA fragments: pcDNA 3.1 vector backbone, hEF1&#945; promoter part 1, hEF1&#945; promoter part 2 (which contained 3xFLAG-tag purchased as a double-stranded synthetic DNA fragment), and either CstF-64 or specific CstF-64 mutant. The sequences of these fragments were uploaded to a primer generation tool to design appropriate PCR primers for generating the DNA fragments. After PCR, DNA fragments were mixed with the vector containing the selective marker and the GA cloning reaction was assembled. Plasmids from individual transformed bacterial colonies were isolated. Initial screen of the plasmids was done by restriction digestion, followed by sequencing. In conclusion, GA allowed us to create customized plasmids for gene expression in 5 days, including construct screens and verification.

Generation of Plasmid Vectors Expressing FLAG-tagged Proteins Under the Regulation of Human Elongation Factor-1&amp;#945; Promoter Using Gibson Assembly

Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.

Génération de vecteurs plasmidiques exprimant des protéines de marquage Flag En vertu du règlement de l&#39;allongement Human Factor-1α promoteur Utilisation Assemblée Gibson

Gibson assembly (GA) cloning offers a rapid, reliable, and flexible alternative to conventional DNA cloning methods. We used GA to create customized ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

Une approche alternative pour la préparation de l&#39;échantillon avec une faible Nombre de cellules d&#39;analyse TEM

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Stomates Tape-Peel : Une méthode améliorée pour la préparation d’échantillons de cellules de garde

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Chargement d’échantillons cryogéniques dans un spectromètre à résonance magnétique nucléaire à angle magique qui préserve la viabilité cellulaire

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...