Le financement de ce travail a été fourni par le NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, et les NIH R56 AI063274

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Les auteurs de cet article n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents de divulguer.

Applications de génotypage à grande échelle ont été utilisées pour mieux comprendre le mécanisme génétique sous-jacente de nombreuses maladies humaines. La découverte d&#39;une variante importante grâce à une analyse de génome d&#39;association peut signaler une région candidate pour une étude plus approfondie. En outre, les données de génotype est un bon outil pour le contrôle de la qualité des projets de séquençage. Pour maximiser le débit d&#39;échantillons, de plaques échantillons multiples peuvent être amplifiés et stockés dans leurs Etats, remis en suspension fragmentés. Huit plaques peuvent être amplifiées en une seule journée, en combinant les 24 premières heures du protocole pour plusieurs lots et de fournir suffisamment de matière pour ~ 2-8 jours de la puce de traitement. Si les plaques amplifiés sont stockées à l&#39;avance, et si de nouveaux échantillons sont hybridées à des puces immédiatement après la numérisation commence sur la course précédente, le traitement peut fonctionner en continu sans avoir besoin de faire une pause pour la préparation de l&#39;échantillon supplémentaire. Par conséquent, bien que les échantillons auront trois jours pour subir la complèteessai, les données peuvent être générés quotidiennement. copeaux de Assuming24 sont traitées chaque jour, une semaine de travail de 5 jours permet depuis plus de 1000 échantillons d&#39;ADN pour être exécuté sur une puce de perles 12-échantillon. Si une étape ou réactif a échoué, cependant, plusieurs lots pourraient être à risque de mauvaise performance avant toute correction peut être appliquée. Des erreurs peuvent échapper à l&#39;attention jusqu&#39;à ce que les réseaux sont scannés ou analysés, par conséquent, si le débit est maximisé, des centaines d&#39;échantillons à différents stades du protocole pourraient déjà avoir reçu le même traitement défectueux lors de la découverte. Comme les réactifs et les données perdues ne peuvent pas être récupérés, l&#39;utilisateur doit peser ces risques contre la nécessité d&#39;un flux de travail accéléré. Le logiciel d&#39;analyse GenomeStudio est la première occasion de mesurer réellement la réussite du processus de génotypage. Si la norme R-vs parcelles d&#39;intensité Norm-Theta sont bien regroupés, le taux moyen de l&#39;appel (pour cent du total SNP tapé avec succès) des échantillons devrait approcher 99%, bien que cette valeur varie sliselon ghtly le type de tableau. Les données de n&#39;importe quel échantillon avec un taux inférieur à 85-90% d&#39;appels n&#39;est pas digne de confiance et doivent être jetés. À des fins de contrôle de la qualité, les résultats doivent être comparés à des génotypes déjà connues chaque fois que possible. Si aucune donnée n&#39;existe, intentionnelle duplication de l&#39;échantillon est un outil utile pour vérifier la plaque ou tableau placements. Ces paires en double doivent être placés sur des puces séparées, des assiettes, des lots, ou des projets; leurs génotypes vérifiés lors de la génération. Bien que les contraintes QC spécifiques varient en fonction de la préférence de l&#39;enquêteur, les contraintes communes SNP sont basés sur la réussite exemple d&#39;appel, Hardy-Weinberg, ou manquantes entre les cas et les témoins, tandis que les contraintes de l&#39;échantillon communes sont basés sur les taux d&#39;appel, les incohérences de Mendel, ou des références croisées de X-chromosome hétérozygotie des données cliniques entre les sexes [13]. En cas de problème, le tableau de bord des contrôles, a trouvé dans la suite de l&#39;analyse, peut être soumis à laentreprise afin de déterminer la cause. Ces contrôles peuvent souvent limiter la question à l&#39;étape la plus probable ou l&#39;échec de réactif. Si des SNP d&#39;intérêt se trouvent à travers une expérience de génotypage Infinium, leurs parcelles d&#39;intensité doivent être vérifiées dans GenomeStudio pour les erreurs de regroupement avant est effectué de nouvelles recherches. Une expérience de génotypage Infinium pas est probablement dû à une erreur de manipulation humaine ou l&#39;ADN d&#39;entrée de mauvaise qualité. quantification de l&#39;échantillon doit être exacte et précise. Pour de meilleurs résultats, tous les réactifs ajoutés à un échantillon ou puce doivent être dispensés au volume fixé par le protocole. Les pipettes doivent être correctement calibrés. Réactifs ne doivent pas être exécutés après expiration et ne doivent pas être recongelés une fois décongelé, sauf pour le réactif RA1. Afin de minimiser les erreurs de coloration et de vulgarisation possibles, le mélange formamide / EDTA doit être préparé chaque mois. Tous les -20 C ° réactifs doivent être stockés dans des congélateurs à dégivrage non automatique seulement. Tout le matériel de laboratoire utilisé dans la mAining, de vulgarisation, et lavage des parties du protocole doivent être rincés abondamment à l&#39;eau et un détergent doux dès désuétude. Les réservoirs d&#39;humidification dans la chambre de hyb doivent être lavés avec une brosse en tube à essai et un détergent doux. Les lames de verre doivent être lavés avec l&#39;eau de Javel à 10%, selon les instructions de leurs manuels de l&#39;utilisateur, une fois par semaine.

Taper polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) est une méthode clé de l&#39;identification des variantes de risque associés à la maladie. Historiquement, le champ d&#39;application de génotypage a été limitée par la technologie disponible. méthodes de génotypage basés sur l&#39;électrophorèse sur gel sont limitées dans l&#39;échantillon-et SNP-débit [1]. Le développement de ces tests peut souvent être main-d&#39;œuvre, en s&#39;appuyant sur ​​la composition et la structure de la région entourant la variante pour l&#39;optimisation [1]. TaqMan de génotypage, développé par Life Technologies, peuvent exécuter un grand nombre d&#39;échantillons rapidement et avec la participation de technicien minimal [2], mais les restrictions SNP-multiplexage continuent de limiter le nombre total de génotypes à bien moins d&#39;un million par jour [3,4 ]. La plate-forme iPlex Sequenom peut également exécuter plusieurs échantillons à la fois, mais, étant donné que moins d&#39;une centaine de SNPs peuvent être multiplexés, ce débit est comparable globalement faible [5]. La technologie de flux SNP de Beckman Coulterpourrait théoriquement produire plus de trois millions de génotypes par jour, mais cette gamme limites de la technologie du projet à un maximum de seulement quarante-huit SNPs par réaction [4,6]. Bien que l&#39;essai GoldenGate peut traiter près de deux cents échantillons d&#39;ADN chaque jour sur des centaines ou des milliers de SNP par exemple, le prix par génotype n&#39;est pas compétitif avec des techniques ultra-haut débit de pointe lors de la saisie de plus de trois mille SNP à la fois [4,7 ]. Afin de traiter plusieurs millions de génotypes par jour, à l&#39;échelle requise pour les grandes études d&#39;association pangénomique, analyses tableau d&#39;hybridation sont devenus l&#39;option la plus rentable sur le marché. La ligne de Affymetrix de tableaux d&#39;hybridation et de la ligne d&#39;Illumina de tableaux basés sur Infinium permettent potentiellement des centaines d&#39;échantillons à taper sur des centaines de milliers ou des millions de SNP en parallèle [4,8]. Ces SNP peuvent être dispersés sur l&#39;ensemble du génome, localisée dans les régions d&#39;intérêt, tels que les exomes, ou sur mesure selon les préférences de l&#39;utilisateur. Ces tableaux ont l&#39;avantage d&#39;être non seulement en mesure de déterminer le génotype précision d&#39;un million de SNPs par échantillon à la fois, mais aussi de mesurer la variation du nombre de copies, des anomalies chromosomiques potentiellement dévoilement. Infinium alignés tableaux OMNI BeadChip ont actuellement la capacité de génotype à près de cinq millions de marqueurs par échantillon, y compris un demi-million de loci de coutume, sur un maximum de près d&#39;une centaine d&#39;échantillons chaque jour. Comme la plupart des maladies ont une composante génétique, ces expériences à grande échelle peuvent être crucial dans la recherche des gènes associés à la maladie. Génotypage à haut débit permet de production efficace de génotype dans l&#39;échantillon fixe suffisante pour détecter de façon convaincante association génétique à des fréquences des allèles mineurs inférieurs. Projets de génotypage du génome entier peuvent être utilisés pour localiser des régions avec statistiquement significative cas-contrôle la fréquence des allèles ou des différences du nombre de copies [9,10,11]. Selon le National Human GeInstitut de recherche nome, les études d&#39;association du génome a conduit à 1490 publications distinctes entre le 25 Novembre 2008 et le 25 Janvier 2013, découlant de la découverte de 8283 SNP avec une p-valeur inférieure à 1 x 10 -5 (voir http:// www.genome.gov/gwastudies/). Ces études, qui fait des recherches sur des conditions allant de la hauteur de cancer du testicule, bénéficié de l&#39;approche globale offerte par une analyse de l&#39;ensemble du génome. Dans de tels cas, des régions entières d&#39;intérêt pourraient avoir échappé à l&#39;attention avait la portée de taper trop restrictive. Ainsi, pour les analyses d&#39;association à grande échelle, une technique de génotypage du génome est la technique de choix. Différentes versions de l&#39;essai Infinium existent, chacun destiné à être utilisé avec des types spécifiques de tableaux. Le dosage InfiniumUltra, discuté en détail ci-dessous, est approprié pour beaucoup 12 - ou 24-échantillons des puces de tableau. Ce génotype souvent plus de cent mille SNP par échantillon d&#39;ADN et de se concentrer sur trégions argeted, comme sur exome ou personnalisés panneaux. D&#39;autres versions de dosage peuvent être nécessaires pour d&#39;autres types de puces, telles que les matrices de génotypage du génome entier. Cependant, comme tous les tests Infinium partagent une base commune et diffèrent principalement que par les noms de réactifs, les volumes de réactifs ou de la procédure de réactif de coloration exacte, techniques perfectionnées sur une seule version d&#39;essai peuvent souvent être universellement appliquées. D&#39;autres tableaux, comme les tableaux de méthylation, peuvent utiliser un protocole pratiquement identique, aussi bien. Il faut prendre soin de n&#39;utiliser que la version du dosage requis pour le type de puce en cours d&#39;utilisation. Certains types, tels que ceux mesurant le niveau d&#39;expression des gènes, peuvent nécessiter l&#39;utilisation d&#39;un protocole de nonInfinium. Les échantillons doivent être traitées par lots. Par exemple, avec le dosage InfiniumUltra, tubes de réactif de pré-hybridation contiennent un volume suffisant pour exécuter 96 échantillons, et les tubes ne peuvent être recongelés. Par conséquent, les échantillons doivent être analysés en lots de 96 échantillons à la fois. Les échantillons seront amplifiés sur les sapinst jour. Après environ 1 heure de travail d&#39;établi, les échantillons doivent être chauffés dans un four à convection pendant 20-24 h. Le lendemain, près de 4 heures sera consacré fragmentation, la précipitation, et remise en suspension des échantillons, à quel point les échantillons peuvent être soit congelés pour une utilisation ultérieure ou hybridées sur la puce. Chargement puces prend près de 2 heures, après quoi les échantillons seront hybrides pendant une nuit pour 16-24 heures. Le troisième jour, l&#39;étape de coloration et d&#39;extension prend ~ 4 heures. Une heure supplémentaire sera consacré à laver, de revêtement, et le séchage des copeaux. Enfin, les tableaux sont analysés, ce qui peut prendre de 15 à 60 min / puce, selon le type utilisé. Les précautions de sécurité de laboratoire et de propreté standard s&#39;appliquent. Bien que basée sur la PCR de l&#39;amplification n&#39;est pas, les postes de travail séparés pour pré-et postamplification procédures sont nécessaires afin de minimiser la probabilité de contamination. Le numéro d&#39;identification de chaque réactif du kit fourni dans l&#39;utilisation doit être connecté sur une feuille de suivi. Reagents doivent être décongelés avant utilisation et immédiatement inversés plusieurs fois avant la distribution. L&#39;ADN doit être dactylographié doit être de l&#39;ADN génomique de haute qualité (260/280 rapport d&#39;absorbance de 1,6-2,0, 260/230 rapport d&#39;absorbance inférieure à 3,0), isolé par des méthodes classiques et quantifiés avec un fluorimètre. La dégradation de l&#39;ADN est souvent un facteur contribuant dans les résultats d&#39;analyse de qualité médiocre. Typiquement, 200 ng d&#39;ADN est nécessaire, si ce montant peut varier pour certains types de puces. Un robot de liquide de traitement Tecan peut automatiser de nombreuses étapes du protocole et de minimiser l&#39;erreur humaine comme un facteur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="477">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:145px;">Consumable or Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Manufacturer&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Part Number&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Minimum Required for 96 Samples</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.8 ml Deep Well Plate</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0765</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Plate Mats</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0674</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Reagent Basin</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-681-502</td>
			<td style="width:113px;">9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat-seal Sheets</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0559</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow-through Spacer</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">NC9563984</td>
			<td style="width:113px;">6</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 200 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L200F</td>
			<td style="width:113px;">192</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 10 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L10F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Pipette tips - 1,000 &#956;l</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">GP-L1000F</td>
			<td style="width:113px;">16</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">DNA Suspension Buffer</td>
			<td style="width:121px;">Teknova</td>
			<td style="width:99px;">T0220</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">0.1 N NaOH</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AC12419-0010</td>
			<td style="width:113px;">0.5 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Isopropanol (HPLC grade)</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">A451</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Ethanol (200-proof)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">459836</td>
			<td style="width:113px;">330 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Formamide (100%)</td>
			<td style="width:121px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:99px;">C001K38</td>
			<td style="width:113px;">15 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">EDTA (0.5 M)</td>
			<td style="width:121px;">Amresco</td>
			<td style="width:99px;">E177</td>
			<td style="width:113px;">0.2 ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">10 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-10XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">200 &#956;l 8-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L8-200XLS</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">1,000 &#956;l Single-channel Pipette</td>
			<td style="width:121px;">Rainin</td>
			<td style="width:99px;">L-1000XLS</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Microplate Shaker</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">13500-890</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Refrigerated Microplate Centrifuge</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">BK369434</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">SE-901-1001</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex Microsample Incubator</td>
			<td style="width:121px;">SciGene</td>
			<td style="width:99px;">1057-30-0</td>
			<td align="right" style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hybex MIDI Heat Block Insert</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-601</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Heat Sealer</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:99px;">AB-0384</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Hyb Chamber w/ Insert and Mat</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-402</td>
			<td style="width:113px;">2</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Surgical Scissors</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;">13-804-20</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Flow Through Assembly Parts</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-202</td>
			<td style="width:113px;">8</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Wash Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">BD-60-450</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Genepaint Chamber Rack</td>
			<td style="width:121px;">Tecan</td>
			<td style="width:99px;">760-800</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Temperature Probe</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">A1-99-109</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Staining Rack and Dish</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">WG-10-207</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Self-Closing Tweezers</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc</td>
			<td style="width:99px;">5374-NM</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">Vacuum Manifold</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella, Inc&#160;</td>
			<td style="width:99px;">2240</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:145px;">iScan or HiScan</td>
			<td style="width:121px;">Illumina</td>
			<td style="width:99px;">-</td>
			<td style="width:113px;">1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

infinium assay for large-scale snp genotyping applications

variantes de génotypage du génome humain s&#39;est avérée être une méthode efficace pour identifier les associations génétiques des phénotypes. La distribution des variantes au sein des familles ou des populations peut faciliter l&#39;identification des facteurs génétiques de la maladie. Le panneau d&#39;Illumina de BeadChips de génotypage permet aux enquêteurs de génotype des milliers ou des millions de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) ou d&#39;analyser d&#39;autres variantes génomiques, tels que le nombre de copie, à travers un grand nombre d&#39;échantillons d&#39;ADN. Ces SNP peuvent être répartis sur tout le génome ou ciblées dans des régions spécifiques afin de maximiser le potentiel de découverte. L&#39;essai Infinium a été optimisé pour obtenir rapidement de haute qualité, des résultats fiables. Avec une configuration correcte, un seul technicien peut traiter de quelques centaines à plus d&#39;un millier d&#39;échantillons d&#39;ADN par semaine, selon le type de tableau. Ce test guide les utilisateurs à travers chaque étape, en commençant par l&#39;ADN génomique et se terminant avec le balayage de la matrice. Utilisation de bienséance Reagents, ​​les échantillons sont amplifiés, fragmenté, précipité, remis en suspension, hybridé à la puce, prolongée par une base unique, souillé, et scanné soit sur un système d&#39;imagerie optique à haute résolution iScan ou Salut Scan. Une étape d&#39;une nuit est nécessaire pour amplifier l&#39;ADN. L&#39;ADN est dénaturé et isotherme amplifié par amplification du génome entier et, par conséquent, pas de PCR est nécessaire. Les échantillons sont hybridées aux puces à ADN au cours d&#39;une seconde étape d&#39;une nuit. Dès le troisième jour, les échantillons sont prêts à être numérisée et analysée. L&#39;ADN amplifié peut être stocké en grandes quantités, ce qui permet des arrangements de billes à traiter chaque jour de la semaine, en maximisant ainsi le débit.

Une puce de perles bien-traité devrait afficher des intensités de lumière laser rouge et vert lumineux et distincts pendant la numérisation. Dans la figure 6, le logiciel de numérisation iScan affiche un échantillon d&#39;ADN génomique norme hybride avec succès à une coutume panneau tableau SNP de génotypage. Les nucléotides marqués qui ont été attachés pendant la prolongation et de coloration étapes fluorescence sous les lumières des deux lasers. Comme ces nucléotides s&#39;étendent de façon sélective la chaîne oligonucléotidique du bourrelet hybridée au brin de l&#39;ADN fragmenté, et que les chaînes oligonucléotidiques sont conçues pour se terminer au niveau du site de la variante, la couleur et l&#39;intensité du signal résultant peut être utilisé pour déterminer les allèles présents à l&#39; place SNP. Une feuille généré par les utilisateurs échantillon, ce qui correspond ID d&#39;échantillon et les renseignements cliniques à CHIPID et la position, et un SNP manifeste spécifique au réseau, obtenu directement à partir de l&#39;entreprise, sont à la fois nécessaire pour importer le scales fichiers de sortie de nner dans le logiciel d&#39;analyse GenomeStudio. Feuilles exemple d&#39;échantillons peuvent être trouvés sur le site Web de l&#39;entreprise. Une fois le projet GenomeStudio est construit, les génotypes peuvent être obtenus à partir des pôles d&#39;intensité résultant générés automatiquement par le logiciel. Bien que plusieurs options d&#39;affichage existent, la vue par défaut, Norm-R (une valeur d&#39;intensité normalisée) vs Norm-Theta (un ratio de l&#39;intensité allélique), est souvent l&#39;intrigue la plus facile de différencier trois groupes distincts. La plupart des SNP devraient montrer un, deux, ou trois groupes, en fonction de la fréquence de l&#39;allèle mineur. Les trois groupes représentent des échantillons démontrant AA, AB ou BB allèles (voir Figure 7). Ces groupes peuvent être affectés génotypes soit par l&#39;importation d&#39;un modèle de position de regroupement standard directement à partir de l&#39;entreprise, en sélectionnant «Cluster Tous les SNP&quot; de la barre d&#39;outils d&#39;analyse du logiciel, ou en cliquant et en faisant glisser les cercles colorés sur les parcelles d&#39;intensité à l&#39;EDI manuellement<html> t appelle. La couleur de l&#39;échantillon sur le terrain de l&#39;intensité (rouge, violet ou bleu) indique que l&#39;appel (AA, AB ou BB, respectivement); noir indique aucun appel. En faisant défiler les SNP répertoriés dans le volet de données complète du logiciel, le regroupement pour chaque SNP peut être consulté ou rappelé. Une fois que les groupes sont affectés appels satisfaisants, le volet de données complète du logiciel répertorie les génotypes pour chaque échantillon à chaque SNP particulier. L&#39;option Colonne Sélecteur dessus de la table peut basculer formats de données. Les données peuvent être exportées, soit par la barre d&#39;outils d&#39;analyse ou directement à partir de la table de données complet pour une analyse en profondeur. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> Figure 1. Aperçu - Infinium protocole de test.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> Figure 2. Complète Hyb Chambre base et tapis, plus couvercle. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> Figure 3 Chargement d&#39;un BeadChip -.. Déposer l&#39;échantillon sur les ports d&#39;entrée [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir</a><html> l&#39;image. <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> Figure 4 Retrait de la BeadChip Coverseal -.. Saisissez le joint dans le coin et retirez délicatement diagonale [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> Figure 5. Ensemble complet BeadChip accréditives - Le BeadChip est séparée d&#39;une lame de verre avec une entretoise et lié avec des agrafes.&gt; Cliquez ici pour agrandir l&#39;image. <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> Figure 6. Le succès de numérisation BeadChip - A) Le BeadChip est scanné à la fois un laser rouge et vert, les logiciels de numérisation affiche à la fois simultanément. Sections passant intensité QC mettront en lumière verte sur l&#39;écran de BeadChip à gauche. Sections défaut intensité QC mettra en lumière rouge sur l&#39;écran de BeadChip. B) Une fois la numérisation terminée, le logiciel superposer les affichages rouges et verts. Une image zoomée s&#39;affiche. La couleur et l&#39;intensité de chaque bille individuelle indique l&#39;allèle présent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.wimince-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> Figure 7. SNP NORM-R vs-Theta NORM Profils du cluster - A) Un SNP valide avec trois groupes distincts représentant AA, AB, BB et génotypes, de couleur rouge, violet et bleu B) Un SNP nécessitant édition.. Le groupe du milieu, qui doit être homozygote AB, est laissé non appelé. Le groupe BB est appelée à tort AB. C) Un SNP peu performant. Pas de génotypes peuvent être obtenus à partir de cette parcelle d&#39;intensité, comme aucun grappes distinctes existent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image</a> .

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Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Un protocole est décrit qui utilise les tests de Infinium d&#39;Illumina pour effectuer le génotypage à grande échelle. Ces dosages peuvent fiable génotype millions de SNP à travers des centaines d&#39;échantillons d&#39;ADN individuels en trois jours. Une fois généré, ces génotypes peuvent être utilisés pour vérifier les associations avec une variété de différentes maladies ou phénotypes.

Infinium Assay pour Grands génotypage SNP Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

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38.6K vues.  Oklahoma Medical Research Foundation.  Un protocole est décrit qui utilise les tests de Infinium d'Illumina pour effectuer le génotypage à grande échelle. Ces dosages peuvent fiable génotype millions de SNP à travers des centaines d'échantillons d'ADN individuels en trois jours. Une fois généré, ces génotypes peuvent être utilisés pour vérifier les associations avec une variété de différentes maladies ou phénotypes. 

Vidéo: Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grands écrans des banques métagénomiques

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

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Biologie

Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

Pyroséquençage: une méthode simple pour le génotypage précis

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Immunocoloration lots pour la détection de protéines à grande échelle dans le cerveau du singe entier

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

L&#39;isolement et expansion à grande échelle des cellules adultes humaines Colony Forming progénitrices endothéliales

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Écran petites molécules

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Une stratégie pour sensibles à grande échelle quantitatives métabolomique

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODELAY: une méthode à grande échelle pour la quantification multiparamétrique de la croissance de la levure

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

Identification de nouveaux régulateurs de la transpiration végétale par le dépistage thermique à grande échelle à Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Une procédure ChIP-Seq semi-automatisée pour les études épigénétiques à grande échelle

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...